高能電子束輻照對(duì)獼猴桃細(xì)胞壁降解相關(guān)酶活性和基因表達(dá)的影響

李瑞娟，楊淑霞，王 丹，黃天姿，梁 錦，張 璐，羅安偉

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西楊凌 712100）

獼猴桃因其風(fēng)味獨(dú)特，皮薄多汁，富含維生素C、糖、有機(jī)酸、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而深受消費(fèi)者青睞[1]。因獼猴桃屬于典型的呼吸越變型水果，常溫下極易軟化、腐爛。質(zhì)地是評(píng)價(jià)獼猴桃品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，對(duì)獼猴桃采后商業(yè)價(jià)值起決定作用。果實(shí)軟化伴隨著細(xì)胞壁組分降解、過(guò)量乙烯生成、活性氧代謝失衡等一系列復(fù)雜生理生化過(guò)程，其中細(xì)胞壁組分降解是導(dǎo)致果實(shí)軟化的重要因素之一[2]。果膠和纖維素是構(gòu)成果實(shí)細(xì)胞壁的主要多糖物質(zhì)。在果實(shí)貯藏過(guò)程中，細(xì)胞壁降解酶PG、PME、β-Gal和Cx活性及其基因相對(duì)表達(dá)量升高，會(huì)加速果膠和纖維素降解，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致果實(shí)硬度下降[3]。果實(shí)軟化使細(xì)胞內(nèi)汁液流出，更易引起微生物侵染，加速腐爛，使其失去商業(yè)價(jià)值。因此，有必要采取一定措施減緩果實(shí)軟化來(lái)延長(zhǎng)獼猴桃采后貯藏期。

近年來(lái)，人們應(yīng)用各種技術(shù)處理獼猴桃來(lái)保持品質(zhì)和延長(zhǎng)貨架期。HU等[4]發(fā)現(xiàn)漆蠟涂膜通過(guò)抑制果實(shí)PME和PG活性緩解果膠物質(zhì)的降解，延緩了獼猴桃的成熟和軟化。朱婷婷等[5]研究發(fā)現(xiàn)低溫貯藏可抑制獼猴桃乙烯合成和淀粉降解相關(guān)基因表達(dá)，保持果實(shí)硬度，延緩其成熟進(jìn)程；另外，富氫水處理獼猴桃可以緩解果實(shí)果膠水解和PG、PME和Cx活性升高，延緩果實(shí)硬度下降，降低腐爛率[6]。然而，這些保鮮方法存在成本高、化學(xué)成分殘留、商業(yè)化操作不便等問(wèn)題，對(duì)于獼猴桃采后貯藏仍需尋找一種綠色、安全且高效的保鮮技術(shù)。

高能電子束輻照作為一種新型的非熱食品加工技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、處理時(shí)間短、不產(chǎn)生放射性污染、輻照劑量均勻等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。高能電子束輻照技術(shù)應(yīng)用于新鮮水果，不僅可以有效殺滅果實(shí)表面微生物，降低病蟲(chóng)害，還可抑制果實(shí)生理代謝和生化作用，對(duì)保持果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分和延長(zhǎng)貨架期尤為重要[9]。已有研究報(bào)道不同劑量的輻照對(duì)藍(lán)莓[10]、柑橘[11]、櫻桃[12]等水果均起到了良好的保鮮效果。然而，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)于電子束輻照獼猴桃保鮮的研究報(bào)道較少，且主要集中在輻照對(duì)理化品質(zhì)、抗氧化活性和外觀的影響[13-14]，關(guān)于電子束輻照對(duì)獼猴桃軟化及相關(guān)酶基因表達(dá)的影響鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以‘海沃德’獼猴桃為試材，探究不同劑量高能電子束輻照對(duì)獼猴桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中細(xì)胞壁組分、相關(guān)酶活性及基因表達(dá)的影響，探明電子束輻照延緩獼猴桃軟化的機(jī)理，以期為電子束輻照保鮮獼猴桃及其他鮮活果蔬提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘海沃德’獼猴桃 于2020年10月20日采收自陜西省寶雞市岐山縣永紅獼猴桃專業(yè)合作社基地（北緯34.36°，東經(jīng)107.14°），果實(shí)可溶性固形物含量為6.0%～6.5%。挑選成熟度和大小一致、無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷的果實(shí)用于實(shí)驗(yàn)；RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒和SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑盒北京天根生化科技有限公司。

ESS-010-03電子直線型加速器（功率為10 MeV，能量為20 kW） 陜西楊凌核盛輻照公司；TAXT PLUS/50物性測(cè)定儀（探頭直徑為0.5 cm） 英國(guó)Stable Micro systems公司；T-203電子天平 北京科普爾科技發(fā)展有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；N6000雙光束紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；NanoDropOne超微量分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾儀器有限公司；SC46-T100 PCR儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；Q6熒光定量PCR儀 美國(guó)生命技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 輻照處理 根據(jù)黃天姿等[15]的研究，設(shè)定輻照劑量為300、400和500 Gy，以不做輻照（0 Gy）的果實(shí)為對(duì)照組。輻照時(shí)，將獼猴桃單層擺放于不銹鋼托盤(pán)中，通過(guò)傳送帶運(yùn)進(jìn)輻照室進(jìn)行輻照。利用重鉻酸銀劑量計(jì)監(jiān)測(cè)獼猴桃實(shí)際吸收劑量，劑量誤差小于10%。輻照結(jié)束后將各組果實(shí)用帶孔的0.03 mm厚PE袋包裝后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于陰涼處放置24 h散去田間熱后，將其轉(zhuǎn)移至0～1 ℃、RH 90%～95%冷庫(kù)中貯藏。每15 d取一次樣，直到第90 d結(jié)束貯藏。每組每次取20個(gè)獼猴桃，測(cè)定果實(shí)硬度和細(xì)胞壁組分，部分果肉用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中用于酶活性及基因相對(duì)表達(dá)量分析。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.2 樣品制備 可溶性果膠測(cè)定液：稱取3 g獼猴桃果肉，研磨成漿，轉(zhuǎn)入到50 mL離心管中，加入25 mL 95%乙醇，沸水浴加熱30 min。取出后冷卻至室溫，于8000 r/min離心20 min，棄上清液。再加入95%乙醇，沸水浴加熱，重復(fù)3～5次。棄上清，向沉淀物中加入20 mL蒸餾水，在50 ℃水浴中保溫30 min。取出冷卻至室溫，于8000 r/min離心20 min，將上清液移入100 mL容量瓶，用少量蒸餾水洗滌沉淀，離心后將上清并入100 mL容量瓶，用蒸餾水定容，備用。

原果膠測(cè)定液：上述蒸餾水洗滌后的沉淀物，仍保留在原刻度離心管中。向其中加入25 mL 0.5 mol/L硫酸溶液，在沸水中加熱1 h。取出冷卻至室溫后，于8000 r/min離心20 min，將上清液移入100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，備用。

纖維素測(cè)定液：向上述沉淀物中緩慢加入20 mL 60%硫酸，25℃放置30 min使纖維素溶解。取5 mL溶解液，移入100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，備用。

粗酶提取液：稱取獼猴桃果肉3 g，加入5 mL經(jīng)預(yù)冷的95%乙醇，冰浴研磨后倒入離心管，低溫放置10 min，于4 ℃、8000 r/min離心20 min。棄上清液，往沉淀物中加入5 mL預(yù)冷的80%乙醇，低溫放置10 min，相同條件下離心，棄去上清液，向沉淀物中加入5 mL預(yù)冷的磷酸提取緩沖液，于4 ℃放置提取20 min，再離心收集上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 硬度測(cè)定 每組隨機(jī)取5個(gè)果實(shí)，在其赤道部位均勻取3個(gè)點(diǎn)，削去果皮，在TPA模式下測(cè)定，單位為kg/cm2。

1.2.3.2 細(xì)胞壁組分測(cè)定 原果膠和可溶性果膠含量參照曹建康等[16]的咔唑比色法測(cè)定，纖維素含量參照李圓圓[17]的蒽酮硫酸法測(cè)定。具體如下：分別吸取1 mL原果膠、可溶性果膠待測(cè)液，加入到25 mL刻度管中，然后小心地沿著管壁加入6 mL濃硫酸，在沸水中加熱20 min，取出冷卻至室溫后，加入0.2 mL 1.5 g/L咔唑-乙醇溶液，搖勻。在暗處放置30 min后，測(cè)定反應(yīng)液在波長(zhǎng)530 nm吸光度值。重復(fù)三次，含量用%表示。吸取2 mL纖維素待測(cè)液，加入到25 mL刻度管中，加0.5 mL 2%蒽酮試劑和6 mL濃硫酸，震蕩后靜置12 min，測(cè)定反應(yīng)液在620 nm處的波長(zhǎng)。重復(fù)三次，含量用%表示。

1.2.3.3 酶活性測(cè)定 PG、β-Gal和Cx活性測(cè)定參照曹建康等[16]的二硝基水楊酸法；PME活性測(cè)定參照劉耀娜等[18]的溴麝香草酚藍(lán)法。具體如下：

PG活性測(cè)定：取2支25 mL具塞試管，每支試管中都分別加入1 mL 50 mmol/L、pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.5 mL 10 g/L多聚半乳糖醛酸溶液。再往其中一支試管中加入0.5 mL 1.2.2中的粗酶提取液，另一支試管中加入0.5 mL經(jīng)煮沸5 min的酶提取液作為對(duì)照，混勻后置于37 ℃水浴中保溫1 h。保溫后，迅速加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，在沸水中加熱5 min。然后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水稀釋至25 mL，混勻，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度。重復(fù)三次，酶活性用mg/（h·g）表示。

β-Gal活性測(cè)定：取1.2.2中的粗酶提取液0.4 mL，加0.56 mL 0.1 mol/L pH4.0檸檬酸鹽緩沖液和0.4 mL 13 mmol/L 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液，37 ℃保溫15 min，加2 mL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)400 nm處吸光度。重復(fù)三次，酶活性用mg/（h·g）表示。

Cx活性測(cè)定：取2支25 mL刻度試管編號(hào)，分別加入1.5 mL 10 g/L CMC溶液。向一支試管中再加入1.2.2中的0.5 mL粗酶提取液，向另外一支試管中加入0.5 mL經(jīng)煮沸5 min的酶提取液作為對(duì)照，置于37 ℃恒溫水浴保溫1 h。取出后迅速加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5 min。然后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水稀釋至25 mL刻度處，混勻，測(cè)定波長(zhǎng)540 nm處吸光度。重復(fù)三次，酶活性用mg/（h·g）表示。

PME活性測(cè)定：稱取3 g獼猴桃果肉，加5 mL 8.8%預(yù)冷的NaCl冰浴研磨，于4 ℃、8000 r/min離心20 min，收集上清液，用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH7.5后即為粗酶提取液，4 ℃保存?zhèn)溆?。反?yīng)體系包括4 mL 0.5%果膠溶液，0.3 mL 0.01%溴麝香草酚藍(lán)，加500 μL粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，測(cè)定620 nm 處的吸光值。重復(fù)三次，酶活性用mg/（h·g）表示。

1.2.3.4 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR） 以獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中（http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi）各基因全長(zhǎng)序列為模板，采用NCBI的Primer-BLAST在線設(shè)計(jì)引物（由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成），引物序列如表1所示。

表1 定量RT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

RT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL、熒光染料10 μL、正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL、RNase-Free ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；62 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以Actin為參比，通過(guò)熒光定量PCR儀測(cè)定各基因相對(duì)表達(dá)量。采用2－ΔΔCT法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照對(duì)獼猴桃貯藏期果實(shí)硬度的影響

硬度是評(píng)價(jià)果實(shí)軟化最直觀的指標(biāo)。如圖1所示，不同劑量輻照處理的獼猴桃果實(shí)硬度隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，但輻照組果實(shí)硬度總體高于對(duì)照組，說(shuō)明電子束輻照有利于減緩采后獼猴桃貯藏期間果實(shí)硬度下降。貯藏后期（60～90 d），四組果實(shí)硬度下降速率減慢。貯藏90 d，對(duì)照組、300、400和500 Gy輻照組果實(shí)硬度分別降低了86.06%、78.22%、75.12%和78.84%。與其他組相比，400 Gy輻照組果實(shí)硬度保持效果較好，說(shuō)明適宜的電子束輻照劑量能延緩果實(shí)后熟軟化速率。MOSTAFAVI等[19]發(fā)現(xiàn)γ輻照（200～400 Gy）可以保持蘋(píng)果硬度，抑制果實(shí)在貯藏過(guò)程中的軟化；TRUC等[20]研究發(fā)現(xiàn)，電子束輻照芒果可顯著抑制果實(shí)硬度的下降，這與本研究結(jié)論一致。

圖1 電子束輻照對(duì)獼猴桃貯藏期果實(shí)硬度的影響Fig.1 Effect of electron beam irradiation on firmness of kiwifruit during storage

2.2 電子束輻照對(duì)獼猴桃貯藏期原果膠和可溶性果膠含量的影響

果膠參與細(xì)胞壁分子間相互作用，主要存在于中間片層和初生細(xì)胞壁中，在果實(shí)后熟軟化過(guò)程中，原果膠會(huì)被相關(guān)酶水解成可溶性果膠，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞[21]。如圖2A所示，在整個(gè)貯藏期，各組果實(shí)中原果膠含量均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。獼猴桃果實(shí)原果膠含量初始值為0.75%，貯藏的前30 d下降速度最快；貯藏第15～45 d，對(duì)照組果實(shí)原果膠含量明顯顯著低于其他組（P＜0.05），說(shuō)明在此貯藏期內(nèi)電子束輻照對(duì)維持獼猴桃中原果膠含量效果顯著。在輻照組中，500 Gy組果實(shí)原果膠含量在貯藏第45 d和90 d時(shí)高于其他兩組，各組果實(shí)原果膠含量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。表2相關(guān)性分析結(jié)果顯示，對(duì)照組果實(shí)硬度和原果膠含量呈顯著正相關(guān)（r=0.865*），而300、400和500 Gy輻照組中二者呈極顯著正相關(guān)（r=0.911**、r=0.902**、r=0.910**）。

圖2 電子束輻照對(duì)獼猴桃貯藏期原果膠（A）和可溶性果膠（B）含量的影響Fig.2 Effect of electron beam irradiation on protopectin （A）and soluble pectin （B） content of kiwifruit during storage

如圖2B所示，各組獼猴桃可溶性果膠含量在貯藏期內(nèi)均呈升高趨勢(shì)。貯藏第0 d，可溶性果膠含量為0.17%，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，各組果實(shí)可溶性果膠含量逐漸升高且均在第90 d時(shí)達(dá)到峰值，從高到低依次是對(duì)照組（0.48%）、500（0.45%）、300（0.43%）和400 Gy（0.41%）輻照組。其中，前15 d，各組之間不存在顯著性差異（P＞0.05）；30 d時(shí)，400 Gy輻照組可溶性果膠含量顯著低于其他三組（P＜0.05）；45 d時(shí)，四組含量差異顯著（P＜0.05）。在貯藏中后期（45～90 d），對(duì)照組果實(shí)可溶性果膠含量顯著高于輻照組（P＜0.05），說(shuō)明電子束輻照對(duì)獼猴桃原果膠分解為可溶性果膠起到了一定的抑制作用，使可溶性果膠含量降低。表2相關(guān)性分析表明，對(duì)照組、300、400、500 Gy組果實(shí)硬度和可溶性果膠含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.958**、r=-0.963**、r=-0.976**、r=-0.975**）。PRAKASH等[22]用劑量為0.5、1.24和3.70 kGy的γ射線輻照番茄，發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)和輻照劑量增加，果實(shí)可溶性果膠含量有所降低；WANG等[23]報(bào)道，2.5 kGy的γ射線輻照的藍(lán)莓果實(shí)在貯藏期內(nèi)原果膠含量保持較高水平，可溶性果膠含量增加緩慢。上述結(jié)果表明，輻照可以通過(guò)調(diào)節(jié)果膠在果實(shí)細(xì)胞壁中的溶解來(lái)保持細(xì)胞壁的完整性，從而減少果實(shí)在貯藏過(guò)程中的軟化。

2.3 電子束輻照對(duì)獼猴桃貯藏期間纖維素含量的影響

纖維素是構(gòu)成果實(shí)細(xì)胞壁的另一重要部分，其分解會(huì)促進(jìn)果實(shí)變軟。如圖3所示，獼猴桃纖維素含量隨著貯藏時(shí)間增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，這與在梨[24]和荔枝[25]中變化類似。貯藏期間，輻照組果實(shí)纖維素含量始終高于對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）。各組果實(shí)纖維素含量均在貯藏第90 d時(shí)降到最低，從高到低依次是400 Gy＞500 Gy＞300 Gy＞對(duì)照組，與獼猴桃初始纖維素含量（5.94%）相比分別下降了3.23%、3.31%、3.49%和4.07%。在輻照組中，400 Gy組果實(shí)纖維素含量在整個(gè)貯藏期始終保持在最高水平。結(jié)果表明適宜劑量的電子束輻照能夠維持貯藏期間獼猴桃果實(shí)的纖維素含量，更好的保持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性。表2相關(guān)性分析結(jié)果顯示，對(duì)照組、300、400、500 Gy組果實(shí)硬度和纖維素含量呈極顯著正相關(guān)（r=0.931**、r=0.925**、r=0.970**、r=0.972**）。

圖3 電子束輻照對(duì)獼猴桃貯藏期纖維素含量的影響Fig.3 Effect of electron beam irradiation on cellulose content of kiwifruit during storage

2.4 電子束輻照對(duì)獼猴桃貯藏期間細(xì)胞壁降解酶活性的影響

PG作為主要的細(xì)胞壁降解酶之一，能作用于酯化的高半乳糖醛酸，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞而使果實(shí)軟化。PME使果膠去甲酯化，催化生成高半乳糖醛酸，為PG提供反應(yīng)底物[26]。如圖4A所示，采后獼猴桃果實(shí)PG活性總體呈上升趨勢(shì)。第0 d時(shí)，各組PG活性最低，值為1.46 mg/（h·g）。0～15 d，四組果實(shí)PG活性快速上升，15～30 d緩慢下降，30～90 d先快速上升后變?yōu)榫徛仙?。貯藏0～90 d期間，輻照組獼猴桃PG活性始終低于對(duì)照組，從高到低排序?yàn)閷?duì)照組＞300 Gy＞500 Gy＞400 Gy。各組獼猴桃PG活性均在貯藏第90 d時(shí)達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組（9.43 mg/（h·g））、300 Gy（8.93 mg/（h·g））、500 Gy（8.71 mg/（h·g））、400 Gy（7.64 mg/（h·g））。研究發(fā)現(xiàn)適宜劑量的電子束輻照能使PG活性維持在較低水平，尤其是在貯藏中后期，抑制效果更顯著，這可能是由于電子束輻照使酶分子構(gòu)象發(fā)生了變化，降低酶活性，從而可緩解原果膠的水解。由表2可知，各組獼猴桃PG活性與原果膠含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與果實(shí)硬度、纖維素含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；400 Gy組與可溶性果膠含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），其他三組與可溶性果膠含量極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說(shuō)明PG對(duì)促進(jìn)果實(shí)軟化發(fā)揮了重要作用。

圖4 電子束輻照對(duì)獼猴桃貯藏期PG （A）、PME （B）、β-Gal（C）和Cx （D）活性的影響Fig.4 Effect of electron beam irradiation on PG （A）,PME（B）,β-Gal （C） and Cx （D） activities of kiwifruit during storage

表2 果實(shí)硬度、細(xì)胞壁組分、酶活性及其基因表達(dá)之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of fruit firmness, cell wall components, enzyme activities and gene expressions

如圖4B所示，采后獼猴桃果實(shí)PME活性隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈不斷上升趨勢(shì)。貯藏0～15 d，400 Gy組果實(shí)PME活性顯著低于其他三組（P＜0.05）；從第30 d開(kāi)始至貯藏結(jié)束，輻照組獼猴桃PME活性始終低于對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）；而在輻照組果實(shí)中，PME活性從高到低依次是300 Gy＞500 Gy＞400 Gy，表明電子束輻照一定程度上可抑制PME活性的上升，減少了PG作用底物，從而保持細(xì)胞壁組分不被解聚。表2結(jié)果顯示，各組獼猴桃PME活性與果實(shí)硬度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與原果膠含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；對(duì)照組、400、500 Gy果實(shí)PME活性與可溶性果膠含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而300 Gy組二者呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；對(duì)照組、300、500 Gy果實(shí)PME活性與纖維含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），而400 Gy組二者呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Martins等[27]研究表明，經(jīng)1030 Gy的γ射線處理后的桃果實(shí)，PG和PME活性在其貯藏期間不受輻照的影響，說(shuō)明不適宜劑量的輻照對(duì)延緩果實(shí)軟化作用沒(méi)有積極影響。陳召亮等[28]發(fā)現(xiàn)用2 kGy以上劑量的電子束輻照處理草莓，顯著降低了PG、PME和Cx活性，延緩細(xì)胞壁的降解，這一結(jié)果與本文一致。

β-Gal可以去除細(xì)胞壁多糖側(cè)鏈中的半乳糖殘基，促進(jìn)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的解體。如圖4C所示，四組果實(shí)β-Gal活性在貯藏0～90 d內(nèi)不斷上升，至90 d時(shí)達(dá)到峰值，對(duì)照組、300、400和500 Gy組分別為9.23、8.81、8.02和8.39 mg/h·g。在整個(gè)貯藏期，輻照組果實(shí)β-Gal活性始終低于對(duì)照組，其中，貯藏15～75 d內(nèi)，400和500 Gy組獼猴桃β-Gal活性顯著低于對(duì)照組和300 Gy組（P＜0.05）。在輻照組中，400 Gy組獼猴桃中β-Gal活性在整個(gè)貯藏過(guò)程保持最低水平，說(shuō)明適宜劑量電子束輻照能夠顯著鈍化β-Gal活性，減緩獼猴桃果實(shí)采后貯藏時(shí)的質(zhì)地軟化。相關(guān)性分析表明，各組獼猴桃β-Gal活性與果實(shí)硬度、原果膠含量和纖維素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與可溶性果膠含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）（表2），表明β-Gal活性增強(qiáng)與果實(shí)質(zhì)地變軟密切相關(guān)。

Cx通過(guò)將纖維素和半纖維素水解成葡萄糖分子來(lái)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。如圖4D所示，獼猴桃果實(shí)Cx活性整體上呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明在貯藏過(guò)程中果實(shí)纖維素含量會(huì)不同程度降低。前15 d內(nèi)，400 Gy組Cx活性顯著低于其他組（P＜0.05）；貯藏第30～60 d，400和500 Gy組Cx活性顯著低于對(duì)照組和300 Gy組（P＜0.05），組間差異不顯著（P＞0.05）；之后，各組Cx活性均明顯升高，至貯藏結(jié)束，對(duì)照組Cx活性達(dá)到最高，值為8.87 mg/h·g，分別是300、400和500 Gy組的1.23、1.47倍和1.32倍，組間差異顯著（P＜0.05）。電子束作為一種非熱加工方式，并不能使果實(shí)溫度達(dá)到酶的失活的溫度，而是通過(guò)電子槍發(fā)出的高能電子束直接破壞酶的空間結(jié)構(gòu)致其失活。由表2可知，對(duì)照組獼猴桃Cx活性與果實(shí)硬度、原果膠、可溶性果膠、纖維素含量呈顯著相關(guān)（P＜0.05），而在300 Gy輻照組果實(shí)中相關(guān)性不顯著；400 Gy輻照組中Cx活性與果實(shí)硬度、原果膠、可溶性果膠含量呈顯著相關(guān)（P＜0.05），與纖維素含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）。相比對(duì)照組，電子束輻照能使獼猴桃果實(shí)Cx活性在貯藏期間保持較低水平，有效抑制纖維素被降解，維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。這與陸仙英等[29]以3和6 kJ/m2的短波紫外線（UV-C）照射香梨時(shí)Cx活性顯著低于對(duì)照組的結(jié)果相類似。

果實(shí)軟化主要是由細(xì)胞壁降解相關(guān)酶對(duì)細(xì)胞壁的水解引起的，因此采后果實(shí)酶活性的控制對(duì)于延長(zhǎng)貨架期至關(guān)重要。SINGH等[30]研究了腐胺（PUT）在1、2和3 mmol/L條件下對(duì)梨果采后浸泡處理的影響，結(jié)果表明2和3 mmol/L的PUT能夠抑制PME和Cx的活性，保持梨果實(shí)品質(zhì)。TANG等[31]以紅棗為原料，用褪黑素處理后發(fā)現(xiàn)抑制了果實(shí)PG、PME、β-Gal和Cx活性以及可溶性果膠的產(chǎn)生，并保持原果膠含量，從而延緩果實(shí)衰老。GE等[32]在探究磷酸三鈉（0.5 g/L）處理對(duì)棗果軟化的影響時(shí)也有相同的結(jié)果。上述結(jié)果表明，不同的處理方式均不同程度抑制了細(xì)胞壁降解酶活性的升高，減緩了果實(shí)果膠和纖維素的降解，延緩了獼猴桃后熟軟化進(jìn)程。

2.5 電子束輻照對(duì)獼猴桃貯藏期間細(xì)胞壁降解酶基因表達(dá)的影響

如圖5A所示，在冷藏過(guò)程中，PG表達(dá)量在對(duì)照果和輻照果中均有所增加，輻照組獼猴桃PG表達(dá)量始終低于對(duì)照組。其中，貯藏0～15 d，輻照組果實(shí)PG表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，但各輻照組之間差異不顯著（P＞0.05）；從第30 d開(kāi)始至貯藏結(jié)束，四組果實(shí)PG表達(dá)量差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明采后電子束輻照對(duì)獼猴桃冷藏期間PG調(diào)控明顯，基本維持在較低水平，特別是400 Gy電子束輻照對(duì)于抑制PG表達(dá)量的增加效果最明顯。表2相關(guān)性分析顯示，對(duì)照組中PG表達(dá)量與果實(shí)硬度、原果膠、可溶性果膠、纖維素含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），在500 Gy組中呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；300和400 Gy組中，PG表達(dá)量與果實(shí)硬度、可溶性果膠、纖維素含量呈顯著相關(guān)（P＜0.05），而與原果膠含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.05）。

如圖5B所示，隨著獼猴桃采后貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，PME基因表達(dá)量不斷提高。貯藏前期（0～30 d），對(duì)照組和300 Gy組PME表達(dá)量均呈先升高后降低趨勢(shì)，而400和500 Gy組開(kāi)始緩慢降低，組間差異顯著（P＜0.05）。貯藏中后期（30～90 d），四組果實(shí)PME表達(dá)量隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加?？傮w而言，各組獼猴桃PME表達(dá)水平從高到低依次是對(duì)照組＞300 Gy＞500 Gy＞400 Gy，即輻照組在整個(gè)貯藏期均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），且輻照組間也存在顯著差異（P＜0.05）。表2顯示，對(duì)照組中PME表達(dá)量與原果膠、纖維素含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與果實(shí)硬度、可溶性果膠相關(guān)性不顯著；而輻照組中五個(gè)指標(biāo)相關(guān)性都不顯著。可見(jiàn)，與對(duì)照相比，不同劑量的電子束輻照對(duì)獼猴桃PME基因相對(duì)表達(dá)量抑制效果明顯。WANG等[33]的研究結(jié)果表明，殼聚糖涂膜處理對(duì)草莓果實(shí)冷藏過(guò)程中延緩軟化效果明顯，主要?dú)w因于PG和PME活性以及PG1和PME1轉(zhuǎn)錄水平受到抑制。POMBO等[34]研究報(bào)道紫外-碳輻射對(duì)草莓果實(shí)軟化的影響可能與處理后細(xì)胞壁降解相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的減少有關(guān)。上述結(jié)果表明，不同的保鮮方式均有效抑制了果實(shí)采后貯藏過(guò)程中PG和PME基因的表達(dá)，進(jìn)而減緩軟化速率。

圖5 電子束輻照對(duì)獼猴桃貯藏期PG （A）、PME （B）、β-Gal（C） 和Cx （D）基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of electron beam irradiation on PG （A）, PME（B）, β-Gal （C） and Cx （D） gene expressions of kiwifruit during storage

如圖5C所示，整個(gè)貯藏期，獼猴桃果實(shí)β-Gal相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，到貯藏第30 d，輻照組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；之后，400 Gy組顯著低于其他組（P＜0.05）；貯藏第90 d時(shí)，對(duì)照組、300、400和500 Gy組β-Gal相對(duì)表達(dá)量分別增加了1.67、1.81、1.13和1.32，可知400 Gy組β-Gal基因表達(dá)量較其他組β-Gal表達(dá)量上升更緩慢，說(shuō)明電子束輻照劑量為400 Gy時(shí)能有效抑制β-Gal基因的表達(dá)。表2表明，對(duì)照組β-Gal相對(duì)表達(dá)量與硬度、可溶性果膠含量呈顯著相關(guān)（P＜0.05），與原果膠、纖維素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；在300、400和500 Gy組中，β-Gal與硬度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表2）。

如圖5D所示，在整個(gè)貯藏期，獼猴桃果實(shí)Cx基因表達(dá)水平呈先上升后降低趨勢(shì)。其中，對(duì)照組和300 Gy組Cx基因在第30 d時(shí)達(dá)到最高表達(dá)量，分別為1.67和1.42，而400和500 Gy組在第45 d時(shí)達(dá)到峰值，分別為1.51和2.00。從60 d開(kāi)始到貯藏結(jié)束，對(duì)照組Cx基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于輻照組（P＜0.05），與原果膠含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.870*）（表2）。貯藏期間，500 Gy組果實(shí)Cx基因表達(dá)量與300和400 Gy組差異顯著（P＜0.05）。同時(shí)，劑量為400和500 Gy的電子束輻照延遲了獼猴桃果實(shí)Cx基因表達(dá)高峰的出現(xiàn)，且在貯藏大多數(shù)時(shí)期輻照組低于對(duì)照組，表明適宜劑量電子束輻照可以通過(guò)抑制獼猴桃Cx基因的表達(dá)來(lái)降低果實(shí)的軟化速率。WANG等[35]研究顯示MeJA處理的藍(lán)莓果實(shí)表現(xiàn)出更高含量原果膠和纖維素，及更低水平的可溶性果膠。此外，MeJA處理顯著抑制果實(shí)PG、PME、β-Gal和Cx活性和轉(zhuǎn)錄水平，保持果實(shí)硬度。SHI等[36]發(fā)現(xiàn)殼聚糖-水楊酸聯(lián)合處理對(duì)保持葡萄柚果實(shí)硬度的作用可能歸因于其抑制PG、PME、Cx和β-Gal活性及其基因表達(dá)的能力。以上結(jié)果表明，電子束輻照、MeJA處理和殼聚糖-水楊酸聯(lián)合處理可以通過(guò)抑制細(xì)胞壁降解酶活性及其基因表達(dá)水平來(lái)調(diào)節(jié)果實(shí)細(xì)胞壁多糖降解過(guò)程，從而減緩貯藏期間果實(shí)硬度下降。

3 結(jié)論

果實(shí)細(xì)胞壁組分降解引起獼猴桃軟化，細(xì)胞壁降解酶是加速果實(shí)后熟軟化的重要原因。研究結(jié)果表明，高能電子束輻照有效延緩了‘海沃德’獼猴桃原果膠和纖維素含量的下降及可溶性果膠含量的上升，降低了PG、PME、β-Gal和Cx活性。同時(shí)，電子束輻照通過(guò)抑制PG、PME、β-Gal和Cx基因的表達(dá)水平，維持果實(shí)硬度，延長(zhǎng)獼猴桃采后貯藏期。相比于300和500 Gy，400 Gy劑量的電子束輻照對(duì)獼猴桃細(xì)胞壁水解酶活性及其基因相對(duì)表達(dá)量具有更顯著的調(diào)控作用，從而抑制了獼猴桃果實(shí)原果膠和纖維素的降解，保持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，延遲了果實(shí)軟化進(jìn)程。