響應面優(yōu)化冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽制備工藝及其組成分析

高云龍，徐夢豪，趙祥忠,

（1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)食品科學與工程學院, 山東濟南 250353；2.山東中碩海洋科技有限公司, 山東日照 276800）

冰島刺參（Cucumaria frondosa）屬棘皮動物門（Echinodermata）海參綱（Holothuroidea）枝手目（Dendrochirotida）瓜參科（Cucumariidae）海洋動物[1]，主要分布在冰島、挪威及俄羅斯等國家附近海域[2]，其富含蛋白質(zhì)、多糖、三萜糖苷、脂類等活性物質(zhì)，具有抗癌、抗炎、降血糖、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等多種功能活性[3-4]。冰島刺參內(nèi)臟團是冰島刺參初級加工過程中的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)、氨基酸含量豐富，是優(yōu)質(zhì)的動物蛋白資源[5-6]，但由于缺乏深層次的研究和利用，冰島刺參內(nèi)臟團多被當作廢棄物丟棄或售賣給飼料加工企業(yè)，不僅無法有效提高冰島刺參的附加值，而且造成資源的嚴重浪費。

生物活性肽是一類對人體生命活動有益或具有生理作用的肽類化合物[7]。相較于蛋白質(zhì)，生物活性肽不僅易于消化吸收，還具有抗氧化、抗菌、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功效[8-11]，已然成為近年來的研究熱點。目前，關(guān)于以海洋生物制備抗氧化肽的研究較為廣泛，制備方法主要有酶解法、微生物發(fā)酵法、化學合成法等，其中酶解法因其特異性強，工藝較為成熟而備受關(guān)注，如李娜等[12]利用酶解法制備鱈魚魚鰾抗氧化肽，其具有良好的羥基自由基清除能力和亞鐵離子螯合能力，顯示出較強的抗氧化活性；李亞會等[13]通過動物蛋白酶和風味蛋白酶聯(lián)合水解遠東擬沙丁魚制備抗氧化肽，分離純化得到氨基酸序列為Arg-Phe-Asp和Phe-Ala-His-Asp-Asp-Pro的兩個多肽組分，其ABTS自由基清除率分別為81.22%±4.12%和76.35%±3.32%；SIERRA等[14]酶解紅羅非魚鱗片并研究其抗氧化活性，結(jié)果表明，分子量3～10 kDa的組分具有最強的抗氧化活性。但以冰島刺參內(nèi)臟團為原料，制備抗氧化肽的研究則鮮見報道，因此，利用冰島刺參內(nèi)臟團制備生物活性肽，不僅可以為資源的不合理利用提供解決方案，還能為冰島刺參加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供新的方向。

本研究以冰島刺參內(nèi)臟團為原料，以DPPH自由基清除率為評價指標，采用復合蛋白酶酶解制備冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽，通過單因素實驗和響應面法優(yōu)化冰島刺參內(nèi)臟團蛋白的酶解條件，并分析其抗氧化活性、分子質(zhì)量分布和氨基酸組成，旨在為利用冰島刺參內(nèi)臟團生產(chǎn)抗氧化肽提供理論依據(jù)，并進一步促進冰島刺參深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰島刺參內(nèi)臟團（含性腺、呼吸道、腸道等） 山東中碩海洋科技有限公司；復合蛋白酶（經(jīng)預實驗由胰蛋白酶、中性蛋白酶以及氨肽酶按50:49.9:0.1復配而成，1.2×105U/g） 北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫（H2O2）、三氯乙酸（TCA）、硫酸亞鐵（FeSO4·7 H2O）、氯化亞鐵（FeCl2）、鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、氯化鐵（FeCl3）、L-色氨酸、對二氨基苯甲醛 國藥集團化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，10-菲啰啉、菲啰嗪 美國Sigma公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

FA1004型電子天平 上海上平儀器有限公司；HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國宇儀器制造有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-9000型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SCIENTZ-18N型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；L-8900型高速氨基酸分析儀 日本日立有限公司；e2695型高效液相色譜儀 美國waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冰島刺參內(nèi)臟團基本成分的測定 水分按照國標GB5009.3—2016直接干燥法測定；粗蛋白按照國標GB5009.5—2016凱氏定氮法測定；脂肪按照國標GB5009.6—2016索氏抽提法測定；灰分按照國標GB5009.4—2016第一法測定；多糖含量參照羅春萍等[15]描述的苯酚-硫酸法測定。

1.2.2 冰島刺參內(nèi)臟團蛋白提取 參照李云嵌等[16]的方法并略作修改。冰島刺參內(nèi)臟團冷凍干燥后，通過亞臨界法脫除油脂，然后按料液比1:40 g/mL加入蒸餾水，調(diào)pH至10.0（1.0 mol/L的 NaOH溶液調(diào)節(jié)），設置超聲功率50 W，溫度50 ℃，超聲提取30 min；冷卻至室溫，4 ℃，5000 r/min條件下離心10 min，取上清液調(diào)pH至3.0（1.0 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)），在同樣條件下離心，沉淀水洗3次，加水復溶后調(diào)pH至中性（1.0 mol/L的 NaOH溶液調(diào)節(jié)），離心取上清液，在冷阱溫度-55 ℃，真空度1 Pa的條件下，冷凍干燥24 h得到冰島刺參內(nèi)臟團蛋白粉。

1.2.3 冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽的制備 參照包斐等[17]的方法并略作修改。取適量冰島刺參內(nèi)臟團蛋白溶于蒸餾水中，配制成一定濃度的蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)酶反應條件，加入適量復合蛋白酶充分振蕩后，置于恒溫水浴鍋中酶解，反應過程中維持相應pH條件，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶10 min，冷卻，4000 r/min離心10 min，收集上清液，即為冰島刺參內(nèi)臟團酶解產(chǎn)物，在冷阱溫度-55 ℃，真空度1 Pa條件下，冷凍干燥24 h得到冰島刺參內(nèi)臟團肽粉。

1.2.4 單因素實驗 固定酶解條件：底物質(zhì)量分數(shù)1%、加酶量3000 U/g、pH7.0、酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h；分別對底物質(zhì)量分數(shù)（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、加酶量（1000、2000、3000、4000、5000、6000 U/g）、pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、酶解溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、酶解時間（1、2、3、4、5、6 h）5個因素進行單因素實驗，以DPPH自由基清除率為評價指標，研究各因素對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.5 響應面試驗設計 在單因素實驗基礎上，固定酶解pH7.0，以A（底物質(zhì)量分數(shù)）、B（加酶量）、C（酶解溫度）、D（酶解時間）為自變量，DPPH自由基清除率為響應值進行優(yōu)化，試驗因素與水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素與水平編碼Table 1 Factors and level coding of response surface experiment

1.2.6 測定指標

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測定 參照ZHUANG等[18]的方法略作修改。將DPPH用95%乙醇配制成0.1 mmol/L的溶液，取2 mL濃度為2 mg/mL的樣品溶液，加入2 mL DPPH溶液，暗處反應30 min，在517 nm處測定吸光值（A1）；空白組用蒸餾水代替樣品（A0）；對照組用95%乙醇代替DPPH溶液（A2），每組測定重復3次。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中，A1為樣品組吸光值；A2為對照組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.2.6.2 ABTS自由基清除率的測定 參照SARABABDI等[19]的方法略作修改。向燒杯中加入200 mL濃度為7 mmol/L的ABTS溶液和3.52 mL濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀，超聲5 min混勻，避光反應12～16 h，之后用0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）稀釋使其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02，即為ABTS溶液，室溫靜置30 min即可使用。取0.15 mL濃度為0.5 mg/mL的樣品溶液與2.85 mL ABTS溶液混合均勻，避光反應10 min，在734 nm處測定樣品的吸光值A1?？瞻捉M用0.15 mL蒸餾水代替樣品測定吸光值A0，每組測定重復3次。ABTS自由基清除率計算公式如下：

式中，A1為樣品組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.2.6.3 羥基自由基清除率的測定 參照李斌等[20]的方法略作修改。依次取1 mL 0.75 mmol/L的1，10-菲啰啉、2 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）、1 mL 0.75 mmol/L 的FeSO4·7H2O和1 mL濃度為1.5 mg/mL的樣品溶液混勻，最后加入1 mL 0.01%（v/v）H2O2溶液，37 ℃水浴反應1 h，在536 nm處測定溶液的吸光值A1；空白組用1 mL蒸餾水代替樣品測定吸光值A2；對照組用2 mL蒸餾水代替樣品和H2O2測定吸光值A3，每組測定重復3次。羥基自由基清除率計算公式如下：

式中，A1為樣品組吸光值；A2為空白組吸光值；A3為對照組吸光值。

1.2.6.4 Fe2+鰲合能力的測定 參照ZHENG等[21]的方法略作修改。取1 mL濃度為0.5 mg/mL的樣品溶液與2 mL 0.05 mmol/L的 FeCl2溶液及2 mL 0.05 mmol/L的菲啰嗪溶液混勻，室溫反應15 min，在562 nm處測定吸光值A1。空白組用1 mL蒸餾水代替樣品測定吸光值A0，每組測定重復3次。Fe2+鰲合率計算公式如下：

式中，A1為樣品組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.2.6.5 還原力的測定 參照YOU等[22]的方法略作修改。取1 mL濃度為1.5 mg/mL的樣品溶液與2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH6.6）及2.5 mL 1%的 K3[Fe（CN）6]溶液，50 ℃水浴反應20 min，迅速冷卻，并加入2.5 mL 10%的TCA溶液，3000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL，加入2.5 mL的蒸餾水及0.5 mL 0.1% 的FeCl3溶液，混勻，室溫反應10 min，在700 nm處測定吸光值，用蒸餾水調(diào)零，重復測定3次。

1.2.6.6 分子量分布的測定 根據(jù)林棟等[23]的方法略作修改。配制濃度為10 mg/mL的樣品溶液，采用Waters高效液相色譜儀（配2489紫外檢測器），對樣品溶液的分子量分布進行測定。色譜條件為：色譜柱：TSKgelG2000SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水-三氟乙酸45∶55∶0.1（v/v/v）；檢測波長：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量10 μL。

1.2.6.7 氨基酸組成的測定 參照王穎穎等[24]的方法略作修改。稱取0.05 g樣品于水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl混勻，連續(xù)吹入氮氣后封口，在110 ℃下酸水解22～24 h。水解結(jié)束后過濾并用超純水定容至50 mL，取適量濾液用0.02 mol/L HCl稀釋5倍，最后通過0.22 μm微濾膜過濾上樣，使用全自動氨基酸分析儀測定除色氨酸以外的氨基酸。

色氨酸的測定參照何峰等[25]的方法略作修改。標準曲線的繪制：準確稱取10 mg L-色氨酸，加入0.1 mL 10% NaOH和少量水溶解并定容至100 mL。取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL色氨酸溶液并分別用蒸餾水定容至1 mL，加1 mL 6 mol/L的NaOH和5 mL 1%對二氨基苯甲醛（用9 mol/L硫酸溶解），搖勻，避光反應1 h，加入0.05 mL 0.2% NaNO2溶液，搖勻，室溫放置30 min備用，以空白調(diào)零，在595 nm處測定各溶液的吸光值，得標準曲線方程為y=7.9317x+0.0195，R2=0.9981。

樣品測定：取適量樣品置于25 mL水解管中，加5 mL 6 mol/L NaOH溶液，110 ℃水解24 h，過濾水解液，調(diào)節(jié)pH6.0～8.0，并定容至100 mL。取2 mL上清液放入具塞試管中，加入5 mL 1%對二氨基苯甲醛溶液，搖勻。另取2 mL上清液加入5 mL 9 mol/L H2SO4作樣品空白，搖勻，避光反應1 h。向每支試管加入0.05 mL 0.2% NaNO2溶液，搖勻，室溫放置30 min。以樣品空白調(diào)零，在595 nm處測定樣品溶液的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 21軟件對單因素實驗結(jié)果進行顯著性差異分析；采用Design- Expert 11軟件進行響應面試驗設計及優(yōu)化分析；所有實驗均重復3次，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分分析

鮮活冰島刺參內(nèi)臟團水分達到87.04%±0.21%，其他主要成分粗蛋白、多糖、脂肪、灰分分別占干重的比例如表2所示。

表2 冰島刺參內(nèi)臟團基本成分表Table 2 Basic composition of Cucumaria frondosa visceral mass

2.2 單因素實驗

2.2.1 底物質(zhì)量分數(shù)對DPPH自由基清除率的影響由圖1可知，當?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)從1%增加到4%時，DPPH自由基清除率顯著上升（P＜0.05），隨著底物質(zhì)量分數(shù)的增加，酶與底物結(jié)合的機會增大，從而提高酶解速率，小分子抗氧化活性肽含量增加，抗氧化活性顯著增強；當?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)為4%時，DPPH自由基清除率達到最大值88.67%；繼續(xù)增加底物質(zhì)量分數(shù)，DPPH自由基清除率顯著下降（P＜0.05），這可能是由于底物質(zhì)量分數(shù)較高時，蛋白吸水溶脹導致流動性變差，與蛋白酶接觸不完全，酶解速率降低，抗氧化活性減弱。

圖1 底物質(zhì)量分數(shù)對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 The effect of substrate mass fraction on the scavenging rate of DPPH free radicals

2.2.2 加酶量對DPPH自由基清除率的影響 由圖2可知，當加酶量在1000～5000 U/g之間逐漸增加時，DPPH自由基清除率顯著上升（P＜0.05）；當加酶量為5000 U/g時，DPPH自由基清除率達到最大值83.21%；繼續(xù)提高加酶量，DPPH自由基清除率顯著下降（P＜0.05）。在底物質(zhì)量分數(shù)一定時，加酶量從1000 U/g增加到5000 U/g，酶與底物接觸完全，蛋白酶解充分，抗氧化肽含量增加，抗氧化活性增強；酶量過多，酶與底物結(jié)合位點達到過飽和，進而酶解已生成的抗氧化肽，抗氧化活性減弱。

圖2 加酶量對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 The effect of the amount of enzyme added on the scavenging rate of DPPH free radicals

2.2.3 pH對DPPH自由基清除率的影響 由圖3可知，當pH處于5.5～7.0范圍內(nèi)時，DPPH自由基清除率隨pH增加而增大；當pH為7.0時，DPPH自由基清除率達到最大值68.35%；當pH超過7.0時，DPPH自由基清除率逐漸減小。蛋白酶在適宜pH范圍內(nèi)才可以發(fā)揮較佳的酶解效果，偏酸或偏堿會使酶活力減弱甚至失活，導致酶解速率降低，抗氧化活性減弱。

圖3 pH對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 The effect of pH on the scavenging rate of DPPH free radicals

2.2.4 酶解溫度對DPPH自由基清除率的影響 由圖4可知，當酶解溫度在35～55 ℃之間逐漸增加時，DPPH自由基清除率顯著上升（P＜0.05）；當酶解溫度為55 ℃時，DPPH自由基清除率達到最大值84.86%；繼續(xù)提高溫度，DPPH自由基清除率顯著下降（P＜0.05）。溫度較低時，酶解速率較低，酶解反應不徹底，抗氧化活性較弱；隨著溫度的增加，有助于蛋白酶達到最適酶解溫度，從而使酶解反應加快，抗氧化活性增加；而溫度較高時，則會抑制蛋白酶的活性，導致酶解效果變差，無法使蛋白完全水解成具有抗氧化活性的小分子肽，抗氧化活性減弱。

圖4 酶解溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 The effect of enzymolysis temperature on the scavenging rate of DPPH free radicals

2.2.5 酶解時間對DPPH自由基清除率的影響 由圖5可知，當酶解時間從1 h增加到4 h時，DPPH自由基清除率顯著上升（P＜0.05），在酶解反應初期酶與底物充足，酶解速率較快，蛋白大分子逐漸水解成具有抗氧化活性的小分子肽，抗氧化活性增強；當酶解時間為4 h時，DPPH自由基清除率達到最大值78.25%；繼續(xù)增加酶解時間，DPPH自由基清除率顯著下降（P＜0.05），酶解時間過長，底物不再充足，從而過度水解已生成的抗氧化肽，生成抗氧化活性較低甚至不具備抗氧化活性的短肽或游離氨基酸，抗氧化活性減弱。

圖5 酶解時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 The effect of enzymolysis time on the scavenging rate of DPPH free radicals

2.3 響應面試驗結(jié)果分析

2.3.1 響應面試驗設計及結(jié)果 在單因素實驗基礎上，以A（底物質(zhì)量分數(shù)）、B（加酶量）、C（酶解溫度）、D（酶解時間）為自變量，Y（DPPH自由基清除率）為響應值，按照中心組合設計響應面試驗，試驗方案與結(jié)果見表3。

表3 響應面試驗設計與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析 利用Design-Expert 11軟件對表3結(jié)果進行回歸分析，得到二次多項回歸方程：

由表4可知，模型P＜0.0001，表示該模型差異極顯著；失擬項P=0.4261＞0.05，不顯著，說明模型擬合程度好，所選模型適宜；模型決定系數(shù)R2=0.9863，校正系數(shù)R2Adj=0.9726，說明試驗結(jié)果與模型預測結(jié)果一致性良好，模型可靠，誤差較小，可用于冰島刺參內(nèi)臟團酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的分析和預測。由F值可知，各因素對冰島刺參內(nèi)臟團酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率影響的主次順序為A（底物質(zhì)量分數(shù)）＞ C（酶解溫度）＞ B（加酶量）＞ D（酶解時間）。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the regression model

2.3.3 各因素交互作用分析 由圖6～圖8可知，三個響應曲面坡度均較陡峭且等高線為橢圓形，說明底物質(zhì)量分數(shù)與酶解溫度、底物質(zhì)量分數(shù)與酶解時間、加酶量與酶解溫度的交互作用對DPPH自由基清除率的影響較大，而且根據(jù)曲面坡度陡峭程度可以看出，底物質(zhì)量分數(shù)對DPPH自由基清除率的影響最大，其次是酶解溫度、加酶量，酶解時間對DPPH自由基清除率的影響最小，與響應面方差分析一致。

圖6 底物質(zhì)量分數(shù)與酶解溫度交互作用對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 The effect of the interaction between the mass fraction of substrate and the temperature of enzymatic hydrolysis on the scavenging rate of DPPH free radicals

圖8 加酶量與酶解溫度交互作用對DPPH自由基清除率的影響Fig.8 The effect of the interaction between the amount of enzyme added and the temperature of enzymatic hydrolysis on the scavenging rate of DPPH free radicals

圖7 底物質(zhì)量分數(shù)與酶解時間交互作用對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 The effect of the interaction between the mass fraction of the substrate and the enzymatic hydrolysis time on the scavenging rate of DPPH free radicals

2.3.4 最佳酶解工藝驗證實驗 利用Design- Expert 11對響應面結(jié)果進行分析，得到冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽的最佳酶解工藝為底物質(zhì)量分數(shù)4.373%，加酶量4887 U/g，酶解溫度55.66 ℃，酶解時間4.22 h，預測DPPH自由基清除率為90.03%。在最佳酶解工藝下進行驗證實驗，為方便操作，將其調(diào)整為底物質(zhì)量分數(shù)4.4%，加酶量4887 U/g，酶解溫度56 ℃，酶解時間4.2 h。進行3次驗證實驗，結(jié)果如表5所示，得到酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為89.18%±0.11%，與模型預測值的相對誤差是0.95%，說明模型與實驗結(jié)果相符，能夠較好地優(yōu)化酶解工藝條件。此外，在最佳酶解工藝下制得的抗氧化肽，0.5 mg/mL樣品的ABTS自由基清除率和Fe2+螯合率分別為68.11%±0.12%、72.59%±0.08%；1.5 mg/mL樣品的羥基自由基清除率和還原力A700分別為71.86%±0.09%、0.7473±0.0105，表現(xiàn)出較強的綜合抗氧化活性。

表5 抗氧化肽活性評價Table 5 Evaluation of antioxidant peptide activity

2.4 分子量分布

由圖9和表6可知，冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽中分子量低于1000 Da的肽占94.26%，分子量低于500 Da的肽占83.86%，說明在最佳酶解工藝下酶解效果較好，得到小分子低聚寡肽含量高。肽段長短與抗氧化能力高低密切相關(guān)，分子量在500～2500 Da的寡肽比多肽具有更強的抗氧化能力，分子量為200～500 Da的二肽或三肽與單個氨基酸相比也表現(xiàn)出較強的抗氧化能力[26]。因此，推測冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽表現(xiàn)出的抗氧化能力與其較低的分子量分布有關(guān)。

表6 冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽分子量分布結(jié)果Table 6 Results of molecular weight distribution of antioxidant peptides in the visceral mass of Cucumaria frondosa

圖9 冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽分子量分布色譜圖Fig.9 Chromatogram of molecular weight distribution of antioxidant peptides in the visceral mass of Cucumaria frondosa

2.5 氨基酸分析

酸性氨基酸因其側(cè)鏈有氨基或羧基而具有螯合金屬離子和作為質(zhì)子供體的能力，對肽抗氧化能力大小有一定的影響[27]，源于紅色黃貂魚的抗氧化肽以及太平洋鯡魚抗氧化肽中的Glu殘基，其金屬螯合作用使多肽具有良好的抗氧化活性[28-29]。由表7可知，冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽中酸性氨基酸含量豐富，占氨基酸總量的29.68%，其中，Glu含量較高，占氨基酸總量的18.87%，對肽的抗氧化能力有一定貢獻。研究表明，疏水性氨基酸在抗氧化肽序列中出現(xiàn)的頻率較高，這類氨基酸有助于抗氧化肽接近自由基，向自由基提供質(zhì)子或電子以保持活性氧的穩(wěn)定，對清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化有積極作用[30]，包斐[31]從長蛇鯔魚肉中得到的抗氧化肽富含Pro、Met、Val、Phe、Ile、Leu、Trp等疏水性氨基酸；UMAYAPARVATHI等[32]從牡蠣中分離純化出三種抗氧化肽均含有疏水性氨基酸，對DPPH自由基具有較強的清除能力。冰島刺參內(nèi)臟團提取出來的抗氧化肽也含有大量的疏水性氨基酸（40.27%），使冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽具有較強的抗氧化活性。由此推斷，冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽表現(xiàn)出較強的抗氧化活性與其氨基酸組成密不可分。

表7 冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽的氨基酸組成Table 7 Amino acid composition of antioxidant peptides in the visceral mass of Cucumaria frondosa

3 結(jié)論

本研究以DPPH自由基清除率為評價指標，通過單因素實驗和響應面法優(yōu)化得到復合蛋白酶酶解冰島刺參內(nèi)臟團制備抗氧化肽的最佳工藝條件：底物質(zhì)量分數(shù)4.4%，加酶量4887 U/g，pH7.0，酶解溫度56 ℃，酶解時間4.2 h，由此條件得到的酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為89.18%±0.11%（2 mg/mL），ABTS自由基清除率68.11%±0.12%（0.5 mg/mL），羥基自由基清除率為71.86%±0.09%（1.5 mg/mL），F(xiàn)e2+螯合率為72.59%±0.08%（0.5 mg/mL），還原力為0.7473±0.0105（1.5 mg/mL）。此外，分子量分布和氨基酸結(jié)果表明，冰島刺參內(nèi)臟團抗氧化肽中分子量低于1000 Da的肽占94.26%、低于500 Da的肽占83.86%，大部分為小分子低聚寡肽，并且酸性氨基酸、疏水性氨基酸含量豐富，分別占氨基酸總量的29.68%和40.27%，顯示出良好的抗氧化活性。本研究為酶解冰島刺參內(nèi)臟團蛋白制備抗氧化肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎，也為冰島刺參加工產(chǎn)業(yè)提供新的發(fā)展方向。