氧化鐵納米顆粒引起肝血竇內皮細胞損傷及其機制研究

張 雪 孔 非 溫 濤 張 宇 孟 潔＃? 許海燕＃?

1(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院，北京 100005)

2(東南大學生物科學與醫(yī)學工程學院，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，南京 210096)

引言

氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticles，IONPs)具有優(yōu)異的磁學性能和良好的生物相容性，在核磁共振對比劑、腫瘤熱療和藥物載體等諸多生物醫(yī)學領域具有廣泛的轉化應用潛力[1-2]。但是，其應用的潛在風險也引起了研究者的關注。有研究證實，IONPs 可促進細胞產生活性氧物種(reactive oxygen species，ROS)，這種效應主要決定于其理化性質和使用劑量[3-4]。有文章報道，羧基、氨基修飾的IONPs 和裸IONPs 均可通過氧化應激引起人心臟、大腦和腎臟來源的細胞中與增殖相關的基因發(fā)生改變[5]；裸IONPs 可通過產生ROS 誘導人微血管內皮細胞的通透性增加[6]。當細胞內ROS 濃度過高時，就會發(fā)生氧化應激損傷，引起脫氧核糖核酸、蛋白質和脂質氧化，具有引發(fā)多種疾病的風險[7]。

靜脈途徑注射是IONPs 的主要應用方式，這增加了IONPs 暴露于血管內皮細胞的風險。肝血竇內皮細胞是構成血液與肝臟組織之間屏障的重要成分[8-9]，也是與血液來源的物質最先接觸的細胞[10]，參與肝臟的炎癥、脂肪變性、肝纖維化、肝硬化和肝癌等發(fā)病過程[11]。肝臟中的血流速度明顯慢于全身循環(huán)，納米材料在肝血竇中的循環(huán)速度可下降到體循環(huán)的1/1 000，為200～800 μm/s[12]，使納米材料與肝血竇內皮細胞的接觸時間大幅度延長，并易于在肝臟中積累[13]。已有研究主要集中在IONPs 對血管內皮細胞的作用，包括血管生成[14]、內皮間質轉分化[15]和內皮通透性改變[16]等方面。目前，關于IONPs 對肝血竇內皮細胞作用的研究還比較少。本課題從氧化應激的角度，研究了二巰基丁二酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒(dimercaptosuccinic acid-magnetite nanoparticles，DMSA-Fe3O4)對人原代肝血竇內皮細胞(human hepatic sinusoid endothelial cells，HHSECs)的作用。在此基礎上，采用靜脈給藥方式，將DMSA-Fe3O4注射到健康小鼠體內，觀察其在肝臟中的分布及對肝臟的損傷。本研究將有助于確定DMSA-Fe3O4的應用安全窗口，并以此為依據(jù)設計臨床應用方案。

1 材料和方法

試劑與材料的來源:DMSA-Fe3O4購自南京東納生物科技有限公司；人原代肝血竇內皮細胞(human hepatic sinusoidal endothelial cells，HHSECs)及相關培養(yǎng)試劑，即內皮細胞基礎培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、內皮細胞生長補充物(endothelial cell growth supplement，ECGS)、青霉素/鏈霉素溶液(penicillin/streptomycin solution，P/S)與纖粘連蛋白，購自北京裕恒豐科技有限公司；2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′，7′-Dichlorodihydro fluorescein Diacetate，DCFH-DA)和0.25%胰酶購自Sigma-Aldrich 公司；Trizol 購自Ambion 公司；逆轉錄試劑盒和TB Green 購自Takara公司；引物購自生工公司。

1.1 納米顆粒表征

將DMSA-Fe3O4分散于超純水中，滴加到透射電鏡銅網上，徹底干燥后，使用透射電鏡觀察(TEM-1010)。通過納米顆粒追蹤分析儀(Zetaview PMX120，Particle Metrix)，檢測DMSA-Fe3O4的水合粒徑和Zeta 電勢，在室溫下重復測量3 次。

1.2 細胞培養(yǎng)過程

將基礎培養(yǎng)基配制成含5% FBS、1% P/S 和1% ECGs 的完全培養(yǎng)基。將不含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)配制的纖粘連蛋白按照2 μg/cm2的量加入到培養(yǎng)瓶中，37℃過夜孵育后，吸去纖粘連蛋白溶液，完成培養(yǎng)瓶的包被。將HHSECs 加入到該培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。當細胞生長到融合度約90%時，進行胰酶消化和傳代。

1.3 普魯士藍染色

按照8×104/孔的密度，將HHSECs 接種在纖粘蛋白包被的24 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后加入DMSA-Fe3O4，培養(yǎng)不同時間后，用PBS 洗滌，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min。加入300 μL 普魯士藍染液(5%亞鐵氰化鉀和5%鹽酸按照體積比為1∶1混合)處理30 min，再加入200 μL 伊紅染液復染2 min。用倒置顯微鏡(Olympus IX71)觀察細胞并采集圖像，實驗重復3 次。

1.4 檢測細胞活性

對于實時無標記細胞分析技術(real time celI anaIysis，RTCA)中用到的E-plate，每孔中加入100 μL 培養(yǎng)基，待基線平穩(wěn)后，將細胞按照8×103/孔的密度接種。在相應孔中分別加入終濃度為50、100 和200 μg/mL DMSA-Fe3O4后，將E-plate 放入儀器中(xCELLigence S16，ACEA Biosciences)。檢測細胞電阻的變化情況，檢測間隔為15 min，實驗重復3 次。

1.5 ROS 檢測實驗

按照8×104/孔的密度，將HHSECs 接種在包被過的24 孔細胞培養(yǎng)板中，過夜貼壁后，分別與50、100 和200 μg/mL 的DMSA-Fe3O4孵育30 min。棄去培養(yǎng)基，加入10 μM DCFH-DA，37℃避光處理30 min。胰酶消化后收集細胞，用流式細胞儀(C6，BD Biosciences)檢測，實驗重復3 次。

1.6 實時熒光定量PCR

按照4×105/孔的密度，將HHSECs 接種在包被過的6 孔細胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)后，棄去上清，分別與50、100 和200 μg/mL 的DMSA-Fe3O4孵育24 h。使用1 mL Trizol 提取細胞的總RNA，用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉成cDNA。使用實時定量PCR儀(Bio-Rad)檢測相關基因表達。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 作為管家基因，血紅素加氧酶-1(HO-1)、缺氧誘導因子-1(HIF-1α)和血管內皮生長因子(VEGF)作為目的基因。具體引物信息如表1所示，實驗重復3 次。

表1 引物序列信息Tab.1 Sequences information of the gene primer

1.7 動物實驗過程

動物實驗按照動物保護和利用委員會(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所)批準的方案進行。6 周齡SPF(18－21 g)雌性C57BL/6 J 小鼠購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)在中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所實驗動物中心。小鼠分為3 組，每組4 只。其中，兩組注射納米顆粒，一組注射5%葡萄糖，作為對照。將分散在5%葡萄糖里的DMSA-Fe3O4按照1 mg/kg 的劑量，通過尾靜脈注射到小鼠體內，每隔兩天注射1 次，共注射4 次。在第4 次注射后第2 和第158 d 處死小鼠，分別為D2 和D158 組。取小鼠肝臟，在4%多聚甲醛中固定。利用常規(guī)操作，進行組織固定、包埋、切片。用核固紅染液和普魯士藍染液對切片進行染色，再用蘇木素-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)對切片進行染色。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標準誤(mean±SEM)。利用Graphpad Prism 軟件中的One-way ANOVA 方法進行統(tǒng)計學分析，P<0.05 被認為差異具有統(tǒng)計學意義，?P<0.05，??P<0.01。

2 結果

2.1 HHSECs 對DMSA-Fe3O4 的攝取

使用透射電鏡觀察DMSA-Fe3O4的形貌。由圖可見，DMSA-Fe3O4為球形，直徑為5～10 nm(見圖1(a))，平均水合粒徑為(75.00±0.67)nm(見圖1(b))，Zeta 電勢為(－34.00±2.96)mV，說明顆粒表面帶負電荷(見圖1(c))。

圖1 DMSA-Fe3O4 的表征。(a)透射電鏡圖，標尺代表50 nm；(b)DMSA-Fe3O4 的水合粒徑；(c)DMSAFe3O4 的電勢Fig.1 Characterization of DMSA-Fe3O4.(a) Transmission electron microscopy image，scale bar represents 50 nm；(b) Dynamic diameter of DMSA-Fe3O4；(c) Zeta potential of DMSA-Fe3O4

將HHSECs 與DMSA-Fe3O4孵育6 h?？梢钥吹?，隨著DMSA-Fe3O4濃度的提高，HHSECs 的藍染程度相應增加(見圖2(a))；將孵育時間延長，HHSECs 的藍染程度也相應增加(見圖2(b))。結果表明，HHSECs 對DMSA-Fe3O4的攝取具有濃度和時間依賴性。

圖2 HHSECs 對DMSA-Fe3O4 的攝取(所有圖片的標尺一致，代表20 μm)。(a)HHSECs 對不同濃度DMSA-Fe3O4 的攝取(從左至右，DMSA-Fe3O4 的終濃度分別為0、25、50、100 μg/mL)；(b)不同孵育時間對HHSECs 攝取DMSA-Fe3O4的影響(從左至右，孵育時間分別為0、2、4、6 h)Fig.2 Uptake of DMSA-Fe3O4 by HHSECs (The scale bar of all images is the same，representing 20 μm).(a) HHSECs uptake of DMSA-Fe3O4 with different concentrations (From left to right，the concentration of DMSA-Fe3O4 was 0，25，50，100 μg/mL respectively)；(b) Uptake of DMSA-Fe3O4 by HHSECs with different incubation time (From left to right，the incubation time was 0，2，4，6 h)

2.2 DMSA-Fe3O4 對HHSECs 活性的影響

使用RTCA 方法檢測DMSA-Fe3O4對HHSECs活性的影響，得到細胞指數(shù)(NCI)，該數(shù)值越大說明細胞活性越高。由圖3可見，共孵育12 h 后，對照組的NCI 值為1.08±0.01，50、100 和200 μg/mL 的DMSA-Fe3O4處理組的NCI 分別為0.75±0.01、0.80±0.02 和0.62±0.03(見圖3(a))；共孵育24 h 后，對照組的NCI 升高到1.42±0.01；而50、100 和200 μg/mL DMSA-Fe3O4處理組對應的NCI 分別為0.80±0.03、0.75±0.01 和0.53±0.04(見圖3(b))。DMSA-Fe3O4處理組NCI 的增加幅度明顯低于對照組，說明細胞的增殖受到一定程度的抑制，提示DMSA-Fe3O4的長時間和高劑量暴露會引起細胞損傷。

圖3 與DMSA-Fe3O4 孵育不同時間后，HHSECs 細胞活性指數(shù)(??表示與對照組相比P<0.01，n＝3)。(a)孵育12 h；(b)孵育24 hFig.3 The cell viability induced by DMSA-Fe3O4 with different time (??P<0.01 VS control，n＝3).(a) The incubation time was 12 h；(b) The incubation time was 24 h

2.3 DMSA-Fe3O4 引起HHSECs 氧化應激

利用DCFH-DA 探針，檢測HHSECs 中ROS 水平。由圖4可見，隨著DMSA-Fe3O4濃度的增加，HHSECs 細胞的DCFH-DA 平均熒光強度(MFI)明顯增高，分別為4.57×105±0.20×105、6.43×105±0.15×105、6.23×105±0.15×105、6.04×105±0.29×105(見圖4(a))，說明DMSA-Fe3O4提高了HHSECs 中的ROS水平，引起細胞的氧化應激反應。HO－1 是細胞氧化應激的標志性基因，利用q-PCR 對HO－1 的表達情況進行分析。結果顯示，DMSA-Fe3O4的暴露使細胞內HO-1 基因的表達顯著上調；特別是高濃度200 μg/mL處理組，其HO-1 基因的表達水平是對照組的20.8 倍(見圖4(b))。

圖4 DMSA-Fe3O4 引起HHSECs 氧化應激(??表示與對照組相比，P<0.01，n＝3)。(a)不同濃度DMSAFe3O4 處理后，HHSECs 細胞內DCFH-DA 的平均熒光強度值；(b) 不同濃度DMSA-Fe3O4 處理后，HHSECs 中HO－1 基因相對表達水平Fig.4 DMSA-Fe3O4 induced HHSECs oxidative stress (??P<0.01 vs control，n＝3).(a) MFI of DCFH-DA in HHSECs with different treated concentration of DMSA-Fe3O4；(b) Relative HO－1 gene expression of HHSECs with different treated concentration of DMSA-Fe3O4

2.4 DMSA-Fe3O4 激活HHSECs 缺氧相關信號通路

進一步的研究發(fā)現(xiàn)，與DMSA-Fe3O4孵育后，HHSECs 細胞中HIF-1α基因的表達顯著升高，50、100 和200 μg/mL 的DMSA-Fe3O4處理組的細胞HIF-1α基因表達水平分別是對照組的1.65、1.68和2.01 倍(見圖5(a))。HIF-1α基因下游的VEGF基因表達水平也隨之升高，50、100 和200 μg/mL 的DMSA-Fe3O4處理組的細胞VEGF基因表達水平分別是對照組的1.64、2.0 和4.2 倍(見圖5(b))。結果表明，DMSA-Fe3O4暴露促進了HIF-1α基因和VEGF基因的表達，并具有一定的濃度依賴性。

圖5 DMSA-Fe3O4 對HHSECs 中HIF-1α 和VEGF基因表達的影響(??表示與對照組相比，P<0.01，n＝3)。(a)HIF-1α 基因的表達；(b)VEGF 基因的表達Fig.5 The influence of DMSA-Fe3O4 on the gene expression of HIF-1α and VEGF for HHSECs (??P<0.01 vs control，n＝3).(a) HIF-1α gene expression；(b) VEGF gene expression

2.5 DMSA-Fe3O4 對小鼠肝臟組織的影響

最后一次注射DMSA-Fe3O4后，分別在第2 d天(D2)和第158 d(D158)處死小鼠，取肝臟組織進行普魯士藍染色。由圖6(a)可見，對照組肝臟中幾乎沒有細胞藍染；D2 組小鼠肝臟中藍染細胞的數(shù)量明顯增多，且主要集中在內皮細胞(實線短箭頭)和庫普弗細胞(虛線長箭頭)中(見圖6(b))；D158 組的小鼠肝臟中藍染細胞(箭頭所示)的數(shù)量明顯下降(見圖6(c))。這些結果說明，靜脈注射后，DMSA-Fe3O4在肝臟中會有一定蓄積，但大部分可在半年內排出。

圖6 小鼠肝臟組織的普魯士藍染色結果(每行左側標尺代表30 μm，右側標尺代表10 μm)。(a)對照組肝臟組織染色；(b)DMSA-Fe3O4 注射第2 d，小鼠肝臟組織染色(虛線長箭頭所示為庫普弗細胞，實線短箭頭所示為內皮細胞)；(c)DMSA-Fe3O4 注射第158 d，小鼠肝臟組織染色(箭頭所示為藍染的內皮細胞)Fig.6 Prussian staining images of liver tissue (Scale bars in left column images represent 30 μm，scale bars in right column images represent 10 μm).(a)Representative images of liver tissue for control mice；(b) Representative images of liver tissue for mice sacrificed on D2 post DMSA-Fe3O4administration(The long dashed arrow points to Kupffer cells，the short solid arrow points to endothelial cell)；(c)Representative images of liver tissue for mice sacrificed on D158 post DMSA-Fe3O4 administration(The arrow points to blue-stained endothelial cells)

肝臟組織的HE 染色結果顯示，與對照組(見圖7(a))相比，D2 組的肝臟組織結構相對松散，細胞核和細胞質染色變淺，部分細胞出現(xiàn)核固縮或消失，可見壞死的肝細胞(箭頭所示)(見圖7(b))；D158 肝臟組織與對照組相似，結構有序，細胞核分布整齊，肝細胞狀態(tài)良好(見圖7(c))。上述結果表明，多次注射DMSA-Fe3O4后，在短時間內可引起一定程度的肝細胞損傷，但損傷是可逆轉的，半年內可以恢復。

3 討論

本研究的結果表明，DMSA-Fe3O4可以被HHSECs 攝取，并引起細胞的氧化應激反應，進而會引起一定程度的肝損傷，但是隨著DMSA-Fe3O4從體內排出，肝臟組織的病理性改變可在半年內恢復到對照組的狀態(tài)。內皮細胞覆蓋在血管內表面，構成具有組織特異性的內皮屏障[17]，在血管再生、凝血和維持血管穩(wěn)態(tài)以及免疫功能等方面起重要作用[18]。

有文獻報道稱，內皮細胞易于主動攝取納米顆粒[19]；本課題組前期報道過DMSA-Fe3O4可以被人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)攝取，并引起細胞活性降低[20]。比較DMSA-Fe3O4對兩種內皮細胞的作用，在相同的DMSA-Fe3O4濃度下，HUVECs 活性的下降程度高于HHSECs 的狀況，即HUVECs 對DMSA-Fe3O4更加敏感，這提示不同器官中內皮細胞對DMSA-Fe3O4引起的氧化應激損傷耐的受性不同，后續(xù)的研究應重視和區(qū)分納米顆粒對不同器官組織中內皮細胞的效應。DMSA-Fe3O4可被內皮細胞大量攝取，這也是其導致細胞損傷的重要原因。在前期研究中，使用山梨醇羧甲基醚包覆的三氧化二鐵納米顆粒(PSC-Fe2O3)與HUVECs 細胞孵育。這種納米顆粒不被HUVECs 攝取，在較高濃度下對細胞活性無明顯影響，但引起了內皮細胞的內皮間質轉分化[15]。鑒于不同器官組織的內皮細胞具有特殊性，后續(xù)的研究應重視IONPs 的理化性質，以及對不同來源的內皮細胞的影響及機制。

本研究推測，DMSA-Fe3O4引起的可逆性肝損傷主要通過兩種機制:一方面，引起HHSECs 的氧化應激而使ROS 水平升高，導致細胞上調HIF-1α，由此促進了VEGF的表達，而VEGF的高表達會引起血管異常增生和肝損傷[11，21-22]；另一方面，DMSAFe3O4可在溶酶體中緩慢降解，會造成細胞內鐵過載[23]。肝臟是鐵代謝調節(jié)的中心器官之一，可以將降解的鐵儲存起來，是鐵超載損傷的主要靶器官[24]。需要強調的是，DMSA-Fe3O4引起的肝臟組織損傷是可逆的，從第158 d 的肝臟組織病理切片上沒有觀察到明顯的肝損傷現(xiàn)象，這是因為DMSAFe3O4可以從肝臟中排出，而且肝臟具有較強的自我更新和修復能力[25]。

4 結論

HHSECs 對DMSA-Fe3O4的攝取具有時間和濃度依賴性，DMSA-Fe3O4引起細胞ROS 水平升高和氧化應激反應。多次靜脈注射DMSA-Fe3O4可蓄積在肝臟中，并引起短暫性肝細胞損傷。隨著DMSAFe3O4從肝臟中排出，這種肝損傷可恢復。