一種新型干性生物瓣膜耐久性能體外測(cè)試及評(píng)價(jià)

劉 麗 萬(wàn)辰杰 王 碩 李崇崇 柯林楠 王春仁

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

引言

隨著人工生物心臟瓣膜(以下簡(jiǎn)稱生物瓣膜)材料和技術(shù)的不斷進(jìn)展，以及對(duì)人工機(jī)械心臟瓣膜(以下簡(jiǎn)稱機(jī)械瓣膜)終身抗凝并發(fā)癥的重視，越來(lái)越多的臨床研究顯示了生物瓣膜的優(yōu)越性[1-4]。2017年發(fā)布的瓣膜性心臟病治療指南(ESC/EACTS guidelines for the management of valvular heart disease)[5]推薦50 歲以下患者選擇機(jī)械瓣膜，70 歲以上患者選擇生物瓣膜，50～70 歲患者兩種瓣膜都可以考慮，臨床生物瓣膜植入患者年齡有降低的趨勢(shì)。

目前生物瓣膜一般使用牛心包或豬主動(dòng)脈瓣經(jīng)戊二醛交聯(lián)材料制備，貯存于含戊二醛的保存液中(以下簡(jiǎn)稱為濕性生物瓣膜)，優(yōu)勢(shì)在于患者不需要終生服用抗凝藥物。但生物瓣膜發(fā)生瓣膜鈣化毀損和再次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)更高，且再次開(kāi)胸手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)比首次手術(shù)明顯增高。隨著生物材料的發(fā)展，近年來(lái)出現(xiàn)了通過(guò)覆蓋牛心包材料鈣結(jié)合位點(diǎn)的牛心包處理技術(shù)，并以此為瓣葉材料制備出新型干燥組織生物瓣膜(以下簡(jiǎn)稱為干性生物瓣膜)，為生物瓣膜提供了更加優(yōu)異的抗鈣化性能和生物力學(xué)性能[6]。同時(shí)，干性生物瓣膜在常溫下干燥貯存，大幅降低了瓣膜運(yùn)輸和貯存成本。濕性瓣膜需要保存在含戊二醛保存液中，在2℃～8℃冷藏條件下運(yùn)輸和貯存。因此，干性生物瓣膜是未來(lái)生物瓣膜發(fā)展的趨勢(shì)。

目前，干性生物瓣膜剛剛進(jìn)入臨床階段，缺少長(zhǎng)期耐久性數(shù)據(jù)。本研究對(duì)一種干性生物瓣膜進(jìn)行體外加速耐久性能測(cè)試，通過(guò)瓣膜脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)、瓣葉熱力學(xué)分析和顯微鏡下膠原纖維觀察對(duì)其耐久性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為干性生物瓣膜臨床耐久性能評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品:干性生物瓣膜(23 和32 mm 兩種規(guī)格各3 個(gè))，測(cè)試環(huán)境參數(shù)模擬及標(biāo)準(zhǔn)參照為主動(dòng)脈瓣位。

實(shí)驗(yàn)用流體為0.9%生理鹽水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

耐久性能測(cè)試采用人工心臟瓣膜疲勞測(cè)試系統(tǒng)和脈動(dòng)流性能測(cè)試系統(tǒng)(加拿大VIVITRO Lab)。疲勞測(cè)試系統(tǒng)提供100 mmHg 的平均反向壓力，1 000 次/min 的加速頻率；脈動(dòng)流性能測(cè)試系統(tǒng)模擬主動(dòng)脈瓣部位流動(dòng)環(huán)境，提供生理壓力及流量波形，2～7 L/min 的模擬心輸出量。瓣葉熱力學(xué)分析采用差示掃描量熱儀(DSC 214 Polyma，Netzsch)測(cè)試。瓣葉膠原纖維結(jié)構(gòu)分析采用雙光子共聚焦顯微鏡(A1R MP，Nikon)測(cè)試。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 耐久性能測(cè)試

耐久性能測(cè)試是評(píng)價(jià)瓣膜長(zhǎng)期有效性的體外測(cè)試方法。該實(shí)驗(yàn)?zāi)M瓣膜臨床使用條件及使用時(shí)間，對(duì)瓣膜的長(zhǎng)期使用性能進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)YY/T1449.3-2016 及ISO 5840-3:2013 人工心臟瓣膜標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，對(duì)于生物瓣膜一般考慮模擬臨床使用5年時(shí)間(2 億次循環(huán))過(guò)程中瓣膜的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。瓣膜做為血液系統(tǒng)的閥門，其流體力學(xué)性能是其最重要的性能指標(biāo)，因此，在耐久性能測(cè)試過(guò)成中，通過(guò)脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)對(duì)干性生物瓣膜流流體力學(xué)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而評(píng)價(jià)其耐久性能。

將待測(cè)干性生物瓣膜安裝在人工心臟瓣膜疲勞測(cè)試系統(tǒng)對(duì)應(yīng)測(cè)試腔中。通過(guò)調(diào)節(jié)電機(jī)運(yùn)動(dòng)幅值及頻率，使得通過(guò)干性生物瓣膜平均跨瓣壓差為100 mmHg，至少95%的循環(huán)達(dá)到通過(guò)閉合瓣膜的定義目標(biāo)壓差峰值100 mmHg，每個(gè)循環(huán)中至少有5%的時(shí)間里所受壓差是等于或大于100 mmHg，調(diào)節(jié)測(cè)試頻率為1 000 次/min。每完成0.5 億次循環(huán)取出干性生物瓣膜進(jìn)行脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)，測(cè)試其流體力學(xué)性能，直至2 億次耐久性能測(cè)試結(jié)束。

1.3.2 脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)

脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)用來(lái)測(cè)試瓣膜在脈動(dòng)條件下的流體力學(xué)性能，該流體力學(xué)性能主要通過(guò)平均跨瓣壓差、返流百分比、有效瓣口面積和能量損失4 個(gè)指標(biāo)反映。其中，平均跨瓣壓差是循環(huán)的正壓差階段，瓣膜兩側(cè)的壓差對(duì)時(shí)間的算術(shù)平均值，是用來(lái)評(píng)價(jià)瓣膜狹窄的重要指標(biāo)。返流百分比是一個(gè)循環(huán)內(nèi)反向通過(guò)瓣膜的流量與前向流階段通過(guò)瓣膜的流量的百分比，以評(píng)價(jià)瓣膜返流的重要指標(biāo)。有效瓣口面積通過(guò)壓差和流量計(jì)算得出，更直觀地反映瓣膜的性能。能量損失以瓣膜一個(gè)循環(huán)計(jì)算，包括瓣膜開(kāi)啟和關(guān)閉兩個(gè)過(guò)程，反映瓣膜的效能。

將待測(cè)干性生物瓣膜安裝在脈動(dòng)流測(cè)試系統(tǒng)上，在平均主動(dòng)脈壓100 mmHg、心率70 次/min，心輸出量5.0 L/min 的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)試干性生物瓣膜的平均跨瓣壓差、返流百分比、有效瓣口面積和能量損失。每個(gè)條件下選取10 個(gè)循環(huán)測(cè)試并計(jì)算平均值。將0、0.5、1.0、1.5、2.0 億次的干性生物瓣膜脈動(dòng)流性能測(cè)試結(jié)果進(jìn)行對(duì)比和分析。

1.3.3 瓣葉熱力學(xué)分析

分別取耐久性能測(cè)試前后的干性生物瓣膜瓣葉樣品用濾紙吸干表面水分，稱量約5 mg，置于差示掃描量熱儀的鋁制樣品盤中，密封加熱，起始溫度為10℃，每分鐘升高2℃，最終至150℃。以吸熱峰值作為樣品的變性溫度。

1.3.4 瓣葉膠原纖維結(jié)構(gòu)分析

取耐久性能測(cè)試前后的干性生物瓣膜瓣葉在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察，激光設(shè)置為840 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)，以誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)依賴的自體熒光和二次諧波產(chǎn)生(second harmonic generation，SHG)。選擇檢測(cè)器前的低通濾波器采集膠原的SHG 信號(hào)。探測(cè)器的針孔被設(shè)置為最大值以收集焦平面上產(chǎn)生的所有光線。

2 結(jié)果

2.1 耐久性能

干性生物瓣膜在100 mmHg 平均壓力、70 次/min 心率、5 L/min 心輸出量條件下的脈動(dòng)流性能數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。YY/T1449.3－2016[7](等同轉(zhuǎn)化于ISO 5840.3∶2013)對(duì)于左心植入的瓣膜的最低脈動(dòng)流性能做了規(guī)定，具體要求見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)2 億次耐久性能測(cè)試的干性生物瓣膜脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全滿足該標(biāo)準(zhǔn)的要求，說(shuō)明干性生物瓣膜經(jīng)過(guò)2 億次耐久性能測(cè)試后仍具有良好的流體力學(xué)性能。

表1 干性生物瓣膜耐久性能測(cè)試后脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The pulsatile-flow testing results of the dry bioprosthetic valve after durability testing

2.2 脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)結(jié)果

干性生物瓣膜2 億次耐久性能測(cè)試中，每完成0.5 億次循環(huán)后進(jìn)行脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3 個(gè)瓣膜測(cè)試結(jié)果平均值。從圖1可以看出，經(jīng)過(guò)2 億次循環(huán)后，23 mm 規(guī)格干性生物瓣膜平均跨瓣壓差有所升高，但仍處于同規(guī)格生物瓣膜較低水平，32 mm 規(guī)格干性生物瓣膜平均跨瓣壓差變化不大；2 個(gè)規(guī)格干性生物瓣膜有效瓣口面積耐久性能測(cè)試前后基本一致，說(shuō)明體外加速疲勞測(cè)試后，干性生物瓣膜未發(fā)生明顯的狹窄；測(cè)試前后，返流百分比無(wú)明顯變化，說(shuō)明體外加速疲勞測(cè)試后，干性生物瓣膜未出現(xiàn)明顯的返流；能量損失無(wú)明顯變化，說(shuō)明干性生物瓣膜體外加速疲勞測(cè)試后，瓣膜的效能無(wú)明顯降低。

圖1 干性生物瓣膜耐久性能測(cè)試中脈動(dòng)流實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(a)跨瓣壓差；(b)返流百分比；(c)有效瓣口面積；(d)能量損失Fig.1 The pulsatile-flow testing results of the dry tissue bioprosthetic valve after durability testing.(a) Mean pressure gradient；(b) Paravalvular leakage；(c) Effective orifice area；(d) Energy loss

2.3 熱力學(xué)分析結(jié)果

干性生物瓣膜耐久性能測(cè)試前后，瓣葉熱變性溫度見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，經(jīng)過(guò)2 億次耐久性能測(cè)試后，瓣葉材料的熱力學(xué)變性溫度降低，從96.6℃變?yōu)?1.2℃，熱變性溫度是組織內(nèi)存在化學(xué)鍵的表現(xiàn)，這些鍵維持了蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)間三維、四維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。疲勞后變性溫度降低，表明一些化學(xué)鍵受到破壞，鍵合程度降低，瓣葉交聯(lián)程度降低。

圖2 瓣葉熱力學(xué)分析測(cè)試曲線。(a)耐久性能測(cè)試前；(b)耐久性能測(cè)試后Fig.2 The test curve of valve thermodynamic analysis.(a) Before durability-testing；(b) After durability-testing

2.4 膠原纖維結(jié)構(gòu)

分別取耐久性能測(cè)試前后的干性生物瓣膜的瓣葉在雙光子共聚焦顯微鏡下觀察，激光激發(fā)波長(zhǎng)為840 nm，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，在同樣測(cè)試條件下，經(jīng)過(guò)2 億次耐久性能測(cè)試后的瓣葉亮度變暗，但膠原纖維形狀未發(fā)生變化，仍是卷曲的立體結(jié)構(gòu)，說(shuō)明膠原纖維含量降低，化學(xué)鍵部分丟失，跟熱變性溫度的表現(xiàn)是一致的。

圖3 雙光子共聚焦顯微鏡下840 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下的圖像。(a)耐久性能測(cè)試前；(b)耐久性能測(cè)試后Fig.3 The image at 840 nm excitation wavelength under double light confocal microscope.(a)Before durability-testing；(b) After durability-testing

3 討論

人工心臟瓣膜是用來(lái)治療瓣膜功能失效引起的結(jié)構(gòu)性心臟病的長(zhǎng)期植入的醫(yī)療器械，目前主要有生物瓣膜和機(jī)械瓣膜兩種材質(zhì)[9]。與機(jī)械瓣膜性比，生物瓣膜植入后無(wú)需終身抗凝，流體力學(xué)性能更好，出血事件和血栓栓塞率較低。但生物瓣膜壽命有限，可能發(fā)生瓣膜撕裂、瓣葉鈣化、人工瓣膜感染性心內(nèi)膜炎等不良事件，一些植入生物瓣膜的患者更是過(guò)早的出現(xiàn)了這些不良事件，并未達(dá)到預(yù)期的使用壽命[10-12]。耐久性能測(cè)試是臨床前評(píng)價(jià)人工心臟瓣膜安全性的主要方法。人工心臟瓣膜行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1449.3-2016 及目前對(duì)于人工心臟瓣膜耐久性的研究[13-14]中，重點(diǎn)關(guān)注瓣膜的開(kāi)閉狀態(tài)和流體力學(xué)性能，而對(duì)于生物瓣膜，瓣葉材料為動(dòng)物源性材料，可能出現(xiàn)瓣膜流體力學(xué)性能尚未發(fā)生衰退，但瓣葉已發(fā)生微觀改變。因此有必要在瓣膜耐久性能測(cè)試中對(duì)瓣葉進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試分析。

本課題對(duì)一種新型干性生物瓣膜進(jìn)行耐久性能測(cè)試，并首次采用熱力學(xué)分析和雙光子激光共聚焦顯微鏡對(duì)耐久性能測(cè)試后的瓣葉進(jìn)行分析，從微觀角度對(duì)干性瓣膜耐久性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。耐久性能測(cè)試后瓣葉材料變性溫度有一定下降，表明一些化學(xué)鍵受到破壞，鍵合程度降低，瓣葉交聯(lián)程度降低，雙光子激光共聚焦顯微鏡下觀察到，在同樣測(cè)試條件下，亮度變暗，但膠原纖維形狀未發(fā)生變化，仍是卷曲的立體結(jié)構(gòu)，說(shuō)明膠原纖維含量降低，化學(xué)鍵部分丟失，跟熱變性溫度的表現(xiàn)是一致的。說(shuō)明經(jīng)過(guò)2 億次耐久性能測(cè)試，干性生物瓣膜瓣葉在纖維結(jié)構(gòu)方面發(fā)生了變化，但干性生物瓣膜耐久性能測(cè)試前后流體力學(xué)性能無(wú)顯著變化，仍具有良好的流體力學(xué)性能。說(shuō)明熱變性溫度和膠原纖維結(jié)構(gòu)對(duì)于評(píng)價(jià)生物瓣膜耐久性能具有一定意義。

4 結(jié)論

干性生物瓣膜經(jīng)過(guò)2 億次疲勞測(cè)試后，瓣葉膠原纖維含量減少，但結(jié)構(gòu)仍保持完整的三維結(jié)構(gòu)，熱變性溫度有所降低，瓣膜脈動(dòng)流性能未發(fā)生明顯變化，均滿足YY/T1449.3-2016 標(biāo)準(zhǔn)中性能要求，說(shuō)明耐久性能測(cè)試后，干性生物瓣膜仍具有良好的流體力學(xué)性能。