脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠促組織再生的研究進(jìn)展

蔣永生 李 銳 韓春嬋 黃立江

1(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬象山醫(yī)院，浙江 溫州 315700)

2(中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣州 510127)

引言

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類(lèi)面臨各種疾病的折磨較為普遍，包括由交通事故、高空墜落等原因?qū)е碌慕M織嚴(yán)重受損和由身心壓力和焦慮誘導(dǎo)的心血管疾病。這些疾病的發(fā)病率較高且逐步向中少年蔓延，對(duì)患者的身心造成嚴(yán)重的痛苦，并給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)一項(xiàng)，我國(guó)每年約100 萬(wàn)的病例，需至少55 億～78 億元的治療費(fèi)用[1]。由于絕大多數(shù)的組織在遭受外界破壞后，其自身的再生能力較差，故器官移植仍是目前臨床運(yùn)用的主流。但這種方法存在如下缺陷[2]:一是免疫排斥反應(yīng)，因?yàn)榻^大部分來(lái)源于異體或異種；二是來(lái)源受限，絕大多數(shù)通過(guò)遺體捐獻(xiàn)獲得，數(shù)量稀少；三是療效有限，移植后只能有限改善患者的運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能。囿于上述存在的缺陷，需要尋找可替代并需優(yōu)化的方案。目前，脫細(xì)胞基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)水凝膠作為生物材料的主體分支，廣泛應(yīng)用在細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控、缺損組織的修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究中。

ECM 水凝膠可通過(guò)對(duì)異體和異種的組織/器官進(jìn)行去細(xì)胞化并結(jié)合其他制備工藝進(jìn)行獲取，其內(nèi)部保留大量的ECM 相關(guān)蛋白，包括纖維蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞的生存、增殖、遷移和分化[3]。而且，其內(nèi)部呈現(xiàn)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和固有的力學(xué)性能，可為細(xì)胞生長(zhǎng)和組織再生創(chuàng)造良好的微環(huán)境[4]。另外，該類(lèi)水凝膠在低溫環(huán)境下(4℃)呈現(xiàn)液態(tài)，本身具備溫敏特性，所以適用于體內(nèi)填充不規(guī)則組織壞死形成的囊腔[5]。值得一提的是，ECM 水凝膠已經(jīng)作為一種原料，通過(guò)3D 打印或靜電紡絲技術(shù)，制備成可匹配缺損組織尺寸的導(dǎo)管或支架，移植入修復(fù)的缺損區(qū)，以促進(jìn)組織或器官的再生。另外，它們還可作為一種載體去包裹干細(xì)胞或生長(zhǎng)因子(growth factors，GFs)，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合和組織再生[6-7]?；贓CM 水凝膠存在的諸多優(yōu)勢(shì)，將其運(yùn)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)已成為一種良好的選擇。下面介紹脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠的基本性質(zhì)，包括成分、結(jié)構(gòu)和物理特點(diǎn)，探討不同水凝膠的組織特異性以及免疫原性，闡述這種水凝膠在細(xì)胞水平、臨床前的研究和臨床中的運(yùn)用，展望其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)和需要克服的缺陷。

1 EECM 水凝膠的基本特點(diǎn)

1.1 成分和結(jié)構(gòu)

脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠內(nèi)含有的主要成分包括:膠原蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白、糖胺聚糖和微量生長(zhǎng)因子。膠原蛋白是構(gòu)成脫細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，占比為25%～35%，可通過(guò)受體的結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和遷移[8]。纖維蛋白是富含半胱氨酸的多糖蛋白，可作為組織完整性的結(jié)構(gòu)支撐和指導(dǎo)細(xì)胞性能的信號(hào)調(diào)節(jié)器，在肌肉發(fā)育和骨骼形成中扮演中樞的角色，如果缺乏會(huì)導(dǎo)致肌萎縮和骨骼發(fā)育遲緩等疾病[9]。層粘連蛋白是細(xì)胞黏著于基質(zhì)的介質(zhì)，并與多種基底膜成分結(jié)合，在器官發(fā)育和傷口愈合過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，包括增殖、分化、黏附和遷移，促進(jìn)再上皮化和血管生成，進(jìn)而誘導(dǎo)新生組織的形成[10]。糖胺聚糖是一種線性陰離子多糖，在共價(jià)結(jié)合的連接區(qū)可與生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等活性蛋白進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而緩控其在體內(nèi)的釋放，達(dá)到長(zhǎng)效治療的效果[11]。微量GFs 的存留可與細(xì)胞膜特異受體結(jié)合，并能調(diào)控細(xì)胞的生存和生長(zhǎng)，促進(jìn)組織的發(fā)育和血管的形成[12]。由于這些成分的含量和占比在不同組織提取的水凝膠中存在較大的差異，導(dǎo)致其修復(fù)相同疾病的效果各不相同，故分析各水凝膠成分的組成和含量，可為各種生物水凝膠運(yùn)用于組織工程提供參考。

對(duì)脊髓、腦、坐骨神經(jīng)、皮膚、小腸粘膜等組織制備的水凝膠進(jìn)行固定、脫水和凍干，并通過(guò)掃描電鏡觀察，這些水凝膠的表面均呈現(xiàn)多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且孔徑介于50～500 nm 的范圍[13]。冷凍電鏡進(jìn)一步揭示其空間呈現(xiàn)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)可提高水凝膠的比表面積，有助于外源性細(xì)胞的附著和遷移，進(jìn)而加速缺損部位的修復(fù)。Hong 等[14]研究顯示，注射一種溫敏性生物水凝膠至脊髓挫傷模型小鼠的空洞區(qū)域，可顯著減少脊髓囊腔的體積，促進(jìn)遠(yuǎn)端神經(jīng)軸突的再生，并穿越囊腔與近端神經(jīng)元進(jìn)行橋接。需要強(qiáng)調(diào)的是，水凝膠的結(jié)構(gòu)、孔徑和纖維直徑受來(lái)源的組織、加工方法和產(chǎn)物配置濃度的影響。因此，在制備水凝膠的過(guò)程中，需要注意原料的選擇和制備的方法。

2 物理特點(diǎn)

ECM 水凝膠的形成機(jī)制是一種基于膠原的自組裝過(guò)程，并受到糖胺聚糖、蛋白聚糖和ECM 蛋白的調(diào)節(jié)[15]。從生物體獲得ECM 制備ECM 水凝膠涉及兩個(gè)關(guān)鍵步驟[16]:一是將ECM 材料溶解成蛋白質(zhì)單體成分；二是在溫度和pH 控制中，與誘導(dǎo)單體組分的分子內(nèi)鍵自發(fā)重組為均質(zhì)凝膠。在用生物酶(如胃蛋白酶)將ECM 粉末消化成水凝膠溶液后，內(nèi)部含有分散的膠原、糖胺聚糖、蛋白聚糖和ECM 蛋白單體。在適宜的溫度和pH 條件下，可以將膠原單體三維螺旋結(jié)構(gòu)的分子內(nèi)部和分子間通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合產(chǎn)生交聯(lián)，以提高膠原纖維的張力和穩(wěn)定性，進(jìn)而使ECM 凝膠溶液成膠[5]。在這一過(guò)程中，其他分子(如糖胺聚糖、蛋白聚糖和ECM 蛋白)可通過(guò)調(diào)控膠原蛋白纖維的自組裝或形成膠原纖維的成核位點(diǎn)，進(jìn)而加速膠原的交聯(lián)[15，17]。

ECM 水凝膠具有很好的溫敏特性，即在4℃條件下呈現(xiàn)液態(tài)，在37℃呈現(xiàn)凝膠態(tài)。這種受溫度調(diào)控的相轉(zhuǎn)變與前面提及的分子間交聯(lián)密切相關(guān)。當(dāng)ECM 凝膠溶液由低溫條件(如4℃)改變?yōu)?7℃后，由于外界溫度的升高，ECM 水凝膠內(nèi)部高分子鏈間的共價(jià)鍵發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而形成網(wǎng)狀或體型高分子，即出現(xiàn)分子的交聯(lián)，使ECM 凝膠溶液的穩(wěn)定性提高，黏度增加，生成凝膠[18]。這種溫敏特性對(duì)于不規(guī)則組織損傷的修復(fù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橐?guī)則形狀的植入物很難實(shí)現(xiàn)損傷空洞的飽和填充，而對(duì)于ECM 水凝膠，在低溫條件下，可通過(guò)微創(chuàng)手術(shù)，實(shí)現(xiàn)ECM 水凝膠在壞死囊腔區(qū)域的飽和填充，并且在體溫的作用條件下，迅速轉(zhuǎn)變?yōu)椴荒芰鲃?dòng)的半固態(tài)凝膠，防止水凝膠的溢出，因而有助于ECM 水凝膠的原位注射。另外，ECM 水凝膠的黏彈性能也會(huì)顯著影響體外干細(xì)胞的分化和體內(nèi)組織的重塑，因?yàn)轲椥缘淖兓瘯?huì)改變ECM 水凝膠的黏度和凝膠化的時(shí)間，進(jìn)而影響細(xì)胞在水凝膠內(nèi)的生存和生長(zhǎng)。ECM 水凝膠的黏彈性與組織來(lái)源、水凝膠濃度、檢測(cè)參數(shù)和樣品之間的變異性密切相關(guān)，可通過(guò)存儲(chǔ)模量進(jìn)行定量。對(duì)于體內(nèi)的應(yīng)用，ECM 水凝膠的存儲(chǔ)模量應(yīng)介于300～800 Pa[19]。在此范圍條件下，ECM 水凝膠可顯著地促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移。

ECM 水凝膠體系內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)也是需要關(guān)注的重要方面，其形貌受組織的來(lái)源、加工方法和蛋白質(zhì)濃度的影響[20]。掃描電鏡顯示，ECM 水凝膠呈現(xiàn)3D 多孔納米纖維的形態(tài)。這種納米尺度的形貌，有助于細(xì)胞膜表面受體整合素與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互識(shí)別，進(jìn)而調(diào)控浸潤(rùn)的細(xì)胞對(duì)外界的感應(yīng)和黏附[21]。另外，ECM 水凝膠的力學(xué)性能較弱且易發(fā)生降解，體內(nèi)成膠后不足以支撐周?chē)M織的形態(tài)。因此，以水凝膠為原材料制備導(dǎo)管或靜電紡絲，成為修復(fù)組織損傷的另一重要策略。

2 ECM 水凝膠的材料特性

2.1 組織特異性

組織特異性是指在多細(xì)胞生物群里中，本體與異體具有顯著的結(jié)構(gòu)與組成差異。這種特異性在組織細(xì)胞研究中表現(xiàn)得尤為明顯。Yi 等[22]將骨骼肌祖細(xì)胞(human skeletal muscle progenitor cells，hSMPCs)分別培養(yǎng)在骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠、明膠和海藻酸鈉水凝膠的表面，結(jié)果顯示:相較于明膠和海藻酸鈉水凝膠，骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠可顯著增強(qiáng)hSMPCs 的擴(kuò)張、分化和成熟，并促進(jìn)骨骼肌標(biāo)志物和肌管的形成。Prest 等[23]分別將犬和鼠的坐骨神經(jīng)脫細(xì)胞，并消化制備成1%水凝膠，將其鑲嵌在17 mm 硅導(dǎo)管的內(nèi)部，然后將制備的兩種導(dǎo)管分別橋接在大鼠坐骨神經(jīng)干斷處的兩側(cè)(缺損長(zhǎng)度為15 mm)，21 d 后發(fā)現(xiàn):硅導(dǎo)管內(nèi)部鑲嵌鼠神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠相比內(nèi)部鑲嵌犬神經(jīng)脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠，更加促進(jìn)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和M2型巨噬細(xì)胞的比率，同時(shí)使血旺細(xì)胞的遷移顯著加速。另外，將制備的食道、膀胱和小腸組織水凝膠對(duì)大鼠食管黏膜切除模型進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):由食道制備的組織水凝膠在促進(jìn)食管干細(xì)胞的體外遷移、增殖和三維器官形成方面效果最佳，可快速地促進(jìn)食管黏膜的重建[24]。這些結(jié)果說(shuō)明，同種組織制備的生物水凝膠與異種組織制備的生物水凝膠相比，能夠更強(qiáng)地促進(jìn)細(xì)胞行為的改善和組織損傷的修復(fù)。同樣，在臨床實(shí)踐中，指導(dǎo)細(xì)胞行為和影響重塑結(jié)果的不同組織源性的生物材料移植，由優(yōu)到劣的效果順序如下:自體組織→同種異體組織→異種組織。因此，理論上理想的組織修復(fù)材料是來(lái)源于特定部位或同源性的ECM 水凝膠。

2.2 免疫原性

體內(nèi)免疫原性物質(zhì)的種類(lèi)和含量是形成組織特異性的重要因素之一。目前，在體內(nèi)檢測(cè)的免疫原性物質(zhì)主要包括:細(xì)胞核酸、免疫大分子和內(nèi)毒素。細(xì)胞核酸主要檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的DNA，其被認(rèn)為是細(xì)胞材料的污染標(biāo)記物。目前報(bào)道的生物ECM 水凝膠干產(chǎn)品可接受殘留DNA 量的最低標(biāo)準(zhǔn)是小于50 ng/mg，片段長(zhǎng)度小于300 bp[25]，其殘存量可通過(guò)基于商業(yè)染料的驗(yàn)光分析或其他組織學(xué)染色技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。免疫大分子會(huì)引起組織強(qiáng)烈的細(xì)胞炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答，因此在生物材料的制備中應(yīng)該盡量去除。這些分子主要包括α-(1，3)-半乳糖(galactose-α(1，3)-galactose，α-gal)和主要組織相容性復(fù)合體I 類(lèi)(major histocompatibility complex class I，MHC-I)。二者的殘留可刺激T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的活化，招募其他炎癥細(xì)胞，攻擊并吞噬周?chē)募?xì)胞，引起強(qiáng)烈的免疫原性反應(yīng)。因此，這些免疫大分子應(yīng)盡可能地從制備的ECM 水凝膠中去除。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌中的一種熱原，具有強(qiáng)烈地刺激不同細(xì)胞的亞急性炎癥反應(yīng)，且在不同材料中污染閾值各不相同。美國(guó)FDA 已規(guī)定，所有醫(yī)療材料(包括去細(xì)胞組織制成的水凝膠)中內(nèi)毒素的檢測(cè)限必須小于0.5 eu/mL[26]。目前，商業(yè)化鱟試劑試驗(yàn)已被公認(rèn)為是一種高度敏感和準(zhǔn)確的方法，可客觀地檢測(cè)組織源性水凝膠中含有的內(nèi)毒素[27]。但是，上述免疫物質(zhì)的存留會(huì)嚴(yán)重影響ECM 水凝膠的臨床應(yīng)用前景，因此不含這類(lèi)免疫物質(zhì)的ECM 水凝膠制備是目前要解決的難點(diǎn)。需要強(qiáng)調(diào)的是，在盡量去除這類(lèi)免疫物質(zhì)的同時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的活性大分子也不可避免地被清除，并破壞水凝膠內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)于目前的水凝膠制備技術(shù)還需不斷地進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而達(dá)到盡量保留有益物質(zhì)并去除有害物質(zhì)的目的。

3 ECM 水凝膠的醫(yī)學(xué)應(yīng)用

3.1 對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞行為的影響

ECM 水凝膠含有豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，并兼具三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的培養(yǎng)創(chuàng)造了良好的微環(huán)境，可顯著地促進(jìn)干細(xì)胞、原代細(xì)胞和細(xì)胞系的生存、增殖、遷移、分化和成熟。例如，從牛脛骨松質(zhì)骨段提取的ECM 水凝膠可顯著地改善骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生存、伸展和增殖，并且促進(jìn)軟骨相關(guān)基因的表達(dá)和軟骨成體細(xì)胞的分化[28]。Nagao 等[29]將人腎皮質(zhì)通過(guò)理化手段制備成腎臟ECM 水凝膠，可模擬特異性細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境，為人腎小管周?chē)⒀軆?nèi)皮細(xì)胞的成熟和類(lèi)血管的形成創(chuàng)造良好的條件。另外，來(lái)源于豬真皮組織的ECM 水凝膠具有致密的纖維結(jié)構(gòu)和一定的機(jī)械強(qiáng)度，對(duì)促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞肌管的形成和成熟效果顯著[30]。過(guò)去的部分研究還只是利用ECM 水凝膠作為一種平臺(tái)或基質(zhì)，將獲取的細(xì)胞種植或包裹在ECM 水凝膠的表面或內(nèi)部，探究ECM 水凝膠本身或不同空間(二維或三維環(huán)境)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞行為的影響，進(jìn)而確定提取水凝膠的應(yīng)用潛能。但隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，科研人員已根據(jù)人體器官內(nèi)細(xì)胞的種類(lèi)和分布，將不同種類(lèi)的干細(xì)胞培養(yǎng)在特定ECM 水凝膠的三維環(huán)境中，進(jìn)而分化成具有多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的類(lèi)器官。這種類(lèi)器官一是可以作為組織再生、組織修復(fù)的理想細(xì)胞來(lái)源和成為多種疾病模型的治療工具。最早的類(lèi)器官，二是可以是通過(guò)在適當(dāng)?shù)?D 基質(zhì)水凝膠中擴(kuò)增小鼠和人類(lèi)腸道干細(xì)胞，形成腸類(lèi)器官[31]。隨后，研究人員利用豬黏膜下層ECM 水凝膠，三維培養(yǎng)SI 隱窩干細(xì)胞和胃隱窩干細(xì)胞，形成各種去細(xì)胞豬小腸黏膜內(nèi)胚層類(lèi)器官，包括肝臟、胰腺和小腸[32]。這些類(lèi)器官可穩(wěn)定維持其形態(tài)和相關(guān)蛋白的表達(dá)。同樣，Saheli 等[33]將3D 綿羊肝源性ECM 水凝膠以3∶2∶1的比例，共培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞、人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)功能性肝類(lèi)器官的生成和功能化。近年來(lái)，隨著3D 打印技術(shù)的發(fā)展，ECM 水凝膠也可作為一種生物墨水，影響細(xì)胞的命運(yùn)。Das 等[34]以心臟組織源性ECM 水凝膠為生物墨水，通過(guò)擠出打印，將原代心肌細(xì)胞均勻包裹于水凝膠的內(nèi)部，進(jìn)而加速心肌細(xì)胞的分化和成熟。

對(duì)于ECM 水凝膠調(diào)控細(xì)胞行為的作用機(jī)制，目前研究得較少。Tong 等[3]證實(shí)，軟骨ECM 水凝膠可通過(guò)Rho/ERK/TAZ 和Rho/JNK/TAZ 信號(hào)通路，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成成骨。另外，當(dāng)ECM 水凝膠整體剛度維持在100 Pa 時(shí)，人表皮干細(xì)胞內(nèi)的MAPK/ERK 信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)伸展和分化[35]。從豬主動(dòng)脈外膜提取的ECM 水凝膠，可刺激人內(nèi)皮細(xì)胞堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分泌，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的新生[36]。上述的報(bào)道初步顯示，ECM 水凝膠調(diào)控細(xì)胞行為與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活或因子的分泌密切相關(guān)。

3.2 在臨床前的應(yīng)用

ECM 水凝膠具有與天然組織相似的成分和屬性，因其具有優(yōu)越的生物相容性、生物降解性和滲透性，已被廣泛應(yīng)用于多種疾病模型的治療。目前，已有報(bào)道指出，將ECM 水凝膠加入某些活性因子或通過(guò)3D 打印技術(shù)增強(qiáng)其機(jī)械性能，進(jìn)而優(yōu)化ECM 水凝膠的生物活性和理化性能，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同疾病的個(gè)性化治療。本文主要針對(duì)ECM 水凝膠在4 種動(dòng)物模型損傷方面的療效進(jìn)行闡述，包括骨缺損、心肌梗塞、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)和外周神經(jīng)損傷(peripheral nerve injury，PNI)。

3.2.1 運(yùn)用于骨缺損的修復(fù)

骨缺損會(huì)導(dǎo)致較高的發(fā)病率，并嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。大多數(shù)骨組織工程策略是基于膜內(nèi)成骨，即骨質(zhì)內(nèi)部的間充質(zhì)干細(xì)胞直接分化為成骨細(xì)胞。雖然這是一種簡(jiǎn)單的促進(jìn)骨再生的方法，但再生骨的體積有限，因此不能應(yīng)用于大面積骨缺損的修復(fù)[37]。脫細(xì)胞骨組織材料具備天然的骨結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能，因此常被用作骨骼再生的潛在骨支架。例如，通過(guò)對(duì)豬軟骨組織進(jìn)行脫細(xì)胞和消化，構(gòu)建軟骨ECM 水凝膠，可顯著地促進(jìn)軟骨的形成[38]。將軟骨ECM 水凝膠涂抹在電紡聚己內(nèi)酯(ε-己內(nèi)酯)超細(xì)纖維支架的表面，能夠有效地支持間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化[39]。在完全脫細(xì)胞化的天然骨支架上培養(yǎng)人源性脂肪干細(xì)胞，可構(gòu)建有活性的骨組織結(jié)構(gòu)[40]。從骨膜細(xì)胞中提取細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠，可用于犬牙周組織缺損的移植，并適用于新形成的硬組織填充，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨缺損有效的修復(fù)[41]。一名58 歲女性脛骨遠(yuǎn)端出現(xiàn)72 mm 長(zhǎng)的骨缺損，用去細(xì)胞牛小梁骨間盤(pán)ECM 水凝膠填充后，其缺損骨得到了積極的修復(fù)，患者在術(shù)后6 周就能夠自由行走[42]。因此，由骨組織制備ECM 水凝膠，對(duì)于誘導(dǎo)骨再生和修復(fù)骨缺損具有巨大的潛能。

3.2.2 運(yùn)用于心肌梗塞的修復(fù)

心肌梗塞是由于冠狀動(dòng)脈狹窄，心肌供血、供氧不足而引起的心律失常、呼吸困難和胸痛，并伴有暈厥和死亡的發(fā)生。據(jù)估計(jì)，該病在美國(guó)每年新發(fā)91.5 萬(wàn)人，給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[43]。已有研究證實(shí)，心肌梗塞會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成缺血/缺氧，導(dǎo)致梗塞區(qū)域持續(xù)釋放大量的炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，破壞心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，并降解細(xì)胞周?chē)幕|(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡或壞死。目前，用心肌來(lái)源的ECM 水凝膠治療心肌梗死的研究報(bào)道較為廣泛，因?yàn)檫@種注射材料能夠組裝成一個(gè)納米纖維網(wǎng)絡(luò)，允許細(xì)胞遷移，并具有組織特異性，進(jìn)而有助于心臟組織的重構(gòu)。例如，豬心肌組織來(lái)源的ECM 水凝膠實(shí)現(xiàn)了傳導(dǎo)沖動(dòng)功能的長(zhǎng)期穩(wěn)定和血液供應(yīng)的改善，已成為心肌梗死治療的替代方案[44]。然而，運(yùn)用這種凝膠治療心肌梗死存在機(jī)械強(qiáng)度較小、降解快等問(wèn)題[45]。為了克服這些缺陷，Efraim 等[46]將殼聚糖與豬心肌組織來(lái)源的ECM 水凝膠進(jìn)行交聯(lián)，開(kāi)發(fā)出一種新型可注射ECM 水凝膠支架，在大鼠急性和慢性心肌梗死模型治療中，顯示出優(yōu)越的改善心臟組織再生的功效。此外，用生物ECM 水凝膠作為運(yùn)送間充質(zhì)干細(xì)胞的載體，可以有效增加缺血區(qū)血管新生的密度，提高心肌再生的能力，并減少瘢痕面積[47]。因此，在治療心肌梗塞的動(dòng)物模型中注射ECM 水凝膠，可顯示出良好的可行性、有效性和安全性。

3.2.3 運(yùn)用于SCI 的修復(fù)

SCI 是一種嚴(yán)重性的神經(jīng)創(chuàng)傷性疾病。由于受損的軸突在惡劣的環(huán)境中無(wú)法再生，常常會(huì)導(dǎo)致永久性的運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能障礙、肌張力異常及病理反射等相應(yīng)的病變。目前，臨床上對(duì)于該病的治療主要是運(yùn)用一些激素，聯(lián)合對(duì)癥治療性藥物，但療效有限。為克服這樣的瓶頸，研究人員嘗試將不同組織來(lái)源的ECM 水凝膠填充入嚙齒動(dòng)物的損傷脊髓空洞區(qū)，利用理化檢測(cè)和行為學(xué)評(píng)定，綜合評(píng)價(jià)ECM 水凝膠對(duì)SCI 的修復(fù)效果和可能的作用機(jī)制。例如，將豬脊髓脫細(xì)胞制備的ECM 水凝膠注射入大鼠脊髓半橫斷模型，8 周后的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該水凝膠能夠刺激新生血管形成和軸突向病灶內(nèi)生長(zhǎng)，同時(shí)體內(nèi)的免疫反應(yīng)和炎癥因子的表達(dá)顯著下調(diào)[48]。在SCI 的愈合過(guò)程中，注射豬腦ECM 水凝膠能降低巨噬細(xì)胞的數(shù)目并向M2型轉(zhuǎn)變，促進(jìn)皮層和海馬神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，降低脊髓的空腔面積，并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的明顯改善[49]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種減小脊髓空洞并促進(jìn)結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，以及ECM 水凝膠促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)線粒體ATP的產(chǎn)生，進(jìn)而加速微管在生長(zhǎng)錐內(nèi)的穩(wěn)定，和組裝密切相關(guān)[50]。另外，這些ECM 水凝膠也可與巨噬細(xì)胞膜表面的組胺受體相互作用，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)金屬基金蛋白酶-9，使纖維疤痕的形成變緩[14]?？傊?，生物組織來(lái)源的ECM 水凝膠在修復(fù)SCI 方面具有巨大的潛能。

3.2.4 運(yùn)用于PNI 的修復(fù)

在世界范圍內(nèi)，由交通事故、高空墜落、銳器切割等原因造成的PNI 發(fā)病率逐年升高，且在中青年中尤為常見(jiàn)。神經(jīng)損傷處的肢體感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)無(wú)法接受大腦的支配，造成患者的殘疾和癱瘓。目前，自體神經(jīng)移植仍然視為臨床手術(shù)修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在供體不足和神經(jīng)纖維瘤的形成，因此尋找其他的替代療法迫在眉睫。近年來(lái)，隨著組織工程的興起，ECM 水凝膠在修復(fù)PNI 的療效方面報(bào)道較多，因?yàn)檫@種水凝膠不僅為細(xì)胞的黏附提供了機(jī)械支持，而且創(chuàng)造了良好的微環(huán)境，有助于神經(jīng)缺損的恢復(fù)。例如，從小型豬身上制備的外周神經(jīng)基質(zhì)水凝膠培養(yǎng)雪旺細(xì)胞(schwann cells，SCs)，其生存和增殖水平顯著升高[51]。在體內(nèi)，該水凝膠可顯著地促進(jìn)SD 大鼠坐骨神經(jīng)15 mm 缺損區(qū)域，以及軸突的再生、髓鞘的形成和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。同樣地，Travis 等[23]從犬坐骨神經(jīng)提取異源性脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠，填充于神經(jīng)導(dǎo)管的內(nèi)部，并進(jìn)行齲齒動(dòng)物坐骨神經(jīng)缺損模型的修復(fù)。結(jié)果表明，該材料可提高巨噬細(xì)胞的侵襲，增加M2 巨噬細(xì)胞百分比，增強(qiáng)SCs 的遷移。此外，Shuai 等[52]將去細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)水凝膠與膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合，并利用硅管模具成功制備出去細(xì)胞神經(jīng)支架，將其應(yīng)用于beagle 犬50 mm 坐骨神經(jīng)缺損的修復(fù)。結(jié)果表明，這種神經(jīng)支架可以促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)和神經(jīng)組織的重塑。故從哺乳動(dòng)物坐骨神經(jīng)中提取生物ECM 水凝膠，能顯示多樣的結(jié)構(gòu)和功能特性，進(jìn)而促進(jìn)周?chē)窠?jīng)的再生。

3.3 產(chǎn)品在臨床上的應(yīng)用

從臨床角度來(lái)看，由同種或異種ECM 水凝膠制備的生物支架已被用于重建人類(lèi)各種病變或損傷的組織，包括皮膚、膀胱和神經(jīng)等。這些臨床運(yùn)用的ECM 水凝膠支架產(chǎn)品由來(lái)源不同物種的組織制成，如真皮、心臟、膀胱、小腸、心包膜等。表1列舉了部分臨床應(yīng)用的生物支架材料[53-55]，而這些產(chǎn)品在體內(nèi)修復(fù)的效果取決于來(lái)源的物種和組織、加工手段和終端滅菌方法等[55]。當(dāng)ECM 水凝膠支架植入體內(nèi)后，會(huì)出現(xiàn)逐步的降解并釋放出有效的生物活性基質(zhì)肽。這些肽可以在組織重塑過(guò)程中，促進(jìn)血管生成、趨化、有絲分裂和細(xì)胞分化[56]。另外，部分化學(xué)交聯(lián)的ECM 可以增加支架的強(qiáng)度，但會(huì)使自身的降解和相關(guān)基質(zhì)肽的釋放變緩[57]。因此，制備符合臨床標(biāo)準(zhǔn)的ECM 水凝膠支架，必須同時(shí)考慮其降解性和機(jī)械強(qiáng)度。

表1 由ECM 水凝膠制備的商業(yè)化活性生物支架Tab.1 Commercially active biological scaffolds prepared from ECM hydrogel

在臨床評(píng)估中，心肌細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠(標(biāo)識(shí)符:NCT02305602)能夠通過(guò)心臟注射導(dǎo)管，增強(qiáng)血管的細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌細(xì)胞的存活[58]。同時(shí)，研究表明，Avance?(AxoGen Inc.Alachua，F(xiàn)L)神經(jīng)移植物已用于修復(fù)人類(lèi)坐骨神經(jīng)的缺損，實(shí)現(xiàn)軸突的再生和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[59]。此外，從去細(xì)胞化和脫鈣骨中分離出的生物相容性水凝膠支架-Geistlich Mucograft?(Geistlich Pharma AG，Wolhusen，Switzerland)，可用于修復(fù)早期和中期軟骨膝關(guān)節(jié)缺損，并顯示良好的治療結(jié)果[60]。這些臨床水凝膠產(chǎn)品在再生醫(yī)學(xué)的廣泛應(yīng)用中有著共同的特點(diǎn):一是保留天然網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和生物活性分子，二是具有優(yōu)良的機(jī)械和結(jié)構(gòu)特征，三是具有生物降解性和溫度敏感性，四是易于填充不規(guī)則形狀的組織缺陷。從這個(gè)意義上說(shuō)，去細(xì)胞水凝膠提供了一種有效的治療方法，可指導(dǎo)缺損組織的再生，并實(shí)現(xiàn)組織器官移植的替代治療。

4 展望與挑戰(zhàn)

ECM 水凝膠為周?chē)?xì)胞提供了營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和生長(zhǎng)所需的微環(huán)境，故在器官發(fā)育、組織修復(fù)和傷口愈合過(guò)程中起著重要的作用。事實(shí)上，以ECM 水凝膠為基礎(chǔ)材料，可進(jìn)行不同的設(shè)計(jì)或改良。常見(jiàn)的設(shè)計(jì)是將該材料灌注于磨具中，制成特定結(jié)構(gòu)的支架或?qū)Ч?；另一個(gè)重要的設(shè)計(jì)是將材料與活性因子或干細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合，進(jìn)而增強(qiáng)水凝膠的生物活性。隨著3D 打印技術(shù)的發(fā)展，以ECM 水凝膠為墨水打印出的仿生結(jié)構(gòu)，成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的一種很有前途的應(yīng)用產(chǎn)品。因此，ECM 水凝膠在組織工程中的應(yīng)用，可能成為未來(lái)再生醫(yī)學(xué)的前沿。

但是，對(duì)于ECM 水凝膠的臨床應(yīng)用，仍有許多問(wèn)題需要解決，主要包括去細(xì)胞和滅菌方法的標(biāo)準(zhǔn)化、生物大分子的保存、水凝膠支架的設(shè)計(jì)和加工。為此，提出一系列解決方案:

1)ECM 水凝膠的組成和結(jié)構(gòu)受脫細(xì)胞前的組織器官影響，所以選擇合適的去細(xì)胞方法至關(guān)重要。理想的去細(xì)胞方法應(yīng)該是去除最大的細(xì)胞殘留物，避免移植后的宿主免疫排斥，同時(shí)又保留ECM 水凝膠的有益成分和完整的超微結(jié)構(gòu)。

2)脫細(xì)胞后，可對(duì)ECM 水凝膠進(jìn)行修飾，以獲得更好的治療效果。例如，ECM 水凝膠可加入一些細(xì)胞因子，或特異性的祖細(xì)胞/多能干細(xì)胞。

3)涉及人的ECM 水凝膠所引起的生命倫理問(wèn)題必須引起重視。盡管生物工程器官的需求量巨大，但研究人員仍應(yīng)堅(jiān)持其具有足夠的生物安全性和生物有效性，并遵守臨床試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

總之，ECM 水凝膠的臨床應(yīng)用充滿了機(jī)遇和挑戰(zhàn)。深入了解組織再生的細(xì)胞和分子機(jī)制，提高對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的認(rèn)識(shí)，將有助于生物ECM 水凝膠在組織工程中的進(jìn)一步發(fā)展。