PLINs：參與脂解的脂滴相關(guān)蛋白

王宇祥，鄒亦沖，王鑫雨，劉 捷，龐永佳

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030；3.黑龍江省普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，哈爾濱 150030）

白色脂肪組織（White adipose tissue，WAT）是脂肪組織主要類型，其主要功能是控制機體能量平衡，在能量過剩時儲存三酰甘油（Triacylglycerol，TAG），在能量匱乏時調(diào)動TAG，同時也扮演內(nèi)分泌和副內(nèi)分泌器官角色[1]。脂肪組織中含有大量脂肪細胞，調(diào)控脂質(zhì)儲存和脂解。脂肪細胞形成分為兩個階段，第一階段間充質(zhì)干細胞分化為脂肪祖細胞并進一步形成前脂肪細胞，第二階段前脂肪細胞經(jīng)克隆增殖和終末分化，轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒熘炯毎鸞2]。成熟脂肪細胞內(nèi)含有一個大脂滴（Lipid droplets，LDs），脂滴中心是一個中性脂核，脂核內(nèi)含有大量TAG和膽固醇酯（Cholesteryl ester，CE），外面由磷脂單層包裹，并鑲嵌多種蛋白質(zhì)[3-5]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究已確定脂滴中200多種蛋白成分，其中一些成分僅定位于脂滴，其余成分同時定位于脂滴及細胞質(zhì)或其他細胞器中。脂滴包被蛋白家族（Perilipins，PLINs）是脂滴表面含量最多的蛋白，通過與脂滴表面特異性位點結(jié)合，調(diào)節(jié)脂類儲存和水解。截至目前，在哺乳動物細胞中尚未發(fā)現(xiàn)缺乏PLINs的脂滴，機體各細胞中儲存中性脂質(zhì)，均表達兩個或更多PLINs蛋白家族成員[6]，可見，此家族蛋白在機體脂類代謝中具有重要作用。本文從PLINs家族成員發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)、表達特征，以及在脂解過程中作用等方面展開綜述，旨在為PLINs深入研究提供參考。

1 PLINs發(fā)現(xiàn)

1991年，Greenberg在大鼠脂肪細胞脂滴周圍發(fā)現(xiàn)一種未知蛋白質(zhì)，命名為Perilipin，同時發(fā)現(xiàn)Perilipin具有調(diào)節(jié)TAG沉積和水解作用[7]；隨后，Jiang等在脂肪細胞分化過程中發(fā)現(xiàn)脂肪分化相關(guān)蛋白（Adipose differentiation-related protein，ADRP；或稱Adipophilin）[8-9]，Díaz等在酵母雙雜交篩選中鑒定出47 ku的尾連蛋白（Tail-interacting protein of 47 ku，Tip47）[10]；2003年，研究者們又發(fā)現(xiàn)一種可誘導(dǎo)脂肪細胞分化的蛋白質(zhì)：S3-12，其中一部分結(jié)構(gòu)類似Perilipin蛋白[11]；2006年，最后一個家族成員—心肌脂滴蛋白（Myocardial LD protein，MLDP）在小鼠體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[12-13]。這5個蛋白含有相似氨基酸序列，且在不同物種之間（如果蠅和小鼠）存在保守的外顯子-內(nèi)含子邊界，具有較近親緣關(guān)系，可歸類為同一蛋白家族。因此，研究者按照發(fā)現(xiàn)順序?qū)⑵湟来蚊麨镻LIN1-5[14]。PLINs家族成員基本信息見表1[15]。

2 PLINs結(jié)構(gòu)與表達

PLINs家族結(jié)構(gòu)具有高度保守性。在哺乳動物中，PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN5擁有相同疏水PAT結(jié)構(gòu)域（由前3個蛋白首字母命名）和11聚體重復(fù)序列；而PLIN4缺少PAT結(jié)構(gòu)域，但其擁有更多11聚體重復(fù)序列，且多肽長度幾乎是其他PLIN蛋白3倍（見圖1）[15]。

研究表明，PLINs通過11聚體重復(fù)序列與脂質(zhì)結(jié)合，形成類似alpha螺旋結(jié)構(gòu)（Amphipathic helices，AHs）[16-17]，有利于PLINs與脂滴或微粒結(jié)合。在哺乳動物中，PLIN1-5由5個單拷貝基因編碼各自PLIN蛋白[18]，PLINs氨基酸序列的對比結(jié)果表明，PLIN2和PLIN3總體相似度最高[19]，在哺乳動物細胞和組織中廣泛表達。PLIN5氨基酸序列與PLIN2、PLIN3氨基酸序列在整體上具有相似性，但PLIN5主要在褐色脂肪組織、心肌和骨骼肌中表達，還有一小部分在肝臟組織中表達，并在脂肪分解過程中將脂肪輸送到線粒體進行氧化[20]。PLIN1與PLIN2、PLIN3和PLIN5序列相似之處主要在氨基末端，而羧基末端與其他家族成員無明顯相似性；PLIN1僅在白色和棕色脂肪組織的脂肪細胞中大量表達，在腎上腺皮質(zhì)、睪丸和卵巢類固醇生成細胞中表達水平較低[21]。PLIN4氨基酸序列與其他成員差異最大，其11聚體重復(fù)序列擴展氨基末端與其他家族成員相似性有限，這些重復(fù)序列也可折疊成AHs結(jié)構(gòu)，有利于將新生蛋白特異性地靶向到脂滴[17]；PLIN4在白色脂肪組織中表達水平最高，在心肌和骨骼肌中表達水平較低。在亞細胞定位方面，PLIN1和PLIN2主要定位于脂滴，而PLIN3、PLIN4、PLIN5則定位于細胞質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)富集區(qū)[22-23]。

3 PLINs參與中性脂質(zhì)的脂解

TAG和CE是脂滴內(nèi)能量儲存的主要成分。脂滴在機體能量匱乏或需脂肪酸（Fatty acid，F(xiàn)A）和膽固醇時調(diào)動TAG和CE，利用脂肪酶將其水解為甘油、膽固醇、FA等物質(zhì)并釋放能量。脂肪酶包括脂肪甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride Lipase，ATGL）、激素敏感型脂肪酶（Hormone-sensitive lipase，HSL）、脂蛋白脂酶（Lipoprotein lipase，LPL）、單酰甘油脂肪酶（Monoacylglycerol lipase，MGL）等[24]。而作為脂滴表面含量最多的蛋白，PLINs通過與脂肪酶互作調(diào)控脂滴內(nèi)中性脂質(zhì)存儲和脂解，從而通過代謝達到為機體儲存或提供能量的目的。

3.1 PLIN1

PLIN1對脂滴形成具有雙向調(diào)節(jié)作用。一方面，在基礎(chǔ)（飼喂）狀態(tài)下，PLIN1包被在脂滴表面，充當(dāng)中性脂質(zhì)保護屏障，發(fā)揮抑制脂解作用。ATGL（又稱Patatin-like phospholipase domain containing-2，PNPLA2）是機體脂解反應(yīng)第一步過程中的關(guān)鍵脂肪酶，其功能發(fā)揮需與激活因子α/β水解酶結(jié)構(gòu)域蛋白5（α/βHydrolase domain containingprotein 5，ABHD5）結(jié)合。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，PLIN1受ABHD5長鏈酰基輔酶A（LC-CoA）的變構(gòu)調(diào)節(jié)后，與之相結(jié)合，從而抑制ABHD5與PNPLA2結(jié)合[25]；同時，PNPLA（Phospholipase domain containing）脂肪酶家族的另外一個成員—PNPLA3（Patatinlike phospholipase domain containing-3）可與PNPLA2競爭結(jié)合，促使PNPLA2與ABHD5分離，這些作用限制PNPLA2活性，進而抑制脂解。另一方面，在空腹或鍛煉情況下，PLIN1可被蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）高度磷酸化而有利于脂肪酶接近脂滴表面，促進脂解作用。在此狀態(tài)下，腎上腺素（Adrenaline）和去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）與脂肪細胞膜上的β-腎上腺素受體（βadrenergic receptors，β-AR）結(jié)合，啟動G蛋白介導(dǎo)的信號通路，激活腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclase，AC），增加細胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平。cAMP升高觸發(fā)四聚體PKA調(diào)控亞基釋放，進而激活催化亞基[26]。隨后，PKA磷酸化脂解復(fù)合物大部分組分。在受刺激的脂肪細胞中，磷酸化程度最高的脂滴相關(guān)蛋白即PLIN1[27]。PLIN1磷酸化釋放ABHD5，使其與PNPLA2相互作用，水解TAG形成二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）；PKA還可磷酸化HSL促進其自身轉(zhuǎn)運到脂滴并與PLIN1相互作用，水解DAG形 成 單酰甘油（Monoacylglycerol，MAG）；MAG再被MGL進一步水解為FA和甘油，完成脂解（見圖2）[28]。PLIN1對脂滴融合也具有一定促進作用。研究表明，PLIN1可與Fsp27（Fat-specific protein 27）的CIDE-N結(jié)構(gòu)域相互作用，通過改變Fsp27構(gòu)象促進大脂滴形成[29]。此外，PLIN1還參與機體能量代謝，對肥胖、炎癥反應(yīng)、脂肪營養(yǎng)不良等疾病發(fā)生和發(fā)展具有重要影響[30]。

3.2 PLIN2

PLIN2最初被命名為脂肪分化相關(guān)蛋白，說明PLIN2在脂肪細胞分化早期具有誘導(dǎo)分化作用。PLIN2存在于前脂肪細胞中，在分化為成熟脂肪細胞過程中被PLIN1取代，且PLIN2僅與脂滴特異性結(jié)合，而在脂滴脂解或缺失情況下PLIN2迅速降解。Gao等研究發(fā)現(xiàn)，過表達PLIN2可誘導(dǎo)COS-7細胞和成纖維細胞中脂滴積聚[31]，而敲除Plin2基因的小鼠對飲食誘導(dǎo)的肥胖、脂肪肝和酒精誘導(dǎo)的脂肪變性具有抵抗力，表明PLIN2參與脂質(zhì)積累調(diào)控，這種作用在肝臟中尤為明顯[32]。Nocetti等研究發(fā)現(xiàn)，長期飼喂高脂飼料導(dǎo)致小鼠患胰島素抵抗和非酒精性脂肪性肝病，同時小鼠肝細胞脂滴中PLIN2表達明顯增加[33]。研究表明PLIN2與肝臟中脂滴形成密切相關(guān)。此外，PLIN2也具有調(diào)節(jié)脂解的作用，但不受PKA激活影響[34]。

3.3 PLIN3

哺乳動物PLIN3和PLIN2具有相似氨基酸序列，且廣泛分布于各種組織中。Wolins等研究表明，PLIN3是第一個具有在細胞質(zhì)和脂滴表面之間轉(zhuǎn)移能力的PLINs家族蛋白[35]。現(xiàn)階段對于PLIN3功能知之甚少，尚未有Plin3基因敲除小鼠模型的報道。但Carr等研究表明，當(dāng)使用反義寡核苷酸抑制PLIN3在小鼠體內(nèi)表達時，肝臟和血清中TAG水平降低[36]；當(dāng)抑制PLIN3在HeLa細胞中表達時，TAG儲存減少，而FA生成未受影響[37]，表明PLIN3在儲存TAG方面具有一定作用。但也有研究表明，抑制PLIN3在小鼠AML12肝癌細胞中表達并未減少TAG儲存，僅是脂滴變小并被PLIN2包裹；而將PLIN2和PLIN3表達均抑制后，TAG儲存減少，細胞內(nèi)的脂滴數(shù)量更少，但體積更大[38]。表明PLINs可能還具有表面活性物質(zhì)的性質(zhì)，當(dāng)其不包被在脂滴表面時，促進脂滴通過融合減小表面積。

3.4 PLIN4

PLIN4是PLINs中最特殊的蛋白，擁有較其他PLINs成員更長的AHs區(qū)，該結(jié)構(gòu)在體外已被證明可直接與TAG結(jié)合[39]。在細胞中，PLIN4可修復(fù)由于卵磷脂（Phosphatidylcholine，PC）生物合成中限速酶CCTα耗盡，細胞中PC含量下降而導(dǎo)致的脂滴形態(tài)缺陷。結(jié)果表明，PLIN4是直接與脂滴中性脂質(zhì)核心結(jié)合而不是磷脂，從而作為脂滴表面活性物質(zhì)覆蓋于脂滴表面發(fā)揮作用[39]。Nimura等研究發(fā)現(xiàn)PLIN4還參與脂肪細胞分化。在人骨髓間充質(zhì)干細胞（HMSCs）分化后，PLIN4出現(xiàn)在脂肪細胞中；且在人類脂肪細胞分化早期階段，PLIN2表達短暫增加，但在分化后期則被PLIN1和PLIN4取代[40]。

3.5 PLIN5

PLIN5已被證明可參與調(diào)解氧化組織中的基礎(chǔ)脂解[41]。Kuramoto等建立Plin5基因敲除小鼠，并報道PLIN5在為肌肉細胞線粒體提供能量方面的核心作用。在這項研究中，研究者在高倍電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，敲除Plin5基因小鼠的心肌中未觀察到脂滴，而禁食后小鼠的比目魚肌肌管內(nèi)可見少量脂滴；敲除Plin5基因小鼠的身體狀況正常，但對耐力運動不耐受[42]。這些數(shù)據(jù)表明，肌肉中脂滴作為FA儲存庫和分配者發(fā)揮供能作用。

PLIN5還具有促進脂滴和線粒體耦聯(lián)的作用。研究者通過脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）激活小鼠干細胞，并提取脂滴觀察脂滴對大腸桿菌細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLIN5在LPS刺激后表達水平下降。這是因為線粒體是機體先天免疫細胞器，脂滴接觸線粒體可為線粒體提供FA，促進氧化磷酸化；但在線粒體免疫激活情況下，先天免疫細胞更需要糖酵解而非氧化磷酸化；因此細胞下調(diào)PLIN5表達量促進脂滴和線粒體解耦聯(lián)，減少氧化磷酸化。值得關(guān)注的是，在此過程中細胞PLIN2表達水平上升，暗示PLIN2與免疫功能相關(guān)[43-44]。

4 PLINs參與自噬脂解

在脂肪細胞中，PLINs通過脂肪酶和脂滴調(diào)節(jié)蛋白相互作用調(diào)控脂解，脂肪酶參與動員脂肪TAG的儲存和脂解[45]。ATGL和HSL等脂肪酶缺失、敲除或藥物抑制會降低大部分脂肪酶活性，并嚴重影響FA在脂質(zhì)水解中的釋放，影響脂質(zhì)代謝循環(huán)[46]。然而，在非脂肪組織中，其他中性脂肪酶也可對儲存在脂滴中的TAG分解代謝，這表明可能存在不同分子機制動員脂肪細胞內(nèi)TAG儲存和脂解[47]，如自噬脂解即通過溶酶體降解中性脂質(zhì)達到調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用。自噬最初被認為是饑餓期間蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和氨基酸循環(huán)的途徑，最新研究發(fā)現(xiàn)自噬還有助于脂質(zhì)代謝和脂滴分解代謝[48]。到目前為止，已確定兩種自噬過程類型參與脂滴生成和脂解，分別是巨型細胞自噬（Macrolipophagy）和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperone-mediated autophagy，CMA）。這兩種類型的自噬均需識別脂滴并為脂滴表面提供一個動態(tài)界面，該動態(tài)界面含有與脂類代謝和運輸有關(guān)的蛋白質(zhì)，以促進自噬蛋白在自噬過程中與溶酶體上相關(guān)組件對接[49-50]。鑒于PLINs在脂滴上的豐富性、對脂滴相對特異性定位及其在協(xié)調(diào)“經(jīng)典”脂解過程中的重要作用，可合理推測PLINs在自噬脂解調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用。

4.1 PLINs與巨型細胞自噬

巨型細胞自噬首先是細胞質(zhì)中被稱為吞噬體或隔離膜的膜池可將自噬目標隔離成一個雙膜自噬小體，自噬小體通過其外膜與溶酶體限制膜融合，將隔離的自噬目標轉(zhuǎn)移到溶酶體內(nèi)，完成降解[51]。脂滴被識別為自噬目標并被自噬小體隔離的機制尚不清楚，但小GTPase家族的Rab7（Ras-associated binding）與脂滴表面的結(jié)合被認為是啟動脂肪細胞和肝細胞“吞脂”作用的早期步驟[52]。在培養(yǎng)的3T3-L1脂肪細胞中，Rab7與PLIN1包被的脂滴在非刺激（基礎(chǔ)）條件下結(jié)合較少，但在β-腎上腺素能受體刺激下Rab7與PLIN1包被的脂滴結(jié)合增加，隨后激活PKA和PLIN1磷酸化。Rab7與脂滴的這種募集不是通過與PLIN1相互作用介導(dǎo)。相反，PLIN1敲除增加Rab7和溶酶體結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明，未磷酸化的PLIN1阻斷Rab7與脂滴對接，因此在抑制脂質(zhì)體吞噬方面起保護作用，而磷酸化誘導(dǎo)的PLIN1構(gòu)象改變使Rab7可重新聚集到脂滴中，使脂滴與溶酶體結(jié)合[53]，促進脂解。PLIN2和PLIN5也可保護儲存的中性脂質(zhì)免受胞液脂肪酶影響。Tsai等研究發(fā)現(xiàn)，過表達PLIN2可保護肝臟脂滴免受自噬脂解，而小鼠肝臟中缺乏PLIN2，TAG儲存量比野生型小鼠少[54]。

4.2 PLINs與分子伴侶介導(dǎo)的自噬

與巨型細胞自噬不同，分子伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA）是細胞器（包括脂滴）普遍循環(huán)過程，其作用是通過CMA受體溶酶體相關(guān)膜蛋白2A（Lysosome-associated membrane protein type 2A，LAMP-2A）降解運輸?shù)饺苊阁w膜的特定蛋白來實現(xiàn)。CMA底物蛋白中含有一個五肽基序KFERQ，該基序選擇性地被細胞質(zhì)中70 ku熱休克同源蛋白（Heat shock cognate protein of 70 ku，hsc70）識別并結(jié)合，再與L-2A相互作用，將蛋白輸入溶酶體中降解[55]。最近研究表明，在營養(yǎng)供應(yīng)有限條件下，分子伴侶介導(dǎo)的自噬是從脂滴中去除PLIN2和PLIN3的主要機制；小鼠PLIN2和PLIN3分別含有與CMA相關(guān)的SLKVQ和LDRLQ五肽序列，當(dāng)PLIN2五肽序列突變?yōu)镾LKAA時，hsc70與脂滴上PLIN2的結(jié)合幾乎被消除[55-56]；突變的PLIN2隨后滯留在脂滴上，通過減少ATGL等脂肪酶與脂滴關(guān)聯(lián)來減弱“經(jīng)典”脂解作用，同時也減少巨型細胞自噬引起的多種蛋白質(zhì)受體在脂滴上募集，從而減少自噬脂解。相反，通過CMA從脂滴中去除PLIN2和PLIN3可促進“經(jīng)典”脂解和自噬脂解，此過程如圖3所示[57]。

圖3 CMA通過降解PLIN2和PLIN3調(diào)控脂解[57]Fig.3 CMA regulates lipolysis by degrading PLIN2 and PLIN3

5 展望

近30年研究已揭開PLINs調(diào)控脂類物質(zhì)生成和分解機制的面紗，但大多數(shù)調(diào)控脂解相關(guān)機制研究均集中在PLIN1，對于家族中其他成員研究較少。深入了解PLINs其他成員功能，有利于更好理解非脂肪脂滴在全身能量穩(wěn)態(tài)和代謝性疾病中作用，有助于解決肥胖、脂肪過度沉積、胰島素抵抗和免疫性疾病等難題。PLINs在細胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其家族成員在儲存脂質(zhì)方面的功能較復(fù)雜，涉及多種分子機制和多個細胞內(nèi)位點。此外，PLINs在不同物種上研究進展不一致，如在家禽脂質(zhì)代謝中作用機制研究剛剛起步[58-59]，深入探究PLINs在家禽脂質(zhì)代謝過程中功能，有助于控制家禽體內(nèi)脂肪過度蓄積，推動家禽業(yè)向經(jīng)濟、綠色方向發(fā)展。