茶多酚對乳鴿十二指腸形態(tài)發(fā)育、抗氧化功能和緊密連接蛋白基因mRNA表達(dá)的影響

付 晶，鄧 珊，陳艾玲，黃燕華,3*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院健康養(yǎng)殖創(chuàng)新研究院，廣州 510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣州 510225；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗室，廣州 510640）

鴿子屬于晚成鳥，但與雞、鴨、鵝等家禽相比，其生長速度非常快，28日齡體重達(dá)到剛出殼時25倍以上。乳鴿快速增長除與親鴿提供高營養(yǎng)鴿乳有關(guān)，還與其特有的消化生理功能，尤其是腸道功能緊密相關(guān)[1]。目前我國養(yǎng)鴿業(yè)已成為繼雞、鴨、鵝以外第四主流家禽產(chǎn)業(yè)。但規(guī)?；a(chǎn)仍面臨諸多瓶頸問題，尤其是“飼料禁抗”以來，鴿腸道健康問題日益突出。因此，在畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型升級、畜禽標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖模式持續(xù)推進(jìn)大形勢下，開發(fā)功能性飼料添加劑對維持鴿腸道健康具有現(xiàn)實(shí)意義[2]。

茶多酚（Tea polyphenols，TP）是一類從茶葉中提取的多羥基酚類物質(zhì)總稱，其主要成分為兒茶素類、花色苷類、黃酮類和酚酸等化合物，具有抗氧化、抑菌和維持腸道健康等功能[3]。茶多酚作為功能性飼料添加劑在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛[4-6]，但其發(fā)揮生物學(xué)特性內(nèi)在機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。目前，茶多酚對鴿腸道健康影響的研究未見報道，本試驗通過向親鴿飼糧添加不同劑量茶多酚，旨在觀察其對乳鴿十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)、抗氧化功能以及腸道緊密連接相關(guān)基因表達(dá)量的影響，以期為茶多酚在養(yǎng)鴿生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及材料

試驗仔鴿和基礎(chǔ)飼糧均由廣州市厚德鴿養(yǎng)殖有限公司提供；純度98.9%茶多酚購自成都華高生物有限公司。

1.2 試驗設(shè)計與試驗飼糧

試驗采用單因素隨機(jī)分組設(shè)計。選取初始體重一致、健康1日齡仔鴿240只，隨機(jī)分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)10只仔鴿。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，茶多酚低、中和高劑量組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加100、200和400 mg·kg-1茶多酚。根據(jù)鴿子采食習(xí)性并結(jié)合養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)際，基礎(chǔ)飼糧由70%原糧和30%顆粒料組成，原糧和顆粒料組成及營養(yǎng)水平見表1和2。所有試驗仔鴿均由青年種鴿（法國白卡鴿×深王鴿）以“2+2”模式哺喂至28日齡。

表1 基礎(chǔ)飼糧中原糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levelsof raw grain in basic diet（Air-dry basis,%）

表2 基礎(chǔ)飼糧中顆粒料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table2 Composition and nutrient levelsof thepelleted feed in basic diet（Air-dry basis,%）

1.3 樣本采集

在仔鴿飼養(yǎng)至28 d時，每個重復(fù)隨機(jī)選取2只頸靜脈放血處死，在冰上用預(yù)冷刀片、鑷子采集乳鴿十二指腸組織，經(jīng)預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，一部分固定于福爾馬林溶液中用于腸道組織形態(tài)發(fā)育觀察；一部分保存于-80℃超低溫冰箱，用于腸道組織抗氧化功能和與腸道通透性相關(guān)基因mRNA表達(dá)量檢測。

1.4 十二指腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

采集固定在福爾馬林中的十二指腸組織塊經(jīng)水洗、制片（脫水、透明、包埋、修塊、切片）、HE染色等過程制成腸道黏膜組織切片，在光鏡下觀察腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)（腸道絨毛和隱窩），并拍照記錄。利用軟件Image-Pro Plus 6.0測量絨毛高度（Villous height）、隱窩深度（Crypt depth），計算絨隱比（V/C）。

1.5 十二指腸抗氧化功能檢測

準(zhǔn)確稱取0.1 g十二指腸組織置于冰塊上，按1∶9（W∶V）加入預(yù)冷PBS，使用組織破碎儀將其充分破碎后，于4℃離心機(jī)3 000 r·min-1離心20 min，取上清液制備十二指腸組織勻漿、備用。

總抗氧化能力（Total antioxidant capacity,TAOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、總超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）活力、丙二醛（Maleic dialdehyde，MDA）含量和乳酸脫氫酶（Lactic dehydrogenase，LDH）活力均按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書測定。

1.6 十二指腸抗氧化酶和緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA表達(dá)量檢測

1.6.1 RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法按照參考文獻(xiàn)提取鴿十二指腸組織中總RNA[7]。超微量分光光度計測定RNA濃度及純度。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄說明書將提取的純度較高、完整性較好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將得到的cDNA置于-20℃冰箱用于后續(xù)試驗。

1.6.2 引物合成與熒光定量PCR（qPCR）

使用Oligo Primer Analysis軟件（版本6.0）根據(jù)GenBank中檢索相關(guān)基因序列和文獻(xiàn)[8-9]設(shè)計引物，并由上海生工生物工程股份有限公司作引物合成。引物序列如表3所示。

表3 引物序列Table3 Primerssequences

Realtime PCR采用SYBR Green熒光染料法。按PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒使用說明書進(jìn)行。每個樣品作3個重復(fù)，以β-actin為內(nèi)參，作基因mRNA表達(dá)水平相對定量分析，最后采用2-ΔΔCt法計算，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct參照基因）處理組-（Ct目的基因-Ct參照基因）對照組。

1.7 統(tǒng)計與分析

利用Excel 2019初步整理數(shù)據(jù)，采用Graph-Pad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)作單因素方差分析（One-Way ANOVA），并采用Tukey′s multiple comparisons test作多重比較，P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對乳鴿十二指腸黏膜形態(tài)的影響

如圖1和表4所示，與對照組相比，添加中劑量茶多酚極顯著提高乳鴿十二指腸絨毛高度、隱窩深度和絨隱比（P＜0.01）；添加高劑量茶多酚極顯著提高乳鴿十二指腸絨毛高度，降低隱窩深度（P＜0.01）；但添加低劑量茶多酚對乳鴿十二指腸絨毛高度、隱窩深度和絨隱比均無顯著影響（P＞0.05）。

表4 茶多酚對乳鴿十二指腸形態(tài)發(fā)育的影響Table4 Effectsof tea polyphenolson duodenal morphology development of squabs

圖1 茶多酚對乳鴿十二指腸組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Effects of tea polyphenols on duodenal morphology of squabs

2.2 茶多酚對乳鴿十二指腸抗氧化功能的影響

由表5可知，與對照組相比，添加低劑量茶多酚極顯著降低乳鴿十二指腸MDA含量（P＜0.01）；添加中劑量茶多酚極顯著降低乳鴿十二指腸MDA含量和LDH活性（P＜0.01）；添加高劑量茶多酚極顯著提高乳鴿十二指腸T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性，并降低MDA含量和LDH活性（P＜0.01）。

表5 茶多酚對乳鴿十二指腸抗氧化能力的影響Table 5 Effectsof tea polyphenols on antioxidant capacity in duodenum of squabs

由圖2可知，與對照組相比，添加3個劑量的茶多酚均極顯著提高仔鴿十二指腸SOD2基因mRNA表達(dá)量（P＜0.01）；添加高劑量茶多酚還極顯著提高CAT基因mRNA表達(dá)量（P＜0.01）。本研究結(jié)果進(jìn)一步從分子水平證實(shí)茶多酚提高仔鴿十二指腸抗氧化能力。

圖2 茶多酚對乳鴿十二指腸抗氧化酶基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of tea polyphenols on mRNA expression of antioxidase genes of squabs

2.3 茶多酚對乳鴿十二指腸緊密連接蛋白基因mRNA表達(dá)量的影響

由圖3可知，與對照組相比，添加低劑量茶多酚極顯著提高仔鴿十二指腸Occludin基因、降低Claudin-2基因mRNA表達(dá)量（P＜0.01）；添加中劑量茶多酚極顯著提高仔鴿十二指腸Occludin、ZO-1基因，降低Claudin-2基因mRNA表達(dá)量（P＜0.01）；添加高劑量茶多酚極顯著提高仔鴿十二指腸Occludin和ZO-1基因mRNA表達(dá)量（P＜0.01）、顯著提高Claudin-3基因mRNA表達(dá)量（P＜0.05），并極顯著降低Claudin-2基因mRNA表達(dá)量（P＜0.01）。

圖3 茶多酚對乳鴿十二指腸緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of tea polyphenols on mRNA expression of tight junction protein genesof squabs

3 討 論

在集約化家禽生產(chǎn)中腸道負(fù)荷經(jīng)常被推到極限，腸道因特有的血管解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及對流氧交換機(jī)制而成為發(fā)生氧化損傷的靶器官[10]。因此，尋找提高家禽腸道抗氧化能力的方法是保證家禽腸道健康的途徑之一。

腸道形態(tài)是衡量腸道健康重要指標(biāo)，絨毛高度和隱窩深度分別是衡量腸道消化吸收功能和細(xì)胞成熟率主要指標(biāo)。小腸絨毛變長、隱窩變淺說明絨毛發(fā)育良好，吸收能力增強(qiáng)，絨毛高度和隱窩深度可反映小腸功能狀態(tài)，絨隱比例越大說明腸上皮表面積越大，黏膜完整性越好，腸道消化吸收能力越強(qiáng)[11]。十二指腸是鴿子最先接觸食物的腸段，其“U”形結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可保證食物在小腸停留足夠時間，使鴿子充分消化吸收食物。本研究表明添加一定劑量茶多酚極顯著促進(jìn)乳鴿十二指腸絨毛增長、絨隱比增高（P＜0.01），其中200 mg·kg-1添加量效果最好。郝洋洋研究表明，向肉雞飼糧添加400 g·T-1茶多酚極顯著增加35日齡肉雞空腸絨毛高度[12]。Khalaji等研究表明，日糧中添加山茶提取物顯著提高肉雞腸道絨毛高度和隱窩深度，保護(hù)腸道屏障完整性[13]。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報道相似，證明茶多酚可以改善鴿子腸道形態(tài)發(fā)育，對維護(hù)乳鴿十二指腸機(jī)械屏障有一定促進(jìn)作用。

腸道細(xì)胞間緊密連接是構(gòu)成腸道組織機(jī)械屏障功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在調(diào)節(jié)腸道通透性和維持腸上皮細(xì)胞機(jī)械屏障中發(fā)揮至關(guān)重要作用[14]。家禽養(yǎng)殖中許多腸道疾病發(fā)生發(fā)展均與腸道組織機(jī)械屏障功能有關(guān)[15]。為進(jìn)一步驗證茶多酚對乳鴿腸道機(jī)械屏障的影響，本試驗從分子水平檢測乳鴿十二指腸組織中腸道緊密連接蛋白基因mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，飼糧添加一定劑量茶多酚極顯著提高乳鴿十二指腸組織中Occludin、ZO-1、Claudin-3基因mRNA表達(dá)量，極顯著降低Claudin-2基因mRNA表達(dá)量（P＜0.01）。Occludin是重要跨膜蛋白，主要負(fù)責(zé)調(diào)控緊密連接的通透性和維持細(xì)胞極性，其減少或缺失引起腸上皮細(xì)胞間隙通透性增加[16]。ZO-1作為腸道機(jī)械屏最重要的緊密連接蛋白，可維持緊密連接結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[17]。Claudin蛋白是構(gòu)成緊密連接的關(guān)鍵蛋白，參與緊密連接形成。Claudin-2則與上皮細(xì)胞旁孔形成、陽離子通透及水分轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)[18]，在炎性腸病中claudin-2表達(dá)量顯著升高，進(jìn)而增加細(xì)胞旁細(xì)胞通透性水平，降低上皮屏障緊密度[19]。claudin-3可緊密收縮以降低細(xì)胞旁通透性，當(dāng)其表達(dá)量降低時家禽腸道通透性增強(qiáng)[20]。ZO、Claudin、Occludin家族及細(xì)胞骨架蛋白共同維持緊密連接完整性。王元紅等發(fā)現(xiàn)綠茶粉可增加小鼠腸上皮緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin蛋白相對表達(dá)量[21]。朱晟易等研究表明，綠茶通過上調(diào)Occludin和ZO-1 mRNA表達(dá)，增強(qiáng)大鼠小腸上皮細(xì)胞間緊密連接，進(jìn)一步阻止內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)[22]。張雨晨研究表明，綠茶粉對小鼠回腸組織ZO-1和OccludinmRNA相對表達(dá)量均有顯著影響，說明綠茶粉通過增加小鼠腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)增強(qiáng)小鼠腸道上皮細(xì)胞緊密連接[23]。本研究結(jié)果與上述研究一致，即適宜劑量茶多酚可使乳鴿十二指腸Occludin、ZO-1、Claudin-3基因表達(dá)量升高、Claudin-2表達(dá)量下降時，有效提高腸壁完整性，維持腸道正常通透性并降低腸道發(fā)生損傷的可能性。這也進(jìn)一步證實(shí)茶多酚對維持腸道正常的機(jī)械屏障功能具有積極作用。

鴿子在養(yǎng)殖過程中受溫度、免疫、運(yùn)輸?shù)雀鞣N應(yīng)激時，機(jī)體內(nèi)抗氧化-過氧化體系平衡遭到破壞，氧自由基攻擊腸道黏膜，導(dǎo)致腸道發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和總抗氧化能力（T-AOC）是機(jī)體內(nèi)重要抗氧化物酶，在清除超氧自由基、過氧化物及阻止或減少自由基形成方面發(fā)揮重要作用。GSH-Px與過氧化氫（H2O2）特異性催化發(fā)生還原反應(yīng)，可保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性。CAT酶主要作用是清除生物體內(nèi)H2O2，阻止對機(jī)體有害的羥基自由基生成。T-SOD清除機(jī)體內(nèi)自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷；SOD有多種類型，其中SOD2（MnSOD）大部分存在于線粒體內(nèi)維持其結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。T-AOC是反應(yīng)機(jī)體自由基代謝和應(yīng)激反應(yīng)和抗氧化活性的綜合指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，添加高劑量茶多酚極顯著提高仔鴿十二指腸組織中GSH-Px活性、T-SOD活性和T-AOC活力，分子水平試驗也進(jìn)一步證實(shí)茶多酚通過促進(jìn)SOD2和CAT基因表達(dá)提高其抗氧化能力。李玲秀研究表明，在飼糧中添加一定水平茶多酚和茶皂素可提高球蟲病感染肉雞血清和十二指腸SOD含量及T-AOC活力[24]。孫丹鳳研究表明，100 mg·kg-1茶多酚提高肉鴨小腸黏膜SOD活性[25]。薛菠等研究表明，飼糧中添加0.8%綠茶粉顯著增加斷奶仔豬小腸黏膜抗氧化性能（GSH-Px和SOD）[26]。陸江等研究表明，茶多酚通過增強(qiáng)肉用仔雞機(jī)體GSH-Px和SOD活性緩解熱應(yīng)激引起的氧化應(yīng)激損傷[27]。李玉等研究表明，飼糧添加一定劑量茶多酚可提高犬血清中GSH-Px活性和SOD含量[28]。以上研究與本試驗結(jié)果相似，即適宜劑量茶多酚或茶粉可顯著提高機(jī)體和腸道組織中抗氧化酶活性。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物；乳酸脫氫酶（LDH）存在于機(jī)體細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷時，細(xì)胞膜受損、LDH由胞質(zhì)內(nèi)泄漏。MDA含量及LDH活力一定程度上反映機(jī)體受氧自由基攻擊而損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)適宜劑量茶多酚可降低乳鴿十二指腸MDA含量和LDH活性，且具有劑量依賴性。上述研究結(jié)果表明，適宜劑量茶多酚不僅激活乳鴿十二指腸抗氧化防御系統(tǒng)，還抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而提高腸道抗氧化能力。茶多酚提高仔鴿腸道抗氧化功能，可能與其含有直接清除自由基的成分兒茶素有關(guān)。兒茶素中含有多個酚羥基結(jié)構(gòu)，羥基提供活潑氫起到滅活自由基的作用，發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化功能[29]。

4 結(jié)論

本試驗條件下，飼糧添加茶多酚可改善乳鴿十二指腸腸道發(fā)育、提高十二指腸抗氧化能力并可調(diào)節(jié)與腸道緊密連接相關(guān)基因mRNA表達(dá)量，維持乳鴿腸道健康。