基于原生質(zhì)體法保加利亞乳桿菌電轉(zhuǎn)化條件的研究

郭 鑫 王莎莎 李 晨 盧海強(qiáng) 田洪濤* 羅云波

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071001 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

乳酸菌是正常人腸道中重要的生理菌群，具有維持人體中微生態(tài)平衡的作用，與人體健康息息相關(guān)。目前，乳酸菌轉(zhuǎn)化載體DNA 的方法主要有電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。與電轉(zhuǎn)化法相比，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的設(shè)備條件要求較低、方法簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠，具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，而實(shí)現(xiàn)乳酸菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟是原生質(zhì)體的制備與再生[1]。近年來(lái)，已有關(guān)于嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、 干酪乳桿菌及瑞士乳桿菌等乳酸菌原生質(zhì)體制備、再生及融合方面的研究報(bào)道[2-6]。

保加利亞乳桿菌屬于化能異養(yǎng)型微生物，是酸奶及發(fā)酵乳飲料在儲(chǔ)藏期間發(fā)生后酸化的主要菌株，其具有非常強(qiáng)的產(chǎn)酸能力和耐酸性，同時(shí)具有產(chǎn)香的特性使酸奶具有特殊的香氣。鑒于保加利亞乳桿菌的重要益生作用與特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行深入研究至關(guān)重要。

本研究以質(zhì)粒pMG36e 為載體，保加利亞乳桿菌Lb-MH 為受體，采用原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化方法研究溶菌酶濃度、質(zhì)粒濃度、電轉(zhuǎn)化參數(shù)、復(fù)蘇培養(yǎng)基組成對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響，建立最佳的轉(zhuǎn)化條件，提高電轉(zhuǎn)化效率，為進(jìn)一步乳桿菌的改造和基因功能探究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 保加利亞乳桿菌MH（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，MH）來(lái)自本試驗(yàn)分離的優(yōu)良菌種。質(zhì)粒pMG36e，由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所贈(zèng)送；大腸桿菌-乳酸乳球菌穿梭組成型表達(dá)載體，保存于大腸桿菌DH5α 中；乳酸乳球菌復(fù)制子pWV01，滾環(huán)型復(fù)制（RCR），大小3.6 kb；啟動(dòng)子P32；紅霉素抗性標(biāo)記（Emr）；多克隆位點(diǎn)（MCS）。

1.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液

1）MRS 培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[7]配制MRS 液體或固體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 6.4～6.8，115 ℃滅菌20 min，室溫冷卻備用。

2）SMRS 培養(yǎng)基：含有0.5 mol/L 蔗糖的MRS培養(yǎng)基。

3）含2%甘氨酸的SMRS 培養(yǎng)基：用蒸餾水配成40%的甘氨酸母液，115 ℃20 min 滅菌，使用時(shí)取0.5 mL 加入SMRS 培養(yǎng)基中。用來(lái)培養(yǎng)受體細(xì)胞，制成原生質(zhì)體。

4）再生培養(yǎng)基RM1：液體MRS 培養(yǎng)基。5）再生培養(yǎng)基RM2：液體SMRS 培養(yǎng)基。

6）再生培養(yǎng)基RM3[8-9]：在不含Tween 80 的MRS 培養(yǎng)基中添加CaCl22.8 g/L，MgCl25.0 g/L，蔗糖171.2 g/L，胎牛血清（BSA）5.0 mL/L。

7）再生培養(yǎng)基RM4[10]：以甘露醇91.0 g/L 代替RM3 中的蔗糖，其它成分和配制方法相同。

8）原生質(zhì)體制備液[11]（SMM）：0.5 mol/L 蔗糖，順丁烯二酸0.019 mol/L，MgCl20.02 mol/L，用1 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至7.8。

9）電擊緩沖液 （PB）：0.5 mol/L 蔗糖，10%的甘油，調(diào)pH 值至7.0。

1.1.3 酶和試劑 紅霉素用無(wú)水乙醇配成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 的母液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，于-20 ℃保存?zhèn)溆?；Taq DNA 聚合酶為大連寶生物公司產(chǎn)品；溶菌酶（20.000 U/mg）：購(gòu)自上海生工。

1.1.4 主要儀器 PC Module & Gene Pulser X cell：BIO RAD；0.1 cm 規(guī)格電轉(zhuǎn)杯；BiometraTprofessional PCR 儀，德國(guó)Biometra；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)20G），上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌DH5α 中質(zhì)粒（pMG36e）的提取及定量檢測(cè)

1）大腸桿菌DH5α 中質(zhì)粒（pMG36e）的提?。翰捎肧DS 堿裂解小量分離大腸桿菌質(zhì)粒的方法。

2）質(zhì)粒（pMG36e）的定量檢測(cè)：質(zhì)粒 DNA（μg/mL）=OD260×50（μg/mL）×稀釋倍數(shù)

1.2.2 篩選轉(zhuǎn)化子的紅霉素濃度的確定 配制不同 含 量0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0 μg/mL 紅霉素的MRS 平板，進(jìn)行涂布生長(zhǎng)，到達(dá)對(duì)數(shù)期的保加利亞乳桿菌05-20 在37 ℃靜止培養(yǎng)2～3 d 觀察結(jié)果，根據(jù)抗生素平板上保加利亞乳桿菌菌落的生長(zhǎng)情況確定篩選轉(zhuǎn)化子的紅霉素濃度。

1.2.3 原生質(zhì)體的制備 將保加利亞乳桿菌菌粉活化3 次，鏡檢，平板劃線挑取單菌落，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，以1%接種量轉(zhuǎn)接到含2%甘氨酸的10 mL SMRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，4 ℃，12 000 r/min，離心2 min 收集菌體，加預(yù)冷的SMM 緩沖液洗滌3 次離心去上清，用質(zhì)量濃度為10，20，30，40 mg/mL 的溶菌酶重懸，37 ℃酶解。0.5 h 后每10 min 取樣進(jìn)行革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡觀察原生質(zhì)體形成情況，待視野內(nèi)原生質(zhì)體的形成率達(dá)60%～70%即可終止酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后以加入1 mL 冰冷的電擊緩沖液PB，3 500 r/min，10 min，4 ℃離心收集原生質(zhì)體。再用電擊緩沖液洗滌3 次后重懸于電擊緩沖液中，以50 μL 每支分裝于預(yù)冷的無(wú)菌EP 管中，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 電轉(zhuǎn)化 分別取1 μL 質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 μg/μL 的質(zhì)粒pMG36e（大腸桿菌中提?。┘尤?0 μL 原生質(zhì)體，混合后冰浴5 min。另取一支50 μL 原生質(zhì)體不加入質(zhì)粒作為對(duì)照。將混合液加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中（0.1 cm），使用BIO-RAD 電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置相應(yīng)的電轉(zhuǎn)化參數(shù)，進(jìn)行電擊。電擊后立即向電轉(zhuǎn)杯中加入950 μL 再生培養(yǎng)基，混勻后倒入無(wú)菌EP 管中。于37 ℃水浴復(fù)蘇培養(yǎng)，取用復(fù)蘇培養(yǎng)基梯度稀釋后的電擊轉(zhuǎn)化細(xì)胞液100 μL，涂布到含相應(yīng)濃度紅霉素的MRS 平板上，于37 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d 后，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。

轉(zhuǎn)化效率：即每微克外源DNA 所能產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)。轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)化子數(shù)/加入的DNA 量（μg）×稀釋倍數(shù)

1.2.5 正交試驗(yàn)確定影響電轉(zhuǎn)化效率的因素 用不同的溶菌酶濃度、質(zhì)粒濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、再生培養(yǎng)基進(jìn)行四因素四水平的正交試驗(yàn)，篩選電轉(zhuǎn)化保加利亞乳桿菌Lb-MH 的最優(yōu)條件（表1）。

1.2.6 保加利亞乳桿菌MH 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定隨機(jī)挑取紅霉素篩選平板上的單菌落于含紅霉素的10 mL 液體MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃置培養(yǎng)16～18 h，進(jìn)行菌液PCR。根據(jù)pMG36e 的紅霉素抗性和終止子相關(guān)基因序列分別設(shè)計(jì)引物，即：pMG36e1：5’-CAATTCCTGCATGTTTTAAGG-3’；pMG36e2：5’-GAGGATGAGGAGGCAGATTG-3’，采用常規(guī)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，預(yù)期PCR 產(chǎn)物為800 bp。然后采用乳酸菌提質(zhì)粒方法[12]對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行提質(zhì)粒驗(yàn)證。

表1 保加利亞乳桿菌正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test on the Lb-MH

2 結(jié)果

2.1 溶菌酶濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

將保加利亞乳桿菌MH 在一定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期經(jīng)洗滌緩沖液Ⅰ洗滌，并配成質(zhì)量濃度分別為10，20，30 和40 mg/mL 的溶菌酶酶液在37 ℃酶解，至鏡檢時(shí)視野內(nèi)出現(xiàn)60%左右原生質(zhì)體，加入1 μL 質(zhì)量濃度為1 μg/uL 的從大腸桿菌中提取的質(zhì)粒pMG36e，用2 mm 電轉(zhuǎn)杯按電阻200 Ω，電容25 μF，電場(chǎng)強(qiáng)度7.5 kV/cm 進(jìn)行電擊，之后用RM3 作為再生培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，最終獲得的電轉(zhuǎn)化效率如圖1。

2.2 質(zhì)粒濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

將保加利亞乳桿菌MH 在MRS 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期接至含甘氨酸濃度最適的SMRS（即分別含甘氨酸2%）中繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，收獲菌體后以洗滌緩沖液Ⅰ處理，采用溶菌酶進(jìn)行酶解，制成原生質(zhì)體后加入1 μL 不同濃度的質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)化結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

圖1 不同溶菌酶濃度對(duì)保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.1 Effects of different Lysozyme concentrations on electrotransformation efficiency with Lb-MH

電轉(zhuǎn)化過(guò)程中每個(gè)因素都可能對(duì)電轉(zhuǎn)化效率造成影響，相對(duì)來(lái)說(shuō)電場(chǎng)強(qiáng)度是對(duì)其影響較大的因素。本試驗(yàn)采用0.1 cm 的電轉(zhuǎn)杯，在電容為25 μF，電阻為200 Ω 固定不變的條件下。選取6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5 和10.0 kV/cm 等幾個(gè)不同的電場(chǎng)強(qiáng)度，研究電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率的影響。

由圖3可知，在固定電阻為200 Ω，電容為25 μF 時(shí)，開(kāi)始電轉(zhuǎn)化效率隨電場(chǎng)強(qiáng)度的增加而提高，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到8.0 kV/cm 時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，隨后隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加電轉(zhuǎn)化效率反而下降。造成這種現(xiàn)象的原因可能是，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)低時(shí)不能使細(xì)胞膜形成孔洞，致使外源DNA 分子不容易進(jìn)入細(xì)胞[13]，而電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)高時(shí)細(xì)胞死亡率會(huì)增大。所以在一定范圍內(nèi)電場(chǎng)強(qiáng)度越強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞膜上產(chǎn)生的孔洞越多，通透性越好，外源DNA分子越易進(jìn)入細(xì)胞，電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2.4 復(fù)蘇培養(yǎng)基對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

圖2 質(zhì)粒濃度對(duì)保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effects of plasmid concentrations on electrotransformation efficiency with Lb-MH

將保加利亞乳桿菌MH 在MRS 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期后分別轉(zhuǎn)接至含甘氨酸濃度最適的SMRS（即分別含甘氨酸2%）中繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，收獲菌體后以洗滌緩沖液Ⅰ處理，用30 mg/mL 溶菌酶進(jìn)行酶解，制成原生質(zhì)體后加入1 μL 質(zhì)量濃度為1 μg/μL 的質(zhì)粒，用2 mm 電轉(zhuǎn)杯按電阻200 Ω，電容25 μF，電場(chǎng)強(qiáng)度7.5 kV/cm 進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，分別以RM1、RM2、RM3 和RM4作為再生培養(yǎng)基，測(cè)得其對(duì)應(yīng)電轉(zhuǎn)化效率見(jiàn)圖4。

由于電擊使細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞，致使細(xì)胞在非高滲液中容易破裂，因此細(xì)胞在電擊后必須在高滲的培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)蘇。本試驗(yàn)在電擊完畢后分別向電轉(zhuǎn)杯中加入950 μL 的RM1、RM2、RM3、RM4 液體培養(yǎng)基，混勻后倒入無(wú)菌EP 管中，37℃培養(yǎng)。探究復(fù)蘇培養(yǎng)基對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響。

在其它條件相同的情況下，用RM3 作為再生培養(yǎng)基比使用RM1、RM2、RM4 獲得的電轉(zhuǎn)化效率有大幅度的提高。方差分析顯示：RM1、RM2 和RM3 復(fù)蘇培養(yǎng)基對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響差異極顯著（P<0.01），RM3 再生培養(yǎng)基的效果最好。因此后續(xù)研究選RM3 作為復(fù)蘇培養(yǎng)基。

圖3 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effects of electric filed strength on electrotransformation efficiency with Lb-MH

圖4 再生培養(yǎng)基對(duì)保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率影響Fig.4 Effects of incubation medium components on electrotransformation efficiency with Lb-MH

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化

分析結(jié)果表明，影響保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率的4 個(gè)因素主次順序?yàn)椋弘妶?chǎng)強(qiáng)度＞復(fù)蘇培養(yǎng)基＞質(zhì)粒濃度＞溶菌酶濃度（表2），而保加利亞乳桿菌電轉(zhuǎn)化的最適條件為C2D3B3A2，即場(chǎng)強(qiáng)為7.5 kV/cm，復(fù)蘇培養(yǎng)基Ⅲ，質(zhì)粒質(zhì)量濃度1.2 μg/μL、溶菌酶質(zhì)量濃度30 mg/mL。按此最優(yōu)條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)3 次取平均數(shù)，電轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1.42×105CFU/μg DNA。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 及提質(zhì)粒驗(yàn)證。

表2 正交試驗(yàn)優(yōu)化電轉(zhuǎn)化保加利亞乳桿菌的條件Table 2 Results of orthogonal tests for optimizing electro transformation of Lb-MH

2.6 轉(zhuǎn)化子的鑒定

2.6.1 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR 鑒定 從紅霉素篩選平板上隨機(jī)挑取10 個(gè)單菌落，接入新鮮的含紅霉素質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16 h。經(jīng)菌液PCR 后，電泳檢測(cè)結(jié)果表明，在800 bp 左右均出現(xiàn)了與目的條帶大小吻合的條帶。表明含有Emr 的PMG36e 質(zhì)粒已成功電轉(zhuǎn)化到保加利亞乳桿菌MH 中。

2.6.2 提質(zhì)粒鑒定 保加利亞乳桿菌MH 轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取，經(jīng)電泳檢測(cè)結(jié)果可知，保加利亞乳桿菌MH 轉(zhuǎn)化子中提取的質(zhì)粒分子質(zhì)量大小與從大腸桿菌DH5α 中提取的質(zhì)粒大小一致（3 610 bp），即證明質(zhì)粒pMG36e 成功轉(zhuǎn)入保加利亞乳桿菌MH 中。

圖5 保加利亞乳桿菌MH 轉(zhuǎn)化子菌液PCR 圖Fig.5 The detection of plasmid in Lb-MH by colony PCR

圖6 保加利亞乳桿菌MH 質(zhì)粒圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of plasmid Lb-MH

3 討論

電轉(zhuǎn)化方法是細(xì)菌、 真菌等微生物體內(nèi)導(dǎo)入外源基因的常見(jiàn)方法之一，該方法操作簡(jiǎn)單方便，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于乳酸菌的轉(zhuǎn)化中。電轉(zhuǎn)化的原理是利用高壓電脈沖使細(xì)胞膜發(fā)生瞬間的可逆穿孔，從而使游離的外源DNA 穿過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。然而由于其存在轉(zhuǎn)化率低、重復(fù)性差等缺點(diǎn)，已成為制約乳酸菌分子生物學(xué)研究和基因工程技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。本研究針對(duì)影響電轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)主要因素——溶菌酶濃度、 質(zhì)粒濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、復(fù)蘇培養(yǎng)基組成等進(jìn)行了研究，探明電轉(zhuǎn)化的最適條件，成功實(shí)現(xiàn)了保加利亞乳桿菌的高效遺傳轉(zhuǎn)化。

本研究發(fā)現(xiàn)，在其他條件一定的情況下，保加利亞乳桿菌在7.5 kV/cm 時(shí)達(dá)到最高的電轉(zhuǎn)化效率，這可能跟乳酸菌細(xì)胞璧厚度有關(guān)。有文獻(xiàn)表明變?nèi)芫貙?duì)于弱化細(xì)胞壁制備原生質(zhì)體效果更佳，但其成本較高。因此本試驗(yàn)通過(guò)適當(dāng)提高溶菌酶濃度，并配合最適洗滌緩沖液，在保證適宜的pH 和離子條件下也可實(shí)現(xiàn)較高的原生質(zhì)體制備率，因?yàn)樵谠|(zhì)體制備過(guò)程中，緩沖液通過(guò)洗滌細(xì)胞使其處于理想的離子環(huán)境中。本研究結(jié)果表明溶菌酶質(zhì)量濃度為30 mg/mL 可提高轉(zhuǎn)化效率。外源質(zhì)粒的濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率也有影響。1989年Mcintyre 研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞濃度不變的情況下，添加不同濃度的外源質(zhì)粒，得到的轉(zhuǎn)化子數(shù)目也會(huì)發(fā)生變化[15]。質(zhì)粒DNA 濃度過(guò)低或過(guò)高時(shí)轉(zhuǎn)化效率都有所下降。本研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞濃度一定，DNA質(zhì)量濃度為1.2 μg/μL 時(shí)電轉(zhuǎn)化效率最高。細(xì)胞在經(jīng)過(guò)電擊后，可直接涂布在含有抗生素的平板上，或在不含抗生素的液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇一段時(shí)間，再涂布于含抗性的固體平板上，兩種方法對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大的影響[15]。Wei 等[16]研究發(fā)現(xiàn)后者比前者轉(zhuǎn)化效率高60～80 倍。除此之外，對(duì)于電擊后菌體復(fù)蘇來(lái)說(shuō)，除去復(fù)蘇時(shí)間的影響，復(fù)蘇培養(yǎng)基中的成分也起著很大作用，如蔗糖有利于細(xì)胞膜的恢復(fù)，并且可使細(xì)胞在滲透壓突然改變的情況下不致死亡。只有復(fù)蘇培養(yǎng)基中含有的穩(wěn)定劑能夠提供菌體所需要的營(yíng)養(yǎng)成分和滲透壓，才會(huì)提高細(xì)胞的存活率，從而提高轉(zhuǎn)化效率。

綜上所述，本試驗(yàn)中確定了質(zhì)粒pMG36e 電轉(zhuǎn)化保加利亞乳桿菌Lb-MH 的最適參數(shù)，為外源基因電轉(zhuǎn)化保加利亞乳桿菌提供了可靠的參考數(shù)據(jù)。同時(shí)為乳桿菌進(jìn)一步改造和基因功能探究以及遺傳育種、菌種改良奠定了基礎(chǔ)。