東北膜莢黃芪內(nèi)生細菌的分離及其活性代謝物分析

翟李欣 徐慧超 李 偉 鄭 雪 鄭春英*

（1 黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心 哈爾濱150500 2 黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點實驗室 哈爾濱150080）

植物內(nèi)生菌是具有豐富多樣性特征的微生物類群，幾乎存在于每種植物的不同組織器官內(nèi)。據(jù)統(tǒng)計，自然界中至少存在著一百萬種內(nèi)生菌[1]。內(nèi)生菌的多樣性表現(xiàn)以下幾個方面：同種植物的不同部位，在其組織內(nèi)所生長的內(nèi)生菌的種類及數(shù)目不同[2]；同種植物在不同生理、病理狀態(tài)下，其內(nèi)生菌種類及數(shù)目也會相應(yīng)發(fā)生改變[3]；產(chǎn)地、氣候等環(huán)境因素直接影響內(nèi)生菌種類及數(shù)目[4-5]。植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的多樣性是受其宿主植物中內(nèi)生細菌的多樣性所決定[6]。據(jù)報道[7-8]，從植物內(nèi)生菌中分離得到的次生代謝產(chǎn)物有49%是已知結(jié)構(gòu)化合物，51%是新結(jié)構(gòu)類型的化合物。植物內(nèi)生菌是一種新型生物活性物質(zhì)資源，研究植物內(nèi)生細菌具有重要的理論意義和較高的商業(yè)應(yīng)用價值。

黃芪（Astragalus membranaceus）為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao）或膜莢黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.）的干燥根[9]，主要分布于東北與西北等地，分布于東北的膜莢黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.）品系簡稱“北芪”[10]，具有抑菌[11]、抗炎[12]、抗病毒[13]、抗腫瘤[14]、抗氧化[15]、降血糖[16]等多種活性作用。

寒地黑土造就了東北膜莢黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.）特有品質(zhì)，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于功能性保健食品、 食品添加劑、 藥品等領(lǐng)域。本文以主產(chǎn)于東北地區(qū)的膜莢黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.）（北芪）為研究對象，對其內(nèi)生細菌進行分離及活性代謝物初步研究，并與生藥活性成分作對比分析，篩選出能夠產(chǎn)與宿主植物北芪相同、相似或全新的具有抑菌、抗氧化等實用價值的目的菌株，為開發(fā)新資源、創(chuàng)制新藥、 開辟新型北芪活性成分的生產(chǎn)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 植物樣品

野生豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.健康植株分別于2015年8，9月采自黑龍江省大興安嶺地區(qū)。

1.2 培養(yǎng)基

NA 分離培養(yǎng)基及PDA 培養(yǎng)基：同文獻[17]。

1.3 試驗菌株

糞腸球菌 （Enterococcus facalis）、 屎腸球菌（Enterococcus faecium）、金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、 銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）、單增李斯特菌 （Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）、肺炎克雷 伯菌（Klebsiella penumoniae）、白假絲酵母（Candida albicans），均購于黑龍江省應(yīng)用微生物研究所。

1.4 儀器與試劑

高效液相色譜儀（FL2200 HPLC，浙江溫嶺）；電子天平（METTLER TOLEDO，美國）。

16SrDNA 序列擴增引物（上海生工生物工程股份有限公司合成），甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 北芪內(nèi)生細菌的分離

將北芪根、莖樣品沖洗，剝?nèi)№g皮部，按下述程序進行表面消毒：75% 乙醇浸1min→5% NaCl 浸5min→75%乙醇浸360 s→無菌水沖洗3 次→10%H2O2浸15 min→浸于75%酒精1 min→無菌水沖3 次。將根、 莖韌皮部切成1 cm 的小塊（無菌操作），置于NA 液體分離培養(yǎng)基中，放入水浴搖床；同時，也將其置于NA 固體分離培養(yǎng)基中的樣品放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件均為：37 ℃；培養(yǎng)3～5 d。觀察，待根、莖小塊四周長出菌體后，將菌體轉(zhuǎn)入平板，多次劃線分離純化；另取表面消毒程序最后沖洗樣品的無菌水液倒入NA 液體培養(yǎng)基，或涂布平板培養(yǎng)作對照，以排除所分離得到的內(nèi)生細菌為殘留在樣品表面的菌株。

2.2 抑菌試驗

2.2.1 北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備 取分離得到的北芪內(nèi)生細菌，活化后分別接種于含有50 mL NB 培養(yǎng)基的三角瓶中（n=3），于37 ℃，120 r/min 搖床培養(yǎng)3d，取出，作為北芪內(nèi)生細菌供試品液（1×107CFU/mL）。以20%的裝液量將上述北芪內(nèi)生細菌供試品液接種于新配制NB 培養(yǎng)基中，同等條件下發(fā)酵培養(yǎng)5 d，取出，抽濾，濾液醇沉（3倍量95%乙醇，V/V），取上清液，回收溶劑后作為北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物備用。

2.2.2 抑菌試驗 取2.1 節(jié)的北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物以等量的水飽和正丁醇超聲1h，于50℃條件下，將正丁醇提取液減壓濃縮后，用1 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液，參閱文獻[18]，按濾紙片法操作進行抑菌活性測定。

2.3 北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析

2.3.1 HPLC 分析條件 色譜柱：Venusil XBPC18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm，USA）；流動相：甲醇-水-冰醋酸（50 ∶49.7 ∶0.3）流速：1 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：254nm；進樣量：10μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 稱取芒柄花素對照品適量，用甲醇稀釋溶解，制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 對照品溶液，備用。

2.3.3 供試品溶液制備 取2.1 節(jié)北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物（n=6），分別以等量的乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取，各萃取液減壓（50 ℃水浴條件下）濃縮近干，加入1 mL 甲醇溶解，于4 ℃保存，備用；同時，另取NB 培養(yǎng)基同法操作后作為空白對照品溶液；另取北芪生藥3 g，精密加入甲醇50 mL，超聲提取1 h，取出，放冷，濾過，濾液濃縮至5 mL 后作為對照藥材液，備用。

2.3.4 樣品測定 依照3.1 節(jié)的色譜條件，分別精密吸取對照品液、對照藥材液、供試品液、空白對照液各10 μL（n=3）進樣，檢測。

2.4 菌種鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定 參照文獻[19]。

2.4.2 16 S rDNA 序列擴增和序列分析 北芪內(nèi)生菌按照常規(guī)方法[20]進行PCR 擴增。采用16S rDNA 通用引物為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR 產(chǎn)物純化后測序（委托上海生工生物工程股份有限公司）。序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，在GenBank 網(wǎng)站上用Blast 軟件進行相似性搜索，得到相近典型菌株的16S rDNA 基因序列后，用軟件MEGA6.0 進行多重序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析結(jié)果并確定菌株的分類地位。

3 結(jié)果

3.1 北芪內(nèi)生細菌的分離

從健康北芪根部組織、 莖部組織中共分離出36 株內(nèi)生細菌，其中，從莖中分離得到16 株，從根中分離得到20 株。

3.2 內(nèi)生細菌的抑菌活性

在所分離得到的36 株北芪內(nèi)生細菌中，有31 株內(nèi)生細菌發(fā)酵液對11 株供試致病菌具有不同程度的抑菌作用，占分離菌株的86.11%，北芪內(nèi)生細菌抑菌活性篩選結(jié)果見表1。

表1 北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵液抑菌試驗結(jié)果Table 1 Antimicrobial activities of endophytic bacteria isolated from Astragalus membranaceus to the tested bacteria and fungi in screening

3.3 北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析結(jié)果

3.3.1 色譜條件下活性成分的分離 在3.1 節(jié)的色譜條件下，對照藥材液中各物質(zhì)得到了較好的分離，其中北芪根對照藥材液在與對照品芒柄花素相同保留時間處出現(xiàn)一相同色譜峰，該色譜峰采用對照品加入法確認為芒柄花素，結(jié)果見圖1。

圖1 北芪生藥與對照品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC of Astragalus membranaceus and reference substance

3.3.2 北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析結(jié)果 采用HPLC 法分析36 株北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵液不同極性部位，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌HX8 及HX14 發(fā)酵液中含有大量活性物質(zhì)，并且內(nèi)生細菌HX8、HX14 在與對照品及對照藥材對比分析后發(fā)現(xiàn)，該菌株可能含有北芪活性成分芒柄花素，結(jié)果見圖2及圖3。

由圖2可以看出，在保留時間10～12min 時，內(nèi)生細菌HX8 發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯、氯仿萃取所得的供試品液出現(xiàn)與北芪根、 莖生藥樣品相同的色譜峰；在保留時間18 min 左右時，內(nèi)生細菌HX8發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取所得供試品液中出現(xiàn)與北芪莖生藥樣品相同的色譜峰；由圖2和圖3可以看出，在保留時間44min 時，內(nèi)生細菌HX8、HX14發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取所得供試品液中出現(xiàn)與北芪根生藥樣品的活性成分——芒柄花素，上述試驗結(jié)果說明，內(nèi)生細菌HX8、HX14 發(fā)酵液中含有與北芪生藥相同或相似的活性成分，該檢測結(jié)果對深入研究北芪內(nèi)生細菌HX8、HX14 活性成分提供參考。

圖2 北芪內(nèi)生細菌HX8 發(fā)酵液的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of fermentation broth of HX8

3.4 菌種鑒定

據(jù)抑菌試驗結(jié)果及HPLC 法對36 株北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析結(jié)果，對具有潛在應(yīng)用價值的北芪內(nèi)生細菌HX8 進行了菌種鑒定。

3.4.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果 北芪內(nèi)生細菌HX8 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果見表2。

3.4.2 16S rDNA 鑒定結(jié)果 北芪內(nèi)生細菌HX8 PCR 擴增后獲得1 條1 000 bp 左右的特異性條帶，將測序結(jié)果利用BLAST 分析并與GenBank中的核苷酸序列進行比對，然后用MEGA6.0 軟件構(gòu)建北芪內(nèi)生細菌HX8 的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖4），分析其種屬關(guān)系。分析結(jié)果表明，HX8 序列（登錄號：KY010575）與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus strain MPF 15 的16S rDNA 序列的同源性最高，相似性為99%。結(jié)合菌體形態(tài)特征、生理生化鑒定結(jié)果確定菌株HX8 為枯草芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

4 討論

圖3 北芪內(nèi)生細菌HX14 發(fā)酵液的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of fermentation broth of HX14

表2 北芪內(nèi)生細菌HX8 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of physiological and biochemical characteristics for strain HX8

圖4 HX8 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of strain HX8

以東北寒地藥用植物膜莢黃芪（北芪）為研究對象，對其根、莖中的內(nèi)生細菌進行了分離，并以抑菌活性為指標，對所分離得到的北芪內(nèi)生細菌次生代謝產(chǎn)物進行抑菌活性篩選，以便能夠得到產(chǎn)生較好抑菌活性物質(zhì)的目的菌株，為開發(fā)新型防腐劑及新型抗菌藥物提供參考；同時，以芒柄花素及北芪生藥為對照，采用HPLC 法對北芪內(nèi)生細菌次生代謝產(chǎn)物進行對比分析；結(jié)果表明，在36 株北芪內(nèi)生細菌次生代謝產(chǎn)物中，存在著大量具有較好抑菌作用的活性物質(zhì)，其中北芪內(nèi)生細菌HX8，HX14 代謝物表現(xiàn)出了較好的抑菌活性，同時經(jīng)HPLC 比對分析發(fā)現(xiàn)，此2 株內(nèi)生細菌發(fā)酵液中活性物質(zhì)可能含有與北芪生藥活性成分相同或相似，是北芪活性成分產(chǎn)生菌，因此對此2株內(nèi)生細菌中具有潛在應(yīng)用價值的HX8 進行了菌種鑒定，為該菌株的深入研究奠定基礎(chǔ)。

以芒柄花素為代表的黃酮類成分為黃芪主要活性成分之一[21]，其中芒柄花素具有降壓、抗癌及抗菌作用，是常用的藥物原料[22]，本文以芒柄花素及北芪生藥為陽性雙對照，對北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵液進行篩選，結(jié)果表明2 株北芪內(nèi)生細菌HX8，HX14 發(fā)酵液中疑似含有芒柄花素，該結(jié)果對后續(xù)課題組采用柱色譜法分離此2 株目的細菌活性成分奠定基礎(chǔ)；同時，也為采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)芒柄花素成分提供理論依據(jù)。此外，對北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物進行系統(tǒng)篩選研究，發(fā)掘出北芪活性成分產(chǎn)生菌，并對其進行綜合利用，這對開發(fā)新資源、 采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)北芪活性成分及保護北芪藥用植物可持續(xù)利用具有重要意義。