全二維氣相色譜/飛行時間質譜分析傳統(tǒng)工藝與機械化工藝老白干原酒的揮發(fā)性成分

馬雅杰 鄭福平* 黃明泉 張煜行 張福艷 孫寶國

（1 北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京100048 2 北京工商大學 食品質量與安全北京實驗室 北京100048 3 河北衡水老白干釀酒（集團）有限公司 河北衡水053000）

白酒是中國的國酒。目前已定型的白酒主要香型有12 種[1]。白酒揮發(fā)性成分十分復雜，據(jù)統(tǒng)計目前已在白酒中檢測到1 737 種[2]，這些揮發(fā)性成分含量不足2%。這2%的成分決定白酒在香氣、口味、 酒體等方面的特征，即決定酒的品質和典型性。揮發(fā)性物質的種類與含量與釀酒原材料、發(fā)酵工藝、蒸餾和陳釀工藝等密切相關。2015年全國規(guī)模以上白酒企業(yè)1 563 家，全國白酒總產量1 312.80 萬kL，銷售收入5 558.86億元[3]。普遍存在生產工藝機械自動化水平低，勞動強度大，能源消耗高，批次質量不穩(wěn)定等問題。隨著土地資源日益緊張，能源消耗愈加嚴重，原料和勞動力成本不斷攀升，生產環(huán)境要求更加嚴格，傳統(tǒng)生產模式已不能夠滿足白酒行業(yè)的發(fā)展需求。改變傳統(tǒng)生產工藝，加快提升機械自動化水平，已成為白酒行業(yè)研究和發(fā)展的重要方向。

老白干香型于2004年被正式列為中國白酒的第十一種代表香型，以衡水老白干為代表，以“醇香清雅，甘冽豐柔”著稱[4]。傳統(tǒng)工藝老白干原酒制酒過程均為人工操作，包括人工蒸料、加曲、地缸發(fā)酵、上甑等。根據(jù)蒸酒工序是否加入糧食同蒸又分為清蒸清燒工藝和混蒸混燒工藝。不同原酒分別儲存后，經勾調成商品酒。近年來老白干香型骨干企業(yè)對傳統(tǒng)工藝進行機械化改造，改造后的蒸料加曲、不銹鋼發(fā)酵槽中發(fā)酵、蒸酒和摘酒等工藝過程均為機械化操作。由于生產工藝的不同，機械化工藝原酒與傳統(tǒng)工藝原酒的香氣和口感尚有一定差距，其內在原因是兩類工藝原酒的揮發(fā)性成分的種類和含量存在差異。

關于老白干白酒的研究主要包括用GC-O 對原酒關鍵香成分進行嗅聞分析[5]，用固相微萃取分析老白干揮發(fā)性成分[6-7]，用內標法對包括老白干在內的白酒中首次發(fā)現(xiàn)的乳酸丙酯進行定量[8]，研究發(fā)酵主要風味物質變化規(guī)律[9]以及采用HSSPME-GCMS 法建立老白干白酒風味物質指紋圖譜[10]等。目前已在衡水老白干中發(fā)現(xiàn)166 種揮發(fā)性化合物。尚未有文獻對傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代工藝生產的老白干原酒揮發(fā)性成分進行分析比較。

全二維氣相色譜（GC×GC）是20 世紀90年代初由Liu 等[11]提出的新型分離系統(tǒng)。相比傳統(tǒng)一維氣相色譜 （1D GC），GC×GC 具有峰容量大、結構色譜行為明顯、 分離速度快和靈敏度高等優(yōu)點[12]。全二維氣相色譜-質譜技術（GC×GC/TOFMS）在食品分析領域得到廣泛的應用，主要用于葡萄酒[13]、白酒[14]、牛肉香精[15]、雞肉[16]風味分析等方面。目前，應用GC×GC/TOFMS 分析白酒主要有茅臺[14]、瀘州老窖[17]、古井貢酒[18]及清香型白酒[19]等。大多數(shù)的定性方式為譜庫檢索[14，17-19]結構色譜圖比對[14]及保留指數(shù)比對[14]，很少使用標準品比對定性。使用GC×GC 分析比較多種樣品之間化合物差異的研究已在多個文獻中報道[13，20-21]，它們通常采用統(tǒng)計比較與計算Fisher 比率（F 值）的方法。這種方法尚未應用在白酒風味分析方面。

本文選取SPME 為樣品前處理方法，使用GC×GC/TOFMS 分析老白干原酒中的揮發(fā)性成分，采用保留指數(shù)及標準品比對定性。通過統(tǒng)計比較與F 值分析10 種老白干原酒中揮發(fā)性成分的差異，尋找傳統(tǒng)工藝原酒和機械化工藝原酒間的區(qū)別，為后續(xù)研究不同揮發(fā)性成分對傳統(tǒng)工藝與機械化工藝老白干原酒風味的貢獻打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 種老白干原酒，均來自河北衡水老白干釀酒（集團）有限公司。編號L1-L7 為不同傳統(tǒng)工藝原酒，其中L1-L3 為3 種清蒸清燒工藝原酒，L4-L6 為3 種混蒸混燒工藝原酒，L7 為燒酒（最后一次蒸酒得到的原酒），L8-L10 為3 種機械化清蒸清燒工藝原酒，其中L8 為機械化燒酒，L9 與L10為不同生產日期的機械化普通酒。

氯化鈉（NaCl），分析純，國藥集團化學試劑有限公司。C6-C20 正構烷烴，百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GC×GC/TOFMS 系統(tǒng)，包括Agilent 7890B 氣相 色 譜 儀 （Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA），配置第二柱溫箱 （適應第二維色譜柱的溫度變化）、 四噴口液氮型調制器及Pegasus 4D 飛行時間質譜儀 （LECO Corp.，St.Joseph，MI，USA）。

75μm PDMS/DVB 萃取頭，固相微萃取手動進樣器（美國Supelco 公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 SPME 萃取條件 參照課題組前期工作[22]，采用75μm PDMS/DVB 萃取頭萃取各種老白干原酒中的揮發(fā)性成分。所有樣品均預先采用超純水稀釋至酒精度10%（V/V），取8 mL 稀釋樣品放入15 mL 頂空樣品瓶中。加入NaCl 至飽和。在45 ℃恒溫水浴中平衡20 min，插入已經在250 ℃下老化10 min 的SPME 萃取頭，在45 ℃萃取40 min。萃取結束后，將萃取頭在GC×GC 進樣口熱解析5 min，進行GC×GC/TOFMS 分析。每個樣品重復進樣3 次。

1.3.2 色譜條件 GC×GC 色譜系統(tǒng)：第一維柱：DB-WAX（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）；第二維柱：DB-5（1.64m × 0.1mm，0.1 μm），均購于安捷倫公司，兩根色譜柱通過毛細管柱連接器以串聯(lián)方式連接。載氣：He，純度99.999%，流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；壓力30 psi；不分流手動進樣；主柱溫箱升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1 min，以1℃/min 升至45 ℃，以3 ℃/min 升至150 ℃，以5℃/min 升至200 ℃；第二柱溫箱升溫程序：高于主柱溫箱5 ℃。調制器溫度：高于主柱溫箱15 ℃。調制周期5 ；冷吹時間700 ms，冷脈沖是干燥氮氣經過液氮冷卻后由調制器調制形成。

1.3.3 質譜條件 電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，檢測器電壓-1 400 V，質量掃描范圍35～400 amu，TOFMS 采集頻率100 Hz，離子源的燈絲在535～590 s 時關閉。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 GC×GC/TOFMS 檢測的總離子流圖采用 LECO ChromaTOF version 4D 軟件處理數(shù)據(jù)，并采用NIST14 譜庫檢索，選取匹配度在700 以上的化合物。在原酒中初步定性的化合物通過比較測定保留指數(shù) （RI）與文獻保留指數(shù)（RIL）（誤差<±30）進一步定性[23]。最后對比初步定性的化合物與標準品的保留時間與質譜圖進行準確定性。

2 結果與分析

2.1 10 種老白干原酒全二維總離子流圖

以傳統(tǒng)工藝生產的老白干原酒L1 為例，其揮發(fā)性成分的3D 總離子流圖見圖1。由圖1可見，GC×GC 分離了大量的在傳統(tǒng)一維氣相色譜柱上共流出的化合物，且在第二維上拖尾很小，不同極性的一維共流出化合物在二維平面上實現(xiàn)了正交分離。其余9 種原酒樣品的3D 總離子流圖與圖1大體相似，均檢測出大量揮發(fā)性成分，且一維共流出物在第二維色譜柱上分離良好。

2.2 10 種老白干原酒中共有揮發(fā)性成分

圖1 SPME 法提取的老白干原酒樣品L1 中揮發(fā)性成分的3D 總離子流圖Fig.1 The 3D image of the total ion current chromatogram of volatiles in Laobaigan base Baijiu （L1）

對10 種老白干原酒的總離子流圖做NIST 譜庫檢索、刪除柱流失、合并重復項，選取匹配度大于700 的化合物。在兩類工藝原酒中共檢測到了322 種化合物。其中223 種化合物經過保留指數(shù)比對進一步定性，95 種化合物經過標準品比對進行準確定性。7 種傳統(tǒng)工藝原酒共檢出305 種共有成分，3 種機械化工藝原酒共檢出294 種共有成分。兩類不同工藝原酒中有286 種共有成分（見表1），其中酯類107 種，醇類44 種，醛類28 種，酮類28 種，酸類2 種，含氮類5 種，含硫類6 種，呋喃類13 種，縮醛類16 種，酚類1 種，醚類6 種，酸酐類3 種，烴類27 種。說明兩類老白干原酒中的揮發(fā)性成分種類總體相同。10 種樣品中，每個化合物的絕對峰體積分別乘以稀釋倍數(shù)后，計算峰體積平均值及含量范圍（見表1）。

表1 10 種老白干原酒中共有揮發(fā)性成分Table 1 Volatile compounds in all of 10 kinds of Laobaigan base Baijiu

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

雖然75 μm PDMS/DVB 萃取頭適合萃取極性揮發(fā)性成分，但對酸類等強極性的化合物萃取效果較差。本文只檢測出2 種酸類化合物：2-甲基-2-戊烯酸和乙酸。根據(jù)以往研究經驗，酸類化合物是白酒中一類重要的化合物[2，22]，這可能是由于酸類化合物極性太強，揮發(fā)性較低，不容易從樣品中揮發(fā)出來，從而HS-SPME 法很難萃取到酸類化合物。

2.3 10 種原酒共有揮發(fā)性成分統(tǒng)計比較

采用ChromaTOF version 4D 軟件對傳統(tǒng)工藝與機械化工藝老白干原酒中揮發(fā)性成分進行統(tǒng)計比較，當一種揮發(fā)性成分在所有10 種原酒樣品中均被檢測到時，可采用Fisher 比率（F 值）比較其在10 種樣品中的含量差異，結果見表1。F 值是一個相對值，其越大代表樣品間該化合物差異越大[13]，經過F 值比較發(fā)現(xiàn)，大量共有揮發(fā)性成分在10 種樣品中含量存在明顯差異，如F 值較大的化合物有1-丁氧基-1-乙醚、苯乙醇、糠醛等。F 值大于5 的化合物見圖2。

積面峰譜色597 624±346 588 738 683±430 744 6 564 950±4 001 642 1 955 489±2 592 668 1 743 714±3090181 151 978±178 391 109 372±129 246 23 340±26 869 121 712±173 681 20 267 721±21 700 776 1 598 247±1 392 522 1 292 570±1 160 408 71 860±38 225 385 869±494 447 2 625 519±1 287 096 268 090±432 637 234 946±315 311 65 128±58 247 200 073±96 065分成性發(fā)揮 種36的出檢酒原分部 2表List of 36 compounds distributed in part of 10 Laobaigan base Baijiu Table 2 化械機酒原藝工統(tǒng)傳述描氣香酒原藝工式方性定RIS L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10出檢 具有果香，蘋果樣的香氣特征，并伴有蘋果酒和甜菠蘿樣的香氣++-+++++++，RI MS++-+++++++，RI MS味香實果的梨洋或蘿 菠++-+++++++，S ，RI MS 1 181++-+++++++MS味甜，有味臭性透穿烈強 呈+- -+++++++MS 1 274味香果有+具-++++++++MS，RI，S 1 329++-+++++++，S ，RI MS 1 101 味氣激刺性息窒 有-- -+++++++，RI MS味氣的烈強種一有 帶--++++++++，RI MS味香油黃有 具-+++++++++，RI MS等香、烤果、堅油、奶肪 脂-- -+++++++，RI MS料香用食型香 奶--++++++++MS++-+++++++MS香甜蘿菠有帶時釋，稀香蔥洋和、蒜香肉的烈 濃--++++++++，S ，RI MS 1 562 香烤+焙+-+++++++MS，RI，S 936 氣香樣、醚醇 清++-+++++++，RI MS++-+++++++，RI MS 1 132味風橘柑的甜帶，微氣香木松的香芳 呈++-+++++++，RI MS++-+++++++MS RIL 未酒原1 141 1 125 1 188 1 332 1 109 784 1 330 978 1 056 1 209 1 569 955 1 251 1 166 1 278 RI藝工化械1 133 1 134 1 185 1 217 1 311 1 335 1 113 784 1 332 972 1 054 1 319 1 166 1 566 955 1 252 1 166 1 277 1 265機名物合化號序分，部出檢部全酒原藝工統(tǒng)傳酯乙酸戊基甲2-1 酯丙酸丁基甲2-2 酯戊異酸丙3酯丙酸戊4酯戊酸丁5酯己酸丙6醇戊3-7 醛丙8醛烯己基乙2-9 酮二丁，3-2 10 酮二戊，3-2 11 酮二辛，3-2 12 吩噻基3-乙13 酯乙酸）丙基硫（甲3-14 喃呋基2-乙15 醛縮基己基乙醛乙 16烯枯 17烯油品萜 18酐酸丁異 19

積面峰譜色223 578±176 899 36 826 101±24 594 752 86 008±117 099 165 794±226 833 2 055 005±3 585 312 282 549±244 059 135 281±96 461 93 732±73 527 282 286±652 702 325 388±376 176 594 852±647 429 420 100±560 103 215 334±253 570 119 699±187 735 40 629±59 541 156 027±126 737 10 275 736±8 166 739索檢庫：譜：MS式方性。定化械機酒原藝工統(tǒng)傳述描氣香酒原藝工式方性定L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10+++++++-++，RI MS味香的果蘋和蕉+香++-++++++MS，RI，S+++++++-++，S MS香可，可香+酒+++++-+++MS，RI，S 氣香等蜜蘿、菠克釀、康、甜酪乳，有香果和香醚烈強 呈+++-++++++，RI MS++++++-++- MS+++++-++++MS+++++++-++MS-- -++++- -+，RI MS香蠟和香、青香、酯香果的甜有- 具+-+++-+++MS，RI氣香果水的香清 呈+-++++++-+，RI MS道味果水的和溫及以氣香香，花香、酯糖、焦果、堅果水有 具-- -++++- - - ，RI MS香菜、蔬香 果++-+++++-+，S ，RI MS香果，水香 甜+- -++- -+++，RI MS+- -+++- -+- MS味氣性激刺的快愉不有，略氣香油奶 呈--++-+++++MS-- -+++-+++，RI MS數(shù)指留保算計驗試物合：化；RI到得索檢庫 譜NIST 14，由數(shù)指留保獻：文；RIL數(shù)指留保品準：標。RIS出檢未。性定）2表（續(xù)RIS RIL RI名物合化號序出檢部全酒原藝工化械，機出檢未酒原藝工統(tǒng)傳分部1 105 1 094 酯乙酸烯丁3-20 1 115 1 126 1 115 酯丁基2-甲酸乙21 1 245 1 251酯乙酸丁異基羥α-22 1 317 1 331 1 326 醇-1-戊基3-甲23 1 113 1 120 酮庚4-24 1 050醇乙基硝2-25 1 482炔丙基-1-苯1-26 1 578酐酸丁 27失缺分部均中酒原藝工類兩1 194 1 191 酯戊異酸丁異 28 1 276酯 1 277 丁基2-甲酸丁基2-甲29 1 301 1 300 酯乙酸烯己3-30 1 534 1 531 酯糠酸乙 31 1 146 1 158 1 161 醇烯-3-戊1-32 1 240 1 247 醇-1-烯丁基-3-甲3-33 1 389醇烯-1-壬2-34 1 131酮二己，4-3 35 1 264 1 258 烯四辛環(huán) 36中品樣此在物合化：該。-出檢中品樣此在物合化：該：+注對比圖譜質及間時留保品準：標；S性定數(shù)指留：保；RI性定

圖2 F 值大于5 的化合物Fig.2 Volatiles which shown Fisher Ratio bigger than 5

2.4 10 種老白干原酒中非共有揮發(fā)性成分

有36 種揮發(fā)性成分只在部分原酒中檢出，其在10 種原酒中的分布情況及香氣描述詳見表2。表中No.1～No.19 在傳統(tǒng)工藝原酒中全部檢出，在部分機械化工藝原酒中未檢出。No.20～No.27 在部分傳統(tǒng)工藝原酒中未檢出，在機械化工藝原酒中全部檢出。No.28～No.36 在兩類工藝原酒中均有部分缺失。有28 個揮發(fā)性成分在部分或全部機械化原酒中未檢出。其中丙醛和2，3-戊二酮只在傳統(tǒng)工藝原酒中被檢測到（L1-L7）。2，3-戊二酮，具有脂肪、奶油、堅果、烤香、焦糖香氣等，其天然存在于啤酒、朗姆酒、威士忌及葡萄酒中[24]。2-乙基己烯醛、2，3-辛二酮及3-（甲硫基）丙酸乙酯這3 種在傳統(tǒng)工藝中檢測到的化合物并未在L9 與L10這兩種機械化普通酒中發(fā)現(xiàn)。3-（甲硫基）丙酸乙酯經過標準品準確定性，其具有濃烈的肉香、蒜和洋蔥香，稀釋時帶有菠蘿甜香。本課題組曾在扳倒井芝麻香型白酒中檢測到3-（甲硫基）丙酸乙酯[25]。其它在部分機械化原酒中缺少的化合物有2-甲基戊酸乙酯、2-甲基丁酸丙酯、 丙酸異戊酯、3-戊醇、2-乙基呋喃、乙醛乙基己基縮醛、枯烯、萜品油烯（除L8）、丙酸己酯（除L9）和雙乙酰（除L10）。多個具有香氣活性的揮發(fā)性成分在傳統(tǒng)工藝或機械化工藝原酒中未檢測到，證明兩類工藝生產的原酒在揮發(fā)性成分種類方面有一定差異。

3 結論

首次應用頂空固相微萃取結合全二維氣相色譜/飛行時間質譜對傳統(tǒng)工藝與機械化工藝老白干原酒中的揮發(fā)性成分進行比較分析。7 種傳統(tǒng)工藝原酒共檢出305 種共有成分，3 種機械化工藝原酒中共檢出294 種共有成分。兩類原酒中共檢測到322 種化合物，其中286 種化合物在10 種樣品中共有，說明老白干原酒中的揮發(fā)性成分的種類相對穩(wěn)定。另外，有28 個揮發(fā)性成分在部分或全部機械化原酒中未檢出，其中丙醛和2，3-戊二酮只在傳統(tǒng)工藝原酒中檢出，說明傳統(tǒng)工藝原酒與機械化工藝原酒中揮發(fā)性成分的種類存在一定差異。經過F 值比較發(fā)現(xiàn)大量在10 種樣品中共有的揮發(fā)性成分的含量也有明顯差異。表明傳統(tǒng)工藝和機械化工藝生產的老白干原酒揮發(fā)性成分的種類大體相同，含量存在一定差異。