吳茱萸水提物體外肝毒性的譜-毒關(guān)系研究

劉舒凌 王劍 劉雯 黃鳳玉 蔣東明 林曉彤 蒙已欽 李耀華

摘 要 目的 研究吳茱萸水提物體外肝毒性的譜-毒關(guān)系。方法 制備16批不同產(chǎn)地吳茱萸水提物。采用超高效液相色譜（UPLC）法以及《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版）》建立吳茱萸水提物的指紋圖譜，并進(jìn)行共有峰指認(rèn)及相似度評價;以正常人肝細(xì)胞L02為對象，考察16批吳茱萸水提物對該細(xì)胞的抑制作用;采用灰色關(guān)聯(lián)度法和偏最小二乘回歸分析法分析吳茱萸水提物UPLC指紋圖譜的共有峰與L02細(xì)胞肝毒性的譜-毒關(guān)系，并對與吳茱萸體外肝毒性相關(guān)性最大的色譜峰的對應(yīng)成分進(jìn)行分離、制備及鑒定。結(jié)果 16批吳茱萸水提物共有27個共有峰，相似度為0.375～0.995;共指認(rèn)出9個成分，分別為新綠原酸（峰5）、綠原酸（峰9）、隱綠原酸（峰10）、咖啡酸（峰12）、蘆?。ǚ?6）、金絲桃苷（峰17）、去氫吳茱萸堿（峰19）、吳茱萸堿（峰24）、吳茱萸次堿（峰25）。16批吳茱萸水提物對L02細(xì)胞的生長均具有顯著的抑制作用（P<0.05或P<0.01），抑制率在6.68%～ 67.95%之間。經(jīng)灰色關(guān)聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)聯(lián)度大于0.8的共有峰有18個，由大到小依次為峰8>峰3>峰23>峰7>峰4>峰9>峰12>峰2>峰19>峰6>峰15>峰5>峰1>峰17>峰21>峰26>峰20>峰14;經(jīng)偏最小二乘回歸分析發(fā)現(xiàn)，回歸系數(shù)為正且變量重要性投影值大于1的共有峰有14個，按回歸系數(shù)大小排序依次為峰8>峰3>峰23>峰2>峰7>峰4>峰12>峰9>峰19>峰5>峰17>峰26>峰10>峰15。峰8與吳茱萸體外肝毒性相關(guān)性最大，進(jìn)一步鑒定該峰對應(yīng)的化學(xué)成分為6-O-反式咖啡酰葡萄糖酸。結(jié)論 吳茱萸水提物的體外肝毒性作用是其多組分共同作用的結(jié)果，其中6-O-反式咖啡酰葡萄糖酸與其體外肝毒性相關(guān)性最大。

關(guān)鍵詞 吳茱萸;指紋圖譜;肝毒性;L02細(xì)胞;譜-毒關(guān)系;灰色關(guān)聯(lián)度分析法;偏最小二乘回歸分析法

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）01-0032-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.01.06

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the spectrum-toxicity relationship of in vitro hepatotoxicity of aqueous extract from Euodia rutaecarpa. METHODS The aqueous extract from 16 batches of E. rutaecarpa from different habitats were prepared. The fingerprints of aqueous extract from E. rutaecarpa were established by ultra high performance liquid chromatography （UPLC） method and Similarity Evaluation System of TCM Fingerprint （2012A edition）， and common peaks were identified and the similarity was evaluated. Using normal human hepatocytes L02 as subject， inhibitory effect of aqueous extract from 16 batches of E. rutaecarpa to them were investigated. The spectrum-toxicity relationship of UPLC fingerprint of aqueous extract from E. rutaecarpa with the hepatotoxicity of hepatocytes L02 was analyzed by grey relational analysis （GRA） and partial least squares regression analysis （PLSR）. The corresponding compound of the chromatographic peak with the greatest correlation with the in vitro hepatotoxicity of E. rutaecarpa were isolated， prepared and identified. RESULTS There were 27 common peaks in UPLC fingerprints of aqueous extract from 16 batches of E. rutaecarpa， with similarity of 0.375-0.995. Totally 9 peaks were confirmed， i.e. neochlorogenic acid （peak 5）， chlorogenic acid （peak 9）， cryptochlorogenic acid （peak 10）， caffeic acid （peak 12）， rutin? ? （peak 16）， hyperin （peak 17）， dehydroevotarine （peak 19）， evotarine （peak 24）， rutecarpine （peak 25）. The aqueous extract from 16 batches of E. rutaecarpa showed significant inhibitory effect on the growth of L02 cells （P<0.05 or P<0.01）， and the inhibitory rate ranged from 6.68% to 67.95%. GRA showed that there were 18 common peaks with correlation degree greater than 0.8， which were peak 8>peak 3>peak 23>peak 7>peak 4>peak 9>peak 12>peak 2>peak 19>peak 6>peak 15>peak 5>peak 1>peak 17>peak 21>peak 26>peak 20>peak 14 in descending order of correlation degree. PLSR showed that there were 14 peaks with regression coefficient>0 and variable importance projection value>1， and the order of regression coefficient was peak 8>peak 3>peak 23>peak 2>peak 7>peak 4>peak 12>peak 9>peak 19>peak 5>peak 17>peak 26>peak 10>peak 15.? Peak 8 had the greatest correlation with in vitro hepatotoxicity， and the corresponding compound of this peak was identified as 6-O-trans caffeoyl gluconic acid. CONCLUSIONS The in vitro hepatotoxicity of aqueous extract from E. rutaecarpa is the result of multiple component interaction， among which 6-O-trans caffeoyl gluconic acid shows closest relation with in vitro hepatotoxicity.

KEYWORDS? ?Euodia rutaecarpa;fingerprint; hepatotoxicity; L02 cell; spectrum-toxicity relationship; grey relational analyses; partial least squares regression analysis

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎E. rutaecarpa （Juss.） Benth. var. officinalis （Dode） Huang或疏毛吳茱萸E. rutaecarpa （Juss.） Benth. var. bodinieri （Dode） Huang的干燥近成熟果實，其性辛、味苦，有小毒，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效[1]。相關(guān)研究表明，吳茱萸水提物、醇提物、揮發(fā)油等不同部位或成分群均具有一定毒性，且主要以肝損傷為主[2-4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地吳茱萸藥材因其基原、生長環(huán)境、采收加工、提取方法等因素的影響，其化學(xué)成分、藥理活性等方面有所不同，從而在臨床療效和毒性方面存在一定差異[5-8]。譜-效（或譜-毒）關(guān)系研究是一種定量分析多種成分與生物活性之間的方法，可將指紋圖譜中多種化學(xué)成分的變化與藥效/毒性結(jié)果相聯(lián)系，以闡明中藥效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[9-10]?；诖?，本研究先制備16批不同產(chǎn)地的吳茱萸水提物，并建立該水提物的超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）指紋圖譜，然后結(jié)合人正常肝細(xì)胞L02來評價其肝毒性，再利用灰色關(guān)聯(lián)度法和偏最小二乘回歸分析法進(jìn)行譜-毒關(guān)系分析，以期為吳茱萸藥材肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究的主要儀器有Agilent 1290 Infinity Ⅱ型二元泵UPLC儀（美國Agilent公司），CPA225D型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，HR1200-ⅡB2型生物安全柜（青島海爾股份有限公司），MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司），MULTLSKAN sky型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），GL6000-DACO150型動態(tài)軸向壓縮柱系統(tǒng)（成都格萊精密儀器有限公司），Avance Ⅲ HD500M型超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），AB SCIEX 5500 Qtrap型質(zhì)譜儀（美國Absciex公司），Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的16批吳茱萸藥材（編號S1～S16）由課題組在廣西玉林藥材市場購買，以及在江西、浙江、四川、廣西等吳茱萸種植區(qū)收集，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室馬雯芳副教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸E. rutaecarpa （Juss.） Benth.的干燥近成熟果實（藥材來源信息見表1）。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的對照品（批號分別為wkq20010607、wkq19112202、wkq19120203、wkq20011605、wkq19040913、wkq2003- 0203、wkq19092506、wkq20021404、wkq19040801，純度均大于98%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基（批號20210607）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;胎牛血清（批號11011-8611）購自浙江天杭生物科技股份有限公司;CCK-8試劑盒（批號5130011）購自北京索萊寶科技有限公司;乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

本研究所用人正常肝細(xì)胞L02購自上海美軒生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸水提物UPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 吳茱萸水提物的制備 參考文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行制備。將吳茱萸藥材打粉過二號篩，精密稱取藥材粉末2 g置于100 mL錐形瓶中，加水40 mL浸泡30 min后，加熱回流30 min，抽濾，收集濾液;殘渣繼續(xù)加水40 mL，加熱回流30 min，抽濾。合并2次濾液，置于蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至浸膏;將浸膏加水溶解，以10 mL量瓶定容后，即得質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的吳茱萸水提物（以生藥量計）。

2.1.2 色譜條件 色譜柱為Waters HSS-T3 C18（150 mm×3.0 mm，1.8 μm）;流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）（梯度洗脫：0～3 min，8%A→12%A;3～15 min，12%A→15%A;15～40 min，15%A→30%A;40～47 min，30%A→45%A;47～50 min，45%A→60%A;50～54 min，60%A→70%A;54～60 min，70%A→80%A;60～65 min，80%A→90%A;65～70 min，90%A→100%A）;流速為0.2 mL/min;檢測波長為254 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.3 供試品溶液的制備 取“2.1.1”項下吳茱萸水提物1 mL置于10 mL量瓶中，加50%乙腈溶液定容至刻度;取定容后的溶液適量，以 13 000 r/min離心10 min，取上清液，以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 混合對照品溶液的制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的對照品各適量，加甲醇溶解制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.120、0.146、0.124、0.186、0.113、0.116、0.134、0.122、0.128 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.3”項下制備的供試品溶液（S1樣品的水提物），按“2.1.2”項下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄色譜圖，以19號峰（去氫吳茱萸堿，該峰面積相對較大、出峰時間適中、峰形良好）為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各色譜峰相對保留時間的RSD均小于0.38%（n=6）、相對峰面積的RSD均小于2.51%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取吳茱萸藥材（S1樣品）適量，按“2.1.1”項下方法制備水提物6份，然后按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2” 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以19號峰為參照，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各色譜峰相對保留時間的RSD均小于0.37%（n=6）、相對峰面積的RSD均小于2.95%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下制備的供試品溶液（S1樣品的水提物），于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時分別按“2.1.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以19號峰為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各色譜峰相對保留時間的 RSD 均小于0.56%（n=6）、相對峰面積的 RSD 均小于2.89%（n=6），表明該供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 16批不同產(chǎn)地吳茱萸水提物樣品的UPLC指紋圖譜生成 分別取16批不同產(chǎn)地吳茱萸藥材樣品適量，按“2.1.1”項下方法制備水提物，然后按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版）》，以S1樣品的色譜圖為參照（其色譜峰峰形較好，峰信號強度適中），設(shè)置時間窗寬度為0.1 s，采用多點校正法進(jìn)行色譜峰匹配生成疊加指紋圖譜，詳見圖1;采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），詳見圖2。

2.1.9 共有峰的指認(rèn) 取“2.1.4”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，得到如圖3所示的混合對照品溶液色譜圖。由圖1和圖2可知，16批不同產(chǎn)地吳茱萸水提物樣品中含有27個共有峰，通過與圖3進(jìn)行比對，指認(rèn)出其中9個成分，分別為新綠原酸（峰5）、綠原酸（峰9）、隱綠原酸（峰10）、咖啡酸（峰12）、蘆丁（峰16）、金絲桃苷（峰17）、去氫吳茱萸堿（峰19）、吳茱萸堿（峰24）、吳茱萸次堿（峰25）。

2.1.10 相似度評價 將16批不同產(chǎn)地吳茱萸水提物樣品的UPLC指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版）》中進(jìn)行相似度評價。結(jié)果，16批樣品的相似度在0.375～0.995范圍內(nèi)，表明不同產(chǎn)地的吳茱萸水提物存在一定差異，詳見表2。

2.2 吳茱萸水提物的體外肝毒性考察

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將L02細(xì)胞以含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”），在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至融合度為80%～90%時，以胰酶消化傳代，用于后續(xù)實驗。

2.2.2 細(xì)胞抑制率的檢測 參考文獻(xiàn)[11-13]方法進(jìn)行吳茱萸水提物的體外肝毒性評價。取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104 mL-1，按每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基;將細(xì)胞分為陰性組和吳茱萸S1～S16水提物組（0.5 mg/mL，藥物濃度根據(jù)本課題組前期預(yù)實驗設(shè)置），每組設(shè)6個復(fù)孔，陰性組加入培養(yǎng)基200 μL，各給藥組加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基200? ? ?μL。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔棄上清液，以PBS洗滌1次，加入10%CCK-8試劑100 μL，培養(yǎng)2 h后，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定每孔光密度（OD）值并計算細(xì)胞抑制率（%）[細(xì)胞抑制率=（1-OD給藥組平均值/OD陰性組平均值）×100%]。采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnet檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果顯示，與陰性組比較，吳茱萸S1～S16水提物組細(xì)胞的OD值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），細(xì)胞抑制率在6.68%～67.95%之間，詳見表3。

2.3 譜-毒關(guān)系分析

2.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 以“2.2.2”項下L02細(xì)胞抑制率為參考序列，以吳茱萸水提物UPLC指紋圖譜中各共有峰峰面積為比較序列，采用均值法對參考數(shù)列和比較數(shù)列進(jìn)行無量綱化并計算關(guān)聯(lián)度（當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.8時，表明參考序列和比較序列的相關(guān)性較大）[14-16];然后將關(guān)聯(lián)度按大小順序進(jìn)行排序，得到關(guān)聯(lián)序，結(jié)果見表4。

由表4可知，27個共有峰與L02細(xì)胞抑制率的關(guān)聯(lián)度在0.716 4～0.878 0之間;其中，關(guān)聯(lián)度大于0.8的共有峰有18個，依次為峰8>峰3>峰23>峰7>峰4>峰9（綠原酸）>峰12（咖啡酸）>峰2>峰19（去氫吳茱萸堿）>峰6>峰15>峰5（新綠原酸）>峰1>峰17（金絲桃苷）>峰21>峰26>峰20>峰14，表明這18個共有峰與肝毒性的關(guān)聯(lián)性較大。

2.3.2 偏最小二乘回歸分析 將吳茱萸水提物UPLC指紋圖譜中各共有峰峰面積作為自變量（X）、L02細(xì)胞抑制率作為因變量（Y），將峰面積歸一化處理后導(dǎo)入SIMCA-P 13.5軟件，進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，結(jié)果見圖4、圖5。

由圖4可知，峰1～15、峰17、峰19～26的回歸系數(shù)為正，表明這些共有峰與吳茱萸的肝毒性作用呈正相關(guān)[17];峰16、18、27的回歸系數(shù)為負(fù)，表明這3個共有峰與吳茱萸的肝毒性作用呈負(fù)相關(guān)。一般認(rèn)為，當(dāng)變量重要性投影（variable importance projection，VIP）>1 時，自變量在解釋因變量時具有重要意義[18]。由圖5可知，回歸系數(shù)為正且VIP 值>1的色譜峰共14個，按回歸系數(shù)由大到小依次為峰8>峰3>峰23>峰2>峰7>峰4>峰12>峰9>峰19>峰5>峰17>峰26>峰10>峰15，表明這14個共有峰對吳茱萸的肝毒性均有顯著影響。

2.3.3 綜合分析 將灰色關(guān)聯(lián)度分析中關(guān)聯(lián)度>0.8、偏最小二乘回歸分析中回歸系數(shù)>0且VIP值>1的共有峰進(jìn)行整合[19]，得到重疊的共有峰13個，分別為峰8、峰3、峰23、峰2、峰7、峰4、峰12（咖啡酸）、峰9（綠原酸）、峰19（去氫吳茱萸堿）、峰5（新綠原酸）、峰17（金絲桃苷）、峰26、峰15，表明這些共有峰所代表的化學(xué)成分與吳茱萸的肝毒性相關(guān)性強。另外，經(jīng)上述兩種方法分析后發(fā)現(xiàn)，峰8與吳茱萸的肝毒性相關(guān)性排第1位，由此推測，峰8所對應(yīng)的化合物可能是吳茱萸水提物的重要肝毒性成分。

基于此，筆者參考文獻(xiàn)[20]方法，采用制備液相色譜法對吳茱萸水提物的峰8進(jìn)行分離、純化。色譜條件如下：色譜柱為 C18制備柱（60 cm×15 cm，10 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（13 ∶ 87，V/V），檢測波長為254 nm，流速為450 mL/min，柱溫為30 ℃。經(jīng)反復(fù)制備后，得到高純度制備液，于40 ℃條件下濃縮，經(jīng)冷凍干燥后，得到白色固體，即為峰8對應(yīng)化學(xué)成分。經(jīng)高效液相色譜分析后發(fā)現(xiàn)，該化合物純度較高（約為93%），其色譜圖（圖略）中未見其他明顯雜質(zhì)峰。進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)現(xiàn)，該化合物為類白色固體，易溶于水、甲醇;電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）為質(zhì)荷比（m/z）381[M+Na]+，357[M-H]-;1H-NMR（500 MHz，D2O）δ：7.41（1H，d，J=15.9 Hz，H-7′），6.98 （1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），6.93（1H，dd，J=8.3，2.0 Hz，H-6′ ），6.81（1H，d，J=8.2 Hz，H-5′），6.17 （1H，d，J=16.0 Hz，H-8′），4.43（1H，d，J=3.8 Hz，H-2），4.39（1H，dd，J=11.6，3.5 Hz，H-6），4.24（1H，dd，J=11.7，5.8 Hz，H-6），4.15 （1H，t，J=3.8 Hz，H-3），4.01（1H，td，J=6.4，3.4 Hz，H-5），3.89（1H，dd，J=7.3，3.8 Hz，H-4）;13C-NMR（126 MHz，D2O）δ：175.9（C-1），169.3（C-9′），146.9（C-4′），146.0（C-7′），144.1（C-3′），126.8（C-1′），122.7（C-6′），116.0（C-5′），115.0（C-2′），113.9（C-8′），72.2（C-2），71.7（C-4），70.7（C-3），68.6（C-5），65.3（C-6）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道基本一致，故鑒定該化合物為6-O-反式咖啡酰葡萄糖酸。

3 討論

本研究前期對不同流動相（乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-水）、不同檢測波長（215、254、324 nm）進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液、檢測波長為254 nm時，所得色譜峰的信息較全、分離度較好且峰形對稱、無拖尾現(xiàn)象。

吳茱萸在臨床上的用藥方式以水煎液為主，因此，本文以吳茱萸水提物進(jìn)行譜-毒關(guān)系研究符合臨床的用藥特點，具有實際意義。L02細(xì)胞是人胚胎期正常肝細(xì)胞，適用于藥物肝毒性作用的評價[10]。因此，本研究采用L02細(xì)胞進(jìn)行吳茱萸水提物的體外肝毒性評價，結(jié)果顯示，16批吳茱萸水提物對L02細(xì)胞生長均有抑制作用，且抑制率在6.68%～67.95%之間，表明不同產(chǎn)地吳茱萸藥材水提物的體外肝毒性作用有所不同。

目前在譜-效（毒）關(guān)系分析方法中，常用的數(shù)據(jù)處理模型有相關(guān)分析、回歸分析、主成分分析、典型相關(guān)分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析等[22]。在實際分析中，很多學(xué)者更趨向于采用2種及以上的分析方法來聯(lián)合應(yīng)用、相互佐證，以確保分析結(jié)果的客觀與真實?；疑P(guān)聯(lián)度分析能很好地識別化學(xué)成分對藥效的貢獻(xiàn)，同時對樣本數(shù)量和數(shù)據(jù)規(guī)律性的要求較低，適用于評價中藥化學(xué)成分與藥效之間的關(guān)聯(lián)程度;但該法缺乏整體性描述，不能識別化學(xué)成分對藥效是正促進(jìn)或是負(fù)抑制作用[23]。因此，本文又采用偏最小二乘回歸分析進(jìn)行補充，該方法可直觀地分析化學(xué)成分對藥效的綜合貢獻(xiàn)，更易于辨識系統(tǒng)信息與噪聲，且其回歸系數(shù)更容易解釋和分析，可以很好地彌補灰色關(guān)聯(lián)度分析的不足[23]。本研究結(jié)果顯示，這兩種分析方法所得結(jié)果大致相似。進(jìn)一步將兩種方法得到的共有峰進(jìn)行整合，獲得了13個肝毒性相關(guān)峰，分別為峰8、峰3、峰23、峰2、峰7、峰4、峰12（咖啡酸）、峰9（綠原酸）、峰19（去氫吳茱萸堿）、峰5（新綠原酸）、峰17（金絲桃苷）、峰26、峰15。其中，峰8與吳茱萸肝毒性的相關(guān)性排名第1位;經(jīng)制備液相色譜法分離、純化、鑒定后發(fā)現(xiàn)，該峰對應(yīng)的物質(zhì)為6-O-反式咖啡酰葡萄糖酸。已有研究報道，3-O-反式咖啡酰葡萄糖酸、4-O-反式咖啡酰葡萄糖酸、2-O-反式咖啡酰葡萄糖酸為吳茱萸水提物的肝毒性成分，可直接影響L02細(xì)胞的增殖[24]。本文所得6-O-反式咖啡酰葡萄糖酸與上述成分為同分異構(gòu)體，提示該成分可能是吳茱萸的肝毒性成分。但6-O-反式咖啡酰葡萄糖酸與上述3種成分是否存在同分異構(gòu)體間的相互轉(zhuǎn)化，以及是否具有相同的肝毒性作用，仍待進(jìn)一步研究。由于6-O-反式咖啡酰葡萄糖酸在單體溶液狀態(tài)下極不穩(wěn)定，因此，本研究未對其體外肝毒性作用進(jìn)行驗證和確認(rèn)。另外，峰3、峰23、峰2、峰7、峰4所對應(yīng)的化學(xué)成分也對吳茱萸的肝毒性有重要貢獻(xiàn)，但這些峰具體是什么物質(zhì)，也有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，吳茱萸水提物的體外肝毒性作用是其多組分共同作用的結(jié)果，其中6-O-反式咖啡酰葡萄糖酸與其體外肝毒性相關(guān)性最大。

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（收稿日期：2021-08-11 修回日期：2021-11-22）

（編輯：唐曉蓮）