阿魏酸甲酯對缺氧損傷H9c2心肌細胞的線粒體保護作用研究

楊贊 周怡

摘 要 目的 探討阿魏酸甲酯對 H9c2心肌細胞缺氧損傷后線粒體功能的影響。方法 將細胞分為正常組（不給藥、不造模），缺氧模型組（僅造模），阿魏酸甲酯高、中、低（40、20、10 μmol/L）劑量組，陽性對照藥組（環(huán)孢菌素A ，1 μmol/L）。各給藥組細胞經(jīng)藥物預處理及缺氧損傷造模后，檢測乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶（CK）、三磷酸腺苷（ATP）水平，采用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）、線粒體膜電位、線粒體膜通透性轉換孔開放情況的變化。結果 與缺氧模型組比較，阿魏酸甲酯高、中、低劑量組H9c2心肌細胞中LDH、MDA、CK水平和ROS熒光強度均顯著降低，ATP水平均顯著升高（P<0.01或P<0.05）;線粒體膜電位紅/綠熒光強度比值和線粒體膜通透性轉換孔綠色熒光強度均顯著升高（P<0.01或P<0.05）。結論 阿魏酸甲酯能逆轉缺氧損傷H9c2心肌細胞的生化指標水平，穩(wěn)定線粒體膜電位，降低線粒體膜通透性轉換孔的開放程度，對缺氧損傷H9c2心肌細胞線粒體功能具有明顯的保護作用，且這種保護作用呈劑量依賴趨勢。

關鍵詞 阿魏酸甲酯;心肌缺血;缺氧損傷;線粒體;H9c2心肌細胞

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）01-0013-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.01.03

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To investigate the effects of methyl ferulate （MF） on the mitochondrial function of H9c2 cardiomyocytes after hypoxia-induced injury. METHODS H9c2 cardiomyocytes were divided into normal group （no administration， no modeling）， hypoxia model group （modeling alone）， MF high-dose， medium-dose and low-dose groups （40， 20， 10 μmol/L） and positive control drug group （cyclosporin A，? 1 μmol/L）. After drug pretreatment and inducing hypoxia-induced injury， the levels of lactate dehydrogenase （LDH），? malondialdehyde （MDA）， creatine kinase （CK） and adenosine triphosphate （ATP） were tested. The intracellular reactive oxygen species （ROS）， mitochondrial membrane potential （MMP）， the opening of mitochondrial membrane permeability transition pore （mPTP） were detected with flow cytometry. RESULTS Compared with hypoxia model group， the levels of LDH， MDA， CK and ROS fluorescence intensity were decreased significantly in MF high-dose， medium-dose and low-dose groups， while the level of ATP was increased significantly （P<0.01 or P<0.05）. The red/green fluorescence intensity ratio of MMP and the green fluorescence intensity of mPTP were increased significantly （P<0.01 or P<0.05）. CONCLUSIONS MF can reverse the levels of biochemical indexes in H9c2 cardiomyocyte after hypoxia-induced injury， keep MMP stable， reduce the opening of mPTP， and has an obvious protective effect on the mitochondrial function of H9c2 cardiomyocytes injured? by hypoxia， and this protective effect is dose-dependent.

KEYWORDS? ?methyl ferulate; myocardial ischemia; hypoxia-induced injury; mitochondria; H9c2 cardiomyocytes

目前，缺血性心臟病占居民疾病死因構成的40%以上，嚴重威脅著人類健康[1]。近年來，隨著心肌缺血治療的發(fā)展，研究者提出了“能量饑餓”的概念[2]，認為能量代謝紊亂是缺血性心臟病發(fā)病過程中普遍存在的現(xiàn)象，激發(fā)與扶持心肌內(nèi)源性能量、使心臟重新恢復正常心肌代謝模式、增強心肌細胞抗損傷能力，是保護心肌缺血的新選擇[2-4]。心臟作為高耗能的器官，需要每日消耗大量的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）[5]。線粒體通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生大量ATP用以維持心肌細胞的舒張、收縮、離子泵功能[6-7]。心肌缺血過程會使線粒體的結構和功能發(fā)生改變，導致線粒體自身穩(wěn)態(tài)平衡遭到破壞，引起細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加，促發(fā)線粒體膜通透性轉換孔開放，繼而導致電子傳遞鏈解偶聯(lián)、線粒體膜電位下降、ATP生成障礙[8]。因此，對線粒體功能的保護作用是藥物抗心肌缺血的重要研究方向。阿魏酸甲酯為本課題組前期從藏藥復方三味檀香散中鑒定到的活性成分，其可以提高缺氧損傷H9c2心肌細胞的存活率。本研究主要探討阿魏酸甲酯對缺氧損傷H9c2心肌細胞線粒體功能的影響，以期在細胞層面明確阿魏酸甲酯對缺氧心肌細胞的保護作用。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：YXQ-LS-100A型電熱壓力蒸汽消毒器、GZX-9140MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱、SW-CJ-2F型超凈工作臺、BSC-1300ⅡA2型生物安全柜（上海博訊實業(yè)有限公司），TDL-50B型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），TG16-WS型高速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器公司），ECLIPSE Ti-s型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），細胞計數(shù)板（上海醫(yī)用儀器廠），細胞培養(yǎng)瓶及細胞培養(yǎng)板（美國CoStar公司），XB120A型電子分析天平（瑞士Precisa公司），ELX800酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Tek公司），MCO-15AC-SC型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司），Cytoflex型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 主要藥品及試劑

阿魏酸甲酯、環(huán)孢霉素A均購自河南奧科標準物質(zhì)科技有限公司（批號分別為BD105676、C106893，純度分別為99%、98%）;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司（批號分別為11995-065、10099-141）;胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液（100×）、0.25%胰蛋白酶、線粒體膜通透性轉換孔檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司（批號分別為C0201、C0222、C0201、C2009S、S0033）;JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司（批號40706ES60）;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）購自北京中杉金橋生物技術有限公司（批號B040100）;乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司（批號分別為A020-2-2、A003-1-1、A032-1-1）;大鼠ATP ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司（批號ml059183）;其余試劑均為分析純或實驗室常用規(guī)格。

1.3 細胞

本研究所用細胞為大鼠H9c2心肌細胞株，購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 H9c2心肌細胞培養(yǎng)

H9c2心肌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，2～3 d更換1次培養(yǎng)液，在細胞融合度為80%時按照1 ∶ 3比例進行傳代，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 分組、造模及給藥

將細胞分為6組：正常組，缺氧模型組，阿魏酸甲酯高、中、低劑量組，陽性對照藥組。正常組：細胞常規(guī)培養(yǎng)2 h，不進行造模;缺氧模型組：參照文獻[9-13]造模，將細胞維持在含有復合成分緩沖液（NaCl 137 mmol/L、KCl 12 mmol/L、MgCl2 0.5 mmol/L、CaCl2 0.9 mmol/L、羥乙基哌嗪乙硫磺酸20 mmol/L、2-脫氧-D-葡萄糖20 mmol/L，pH6.2）中誘導缺氧，并于37 ℃、0.1%O2、5%CO2、95%N2的缺氧培養(yǎng)箱中放置1 h;阿魏酸甲酯各劑量組：在缺氧造模前加入高、中、低劑量的阿魏酸甲酯（濃度分別為40、20、10 μmol/L）預處理1 h，再按照“缺氧模型組”的方法進行處理;陽性對照藥組：在缺氧造模前加入環(huán)孢菌素A 1 μmol/L預處理1 h，再按照“缺氧模型組”的方法進行處理。實驗中阿魏酸甲酯和環(huán)孢菌素劑量根據(jù)前期預實驗結果進行設置。每組重復實驗3次。

2.3 H9c2心肌細胞形態(tài)的觀察

將細胞按照“2.2”項下方法分組處理后，置于倒置顯微鏡下觀察H9c2心肌細胞形態(tài)的變化。

2.4 H9c2心肌細胞上清液中生化指標的檢測

將細胞按照“2.2”項下方法分組處理后，采用相應的生化指標試劑盒檢測。用無菌管收集細胞培養(yǎng)上清液，以3 000 r/min離心20 min后收集上清液，采用相應試劑盒檢測LDH、MDA、CK的水平。以PBS（pH 7.2～7.4）稀釋細胞懸液，使細胞密度達1×106 mL-1左右，通過反復凍融，使細胞破壞并釋放出細胞內(nèi)成分，以2 500 r/min離心20 min，收集上清液，采用ATP ELISA試劑盒檢測ATP的水平。

2.5 H9c2心肌細胞中ROS的檢測

采用流式細胞儀檢測。使用胰酶消化細胞，將細胞懸液轉移到15 mL離心管中，以1 500 r/min離心5 min，去除上清液，加入新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，并用移液管將細胞吹打均勻。用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞懸液的密度，使細胞密度達5×104 mL-1左右。將細胞懸液接種至6孔板，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞按照“2.2”項下方法分組處理后，使用胰酶消化細胞，加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，制成細胞懸液，以3 500 r/min離心5～10 min收集細胞;使用PBS洗滌1～2次，離心收集細胞沉淀，每管加入100 μL ROS檢測染色液，以37 ℃培養(yǎng)30 min后離心，收集細胞;使用PBS洗滌細胞1～3次，再用200 μL PBS重懸細胞，進行ROS熒光強度定量檢測。檢測的最大激發(fā)波長為490 nm，最大發(fā)射波長為525 nm。結果解析：平均熒光強度值越大，細胞中產(chǎn)生的ROS越多。

2.6 H9c2心肌細胞線粒體膜電位的檢測

采用流式細胞儀檢測。將細胞接種于6孔板，于37 ℃培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)。將細胞按照“2.2”項下方法分組處理后，使用胰酶消化細胞，以1 500 r/min離心5 min后，于0.5 mL細胞培養(yǎng)液中重懸，加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻，于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。在培養(yǎng)期間，按照1 mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4 mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），冰浴備用。細胞培養(yǎng)結束后，以2 000 r/min在4 ℃離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清液，注意盡量不要吸除細胞;加入1 mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，以2 000 r/min 在4 ℃離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清液，再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，進行線粒體膜電位熒光強度定量檢測。檢測JC-1單體時，最大激發(fā)波長為490 nm，最大發(fā)射波長為530 nm;檢測JC-1聚合物時，最大激發(fā)波長為525 nm，最大發(fā)射波長為590 nm。結果解析：橫坐標表示綠色熒光強度，縱坐標表示紅色熒光強度，當紅/綠熒光強度比值降低時，表示細胞線粒體膜電位降低。

2.7 H9c2心肌細胞線粒體膜通透性轉換孔開放情況的檢測

采用流式細胞儀檢測。將細胞接種于6孔板，37 ℃培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)。將細胞按照“2.2”項下方法分組處理后，使用胰酶消化細胞，加入終止液，以1 500 r/min離心5 min，收集細胞;用PBS洗滌1～2次，離心收集細胞沉淀;加入200 μL熒光淬滅工作液（在Calcein AM染色液中添加CaCl2），顛倒數(shù)次混勻，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。細胞培養(yǎng)結束后，以1 500 r/min離心5 min，收集沉淀細胞;使用PBS洗滌2次，再用200 μL PBS重懸細胞，進行線粒體膜通透性轉換孔熒光強度定量檢測。檢測的最大激發(fā)波長為494 nm，最大發(fā)射波長為517 nm。結果解析：以綠色熒光的強弱表示線粒體膜通透性轉換孔的開放程度，綠色熒光越強，開放程度越低。

2.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料滿足正態(tài)分布時以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 H9c2心肌細胞形態(tài)觀察結果

倒置顯微鏡下可見，各組H9c2心肌細胞經(jīng)處理后，細胞形態(tài)飽滿，均一性良好（圖1），表明阿魏酸甲酯高、中、低劑量和陽性對照藥對 H9c2心肌細胞均無毒性。

3.2 阿魏酸甲酯對H9c2心肌細胞生化指標的影響

與正常組比較，缺氧模型組H9c2心肌細胞中LDH、MDA、CK水平均顯著升高，ATP水平顯著降低（P<0.01）;與缺氧模型組比較，阿魏酸甲酯高、中、低劑量組及陽性對照藥組H9c2心肌細胞中LDH、MDA、CK水平均顯著降低，ATP水平均顯著升高（P<0.01或P<0.05）。結果見表1。

3.3 阿魏酸甲酯對H9c2心肌細胞中ROS的影響

與正常組比較，缺氧模型組H9c2心肌細胞中ROS熒光強度顯著升高（P<0.01）;與缺氧模型組比較，阿魏酸甲酯高、中、低劑量組及陽性對照藥組H9c2心肌細胞中ROS熒光強度均顯著降低（P<0.01或P<0.05）。結果見圖2。

3.4 阿魏酸甲酯對H9c2心肌細胞線粒體膜電位的影響

與正常組比較，缺氧模型組H9c2心肌細胞線粒體膜電位的紅/綠熒光強度比值顯著降低（P<0.01）;與缺氧模型組比較，阿魏酸甲酯高、中、低劑量組及陽性對照藥組H9c2心肌細胞線粒體膜電位的紅/綠熒光強度比值均顯著升高（P<0.01）。結果見圖3。

3.5 阿魏酸甲酯對H9c2心肌細胞線粒體膜通透性轉換孔開放情況的影響

與正常組比較，缺氧模型組H9c2心肌細胞線粒體膜通透性轉換孔綠色熒光強度顯著降低（P<0.01）;與缺氧模型組比較，阿魏酸甲酯高、中、低劑量組及陽性對照藥組H9c2心肌細胞線粒體膜通透性轉換孔綠色熒光強度均升高（P<0.01或P<0.05）。結果見圖4。

4 討論

阿魏酸甲酯即4-羥基-3-甲氧基肉桂酸甲酯，是阿魏酸的衍生物，具有抗氧化、抗菌、抗炎活性[14-15]。有研究表明，阿魏酸甲酯較阿魏酸具有更高的活性、更低的毒性，有較好的開發(fā)應用前景[16-17]。本課題組前期鑒定結果顯示，阿魏酸甲酯為藏藥復方三味檀香散中的活性成分，故本研究在細胞層面深入探討其對缺氧損傷心肌細胞的保護作用。

本研究通過構建H9c2心肌細胞缺氧模型，以阿魏酸甲酯高、中、低劑量和陽性對照藥（環(huán)孢菌素A）對各組細胞進行處理后，倒置顯微鏡觀察可見細胞形態(tài)飽滿、均一性良好，表明阿魏酸甲酯和環(huán)孢菌素A對H9c2心肌細胞均無毒性。本研究通過構建H9c2心肌細胞缺氧模型，觀察阿魏酸甲酯預處理對細胞上清液中生化指標、ROS、線粒體膜電位、線粒體膜通透性轉換孔開放情況的影響。

LDH、CK是檢驗心臟受損的重要指標之一，當心肌細胞發(fā)生損傷后，細胞破裂，細胞質(zhì)中的LDH、CK會漏出，二者活力的大小直接反映心肌細胞受損程度[18]。本研究結果顯示，相較于缺氧模型組，阿魏酸甲酯高、中、低劑量組H9c2心肌細胞上清液中LDH、CK水平顯著降低，說明阿魏酸甲酯能夠維持細胞膜的完整性，減少LDH、CK的漏出，對受損的心肌細胞具有保護作用，且這種保護作用呈劑量依賴趨勢。

ROS作為一類含氧的化學物質(zhì)，性質(zhì)活潑且在細胞中易擴散;當心肌細胞處于缺血和缺氧狀態(tài)時，ROS會過度生成，誘發(fā)氧化應激[19-21]。MDA是脂膜過氧化作用的產(chǎn)物之一，細胞內(nèi)氧化程度越高，MDA水平越高[22]。在本研究中，與正常組比較，缺氧模型組ROS的熒光強度、MDA水平均顯著升高，說明缺氧造成了細胞損傷;而經(jīng)阿魏酸甲酯高、中、低劑量處理后，細胞中ROS的熒光強度和MDA水平均顯著降低，表明阿魏酸甲酯可有效清除自由基，有一定的抗氧化作用，這與其他研究結論一致[23]。

保護線粒體功能是治療心肌缺血的新選擇。已有研究證實，缺血會嚴重損傷線粒體的功能并伴隨ATP的生成障礙[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸甲酯顯著增加了細胞線粒體內(nèi)ATP水平，表明其可刺激心肌內(nèi)源性能量的生成。線粒體膜通透性轉換孔是位于線粒體內(nèi)膜上的非特異性通道，其開放會引起心肌不可逆損傷，表現(xiàn)為ATP生成障礙、ROS過度生成、鈣超載，繼而導致線粒體膜電位下降[25-26]。本研究結果顯示，與缺氧模型組比較，加入高、中、低劑量阿魏酸甲酯能穩(wěn)定線粒體膜電位，降低線粒體膜通透性轉換孔的開放程度，說明阿魏酸甲酯對缺氧損傷H9c2心肌細胞的線粒體功能有一定保護作用。

綜上所述，阿魏酸甲酯具有保護缺氧損傷H9c2心肌細胞線粒體功能的作用，且這種保護作用呈劑量依賴趨勢。其確切的信號通路有待后續(xù)實驗進一步研究。

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（收稿日期：2021-08-17 修回日期：2021-12-02）

（編輯：舒安琴）