攜帶丙型肝炎病毒的白內障患者房水中炎癥因子的表達分析△

陳淑瑩 唐婷婷 張景尚 萬修華

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全世界約有1.5億人是丙型肝炎病毒攜帶者，即HCV(+)患者[1]。最新研究發(fā)現(xiàn)，HCV(+)的白內障患者房水中的HCV RNA表達水平較高，足以造成病毒傳染[2]。HCV(+)同時也增加了白內障的患病風險，其中接受過干擾素-利巴韋林治療的患者患白內障風險更高[3-6]。目前，手術是治療白內障最有效的方法，在表面麻醉下，患者的良好配合是白內障手術成功的關鍵因素之一，患者的術中疼痛程度直接決定其配合程度[7-8]。大量的研究發(fā)現(xiàn)了一些可能加重白內障患者術中疼痛的因素，如：性別、年齡、焦慮、主視眼、高度近視、另一眼白內障手術史、合并青光眼或葡萄膜炎等其他眼部疾病等。近年有研究發(fā)現(xiàn)，攜帶乙型肝炎病毒[HBV(+)]的白內障患者術中疼痛閾值明顯低于正常白內障患者[9]，本研究團隊在HCV(+)白內障患者身上同樣發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，其具體機制目前尚未見研究報道。近年來有研究表明，HBV(+)白內障患者房水中與疼痛相關的炎癥因子表達升高，提示HBV(+)白內障患者更易發(fā)生術中疼痛[9-11]。因此，本研究擬采用人類細胞因子抗體陣列檢測技術對HCV(+)白內障患者和正常白內障患者的房水中炎癥因子進行檢測，為HCV(+)白內障患者較正常白內障患者術中疼痛更敏感這一現(xiàn)象提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年4月至2019年1月就診于首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院擬行白內障手術的34例患者為研究對象，其中，男14例、女20例，年齡45～88歲；靜脈血HCV(+)者17例為試驗組，靜脈血HCV(-)者17例為對照組。所有患者均擬行第一只眼的白內障手術。排除標準為合并高度近視、青光眼、葡萄膜炎、Graves眼病、眼部血管阻塞性疾病、黃斑視網(wǎng)膜前膜、年齡相關性黃斑變性和糖尿病的患者。本研究經(jīng)北京同仁醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者術前均簽署知情同意書。

1.2 術前HCV抗體及肝功能、腎功能檢測所有患者均于術前7 d留取空腹靜脈血標本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測HCV抗體情況；采用全自動生化分析儀檢測患者肝功能和腎功能常規(guī)指標，其中，肝功能檢測指標包括總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)(溴甲酚綠法)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽汁酸(TBA)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰氨基轉移酶(GGT)、前白蛋白(PAB)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、C反應蛋白(CRPC)；腎功能檢測指標包括：尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)(酶法)、尿酸(URIC)。所有指標均采用標準方法在北京同仁醫(yī)院的臨床實驗室檢測。

1.3 樣本采集所有患者均由同一位眼科醫(yī)生行房水樣本采集。患者常規(guī)眼部消毒后，在白內障手術過程中使用1 mL注射器從前房中抽取100～200 μL房水樣本，采集后立即置于-80 ℃冰箱低溫保存，直至用于炎癥因子含量檢測分析。

1.4 炎癥因子含量檢測采用人類細胞因子抗體陣列檢測技術(QAH-INF-3，Ray-Biotech公司)，利用雙抗體夾心免疫原理，檢測房水中40種炎癥因子的含量，具體為：腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、重組人TNF受體I(TNF RI)、重組人TNF受體II(TNF RII)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、重組人趨化因子CCL1(I-309)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、基質金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)-1、TIMP-2、重組人干擾素-γ(IFNg)、細胞間黏附分子(ICAM-1)、白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、重組人IL-1α(IL-1a)、重組人IL-1β(IL-1b)、IL-6受體(IL-6R)、IL-1受體拮抗因子(IL-1ra)、IL-12p40、IL-12p70、人血漿炎性趨化因子(MIG)、B淋巴細胞趨化因子(BLC)、趨化因子配體5(RANTES)、粒性白細胞菌落刺激因子(G-CSF)、血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-1α(MIP-1a)、MIP-1β(MIP-1b)、MIP-1δ(MIP-1d)、嗜酸性粒細胞趨化蛋白(Eotaxin)、Eotaxin-2、粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)。

定量芯片配備有標準蛋白質混合物，房水樣本加到芯片上之后，房水中的炎癥因子將與芯片上的標準蛋白混合物結合，并將炎癥因子固定在芯片的特定位置上。將Cy3-鏈霉親和素與固定在芯片上的40種炎癥因子抗體混合物進行共孵育，形成抗原抗體復合物。然后用激光掃描儀(InnoScan 300 Microarray Scanner,Innopsys公司，法國) 的Cy3通道(激發(fā)光頻率532 nm)掃描信號進行熒光檢測，通過化學發(fā)光顯影系統(tǒng)檢測芯片上的熒光信號強度，采用QAH-INF-3數(shù)據(jù)分析軟件對各結合點的光密度進行測量分析，計算各炎癥因子含量。每個樣品測量四次，取平均值記錄。

2 結果

2.1 患者的一般情況分析試驗組和對照組患者的年齡、性別及眼別構成差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，具有一定的可比性(表1)。

表1 試驗組與對照組患者一般資料對比

2.2 兩組患者術前肝功能和腎功能常規(guī)檢測結果分析試驗組和對照組患者肝功能、腎功能常規(guī)指標檢測結果見表2。由表2知，試驗組與對照組白內障患者間的肝功能、腎功能各常規(guī)指標差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

表2 試驗組與對照組白內障患者的肝功能和腎功能常規(guī)指標檢查結果對比

2.3 房水中40種炎癥因子含量分析兩組白內障患者房水中40種炎癥因子含量檢測結果見表3。由表3知，炎癥因子M-CSF、I-309、MCP-1在試驗組白內障患者房水中的含量均顯著高于對照組，TNF-β在試驗組白內障患者房水中的含量顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，其余36種炎癥因子在兩組白內障患者房水中的含量差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

表3 試驗組與對照組白內障患者房水中各炎癥因子的含量對比

續(xù)表3

3 討論

本研究首次對HCV(+)白內障患者和正常白內障患者的房水中炎癥因子含量進行了對比，同時對比了兩組患者術前的肝功能和腎功能。結果發(fā)現(xiàn)，TNF-β、M-CSF、I-309、MCP-1這4種炎癥因子在HCV(+)白內障患者和正常白內障患者房水中的含量差異均存在統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，試驗組與對照組患者肝功能和腎功能各項常規(guī)指標間差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

房水中有許多炎癥因子，這些炎癥因子在不同的眼病，如葡萄膜炎、青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變中的表達顯著不同[12]。目前未見有研究探討 HCV(+) 白內障患者與正常白內障患者房水中炎癥因子表達的差異。這可能是因為房水中存在的蛋白質含量很低，精確、定量地評價前房內炎癥反應的難度較大。本研究采用人類細胞因子抗體陣列檢測技術檢測房水中炎癥因子的表達，與傳統(tǒng)檢測方法相比具有顯著的優(yōu)勢，該方法只需要極少量的蛋白質樣品即可檢測多種炎癥因子的表達，適用于測量房水中的蛋白含量[11]。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，HCV(+)白內障患者的房水中TNF-β的含量較正常白內障患者降低，而TNF-β是一種具有炎癥抑制作用的細胞因子，具有抗炎作用的細胞因子表達增強可以有效緩解神經(jīng)損傷帶來的疼痛感，利用這種內源性抗炎能力可以有效地治療慢性神經(jīng)病理性疼痛[13]。TNF-β的炎癥抑制作用與疼痛的緩解相關，TNF-β的表達降低會導致其對炎癥的抑制作用減弱，炎癥反應增強最終加重傷害性損傷引起的痛覺[13-14]。因此我們推論，房水中TNF-β的表達降低會導致HCV(+)白內障患者的內源性抗炎作用降低，使HCV(+)白內障患者炎癥反應增強，從而較正常白內障患者更易感知術中疼痛。

M-CSF的主要功能為通過受體(CSF-1R或c-Fms)調節(jié)單核細胞/巨噬細胞譜系的發(fā)育，并在組織中局部作用以控制巨噬細胞的數(shù)量和功能，并且通過對小膠質細胞的中樞作用參與神經(jīng)性疼痛的控制[15]。Jabońska等[16]研究發(fā)現(xiàn)，外周血中M-CSF的高表達與HCV(+)患者的肝臟炎癥活動密切相關，并且可以作為觀測指標反映患者治療初期的免疫激活效果。在其他領域也研究發(fā)現(xiàn)M-CSF與疼痛具有一定相關性。Okubo等[17]研究顯示，向周圍神經(jīng)損傷導致疼痛敏感的大鼠行鞘內注射M-CSF受體抑制劑后，可明顯減輕大鼠的早期神經(jīng)痛癥狀，此外，行鞘內注射重組M-CSF可誘導大鼠的機械性痛覺超敏。這一研究證明，M-CSF是一種初級傳入神經(jīng)的疼痛相關因子，能夠誘導大鼠產(chǎn)生周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)病理性疼痛。Saleh等[18]提出全身給予CSF-1R或CSF-1單抗可抑制M-CSF所誘導的小鼠炎癥引起的疼痛，表明M-CSF在炎癥引起的疼痛的發(fā)生過程中具有外周誘導功能，是誘導疼痛產(chǎn)生的重要因子。本研究結果顯示，HCV(+)白內障患者房水中M-CSF表達較正常白內障患者增高，M-CSF表達增高與HCV(+)白內障患者術中疼痛更敏感密切相關。

I-309是活化的T淋巴細胞、肥大細胞和單核細胞的產(chǎn)物，是參與免疫應答和血管生成調節(jié)的重要趨化因子。在傷口修復、腫瘤生長等多個過程中發(fā)揮重要作用。多領域研究發(fā)現(xiàn)，I-309通過上調神經(jīng)興奮性突觸的AMPA受體的磷酸化介導神經(jīng)炎性相關的病理性疼痛。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，向脛骨骨折復位術后慢性疼痛的小鼠行鞘內注射AMPA受體抑制劑可以減輕疼痛，且鞘內注射外源性I-309促進了小鼠的急性疼痛行為和AMPA受體的磷酸化。這一發(fā)現(xiàn)說明，I-309介導的AMPA受體激活在骨折復位術后病理性疼痛的產(chǎn)生中起著至關重要的作用。本研究中，I-309在HCV(+)白內障患者房水中的表達較正常白內障患者明顯增高，房水中 I-309 高表達是HCV(+)白內障患者術中疼痛更敏感的一個重要因素。

MCP-1也稱為單核細胞趨化和活化因子，是一種疼痛相關的炎癥趨化因子[20]?；A研究結果表明，MCP-1的表達受背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的調控[21-22]。MCP-1發(fā)揮的作用是增加周圍神經(jīng)損傷后痛覺神經(jīng)元的興奮性，阻斷MCP-1/CCR2信號通路可以減輕神經(jīng)性疼痛，這表明MCP-1可以通過增強外周神經(jīng)元功能來增強疼痛敏感性。不僅如此，MCP-1還可以產(chǎn)生中樞痛覺致敏效果，其機制是通過增加自發(fā)興奮性突觸后電流的幅度和頻率，同時降低自發(fā)抑制性突觸后電流的幅度和頻率，來提高疼痛信號在脊髓后角膠狀質細胞層神經(jīng)元中傳遞的效率。

炎癥因子在痛覺傳導方面發(fā)揮著重要作用，這種現(xiàn)象在醫(yī)學的其他專業(yè)領域也得到了確認[23-26]。在本研究中，多種炎癥因子在HCV(+)白內障患者房水中表達水平與正常白內障患者明顯不同，因此我們認為，HCV(+)白內障患者術中對于疼痛更敏感的原因可能與房水中炎癥因子的差異表達有關。

HCV(+)患者一般都存在不同程度的肝細胞損傷，損傷后的肝細胞內容物外滲到血清中，ALT分布于肝細胞的細胞質中，AST分布于肝細胞的線粒體中，血清ALT和AST異常一般提示HCV感染已發(fā)展到丙型肝炎。HCV損傷肝細胞時ALT可通過細胞膜釋放入血，AST則需要在線粒體溶解后釋放入血，因此，血清ALT水平是反映肝損傷最敏感的指標之一[27]。ALT可在一些急性肝損傷(如急性肝炎)時出現(xiàn)顯著的急劇升高，也可能在慢性肝炎、肝硬化、肝癌等疾病中升高[27]。在重型肝炎和中重型肝炎患者中，血清中AST水平也顯著升高，臨床上也常使用AST/ALT的比值作為評估肝臟病變情況的指標。本研究據(jù)此對所有患者的AST/ALT的比值進行計算分析，試驗組與對照組患者間該數(shù)值的差異并無統(tǒng)計學意義。隨著機體HCV病毒復制水平的提升，AST、ALT異常的發(fā)生率也在提升。當肝細胞受損時，ALT和AST釋放入血，血清中ALT、AST水平升高，能以此來判斷丙型肝炎病情的嚴重程度。本研究中兩組患者間肝功能各項常規(guī)指標均未見明顯差異，可能是由于本研究中HCV(+)患者并未發(fā)展到丙型肝炎，或是嚴重程度未對肝功能造成明顯影響所致。

本研究仍有一定的局限性。本研究中納入的樣本數(shù)量較少，可能存在一定的選擇偏倚。這一局限性主要是由于臨床上HCV(+)白內障患者數(shù)量較少所致，需要進一步的長期臨床研究擴大樣本量進一步檢測并驗證。此外，本研究分析得出HCV(+)白內障患者房水中炎癥因子的表達變化是術中更容易感知疼痛的原因之一，但HCV(+)白內障患者房水炎癥因子升高的具體機制及炎癥因子引起疼痛的確切機制尚不清楚，有待進一步研究。此外，HCV感染是一個全身性的疾病，在人體的各個系統(tǒng)均有表現(xiàn)，對人體各部分組織液中的炎癥因子表達水平都會產(chǎn)生影響[28-29]，因此，仍需進一步探索外周血中炎癥因子的表達差異與房水中炎癥因子表達是否有關系。理論上，由于血-視網(wǎng)膜屏障和血-房水屏障的存在，房水中的炎癥因子的表達相對更獨立一些，更能反映眼部疾病的癥狀與體征。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HCV(+)白內障患者房水中M-CSF、I-309、MCP-1的表達顯著高于正常白內障患者，TNF-β的表達顯著低于正常白內障患者。這可能是HCV(+)白內障患者術中疼痛更敏感的原因之一。本研究結果為在臨床上減少HCV(+)白內障患者術中疼痛提供了新的思路。