長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)核仁小RNA宿主基因7(SNHG7)對(duì)葡萄膜黑色素瘤癌細(xì)胞增殖和侵襲力的影響△

張 菡 高 彥 薛春麗 陳 濤

葡萄膜黑色素瘤是一種起源于葡萄膜的眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期[1]，且易通過血流發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，約有一半的患者會(huì)出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，而且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[2]。盡管現(xiàn)有治療方案不斷進(jìn)步和完善，但患者預(yù)后依然欠佳[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是含有超過200個(gè)核苷酸但很少翻譯為蛋白質(zhì)的RNA，廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，可通過對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯后修飾及表觀遺傳學(xué)等方面的調(diào)控參與多種病理生理過程[4]。近年來其在腫瘤發(fā)生與進(jìn)展中的作用越來越受到重視[5]。核仁小RNA宿主基因7(SNHG7)是一種重要的lncRNA，在多種惡性腫瘤組織中均呈高表達(dá)，且與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等有關(guān)[6]。然而，其是否參與了葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移過程，鮮有報(bào)道。本研究探討lncRNA SNHG7對(duì)葡萄膜黑色素瘤癌細(xì)胞增殖和侵襲力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源選取2011年8月至2019年8月在我院行手術(shù)治療的葡萄膜黑色素瘤患者71例71眼作為葡萄膜黑色素瘤組，術(shù)前均未接受放射治療或化學(xué)治療，經(jīng)病理學(xué)檢查確診。71例患者中,男41例，女30例，年齡24～75(46.7±11.5)歲；病理學(xué)類型：梭形細(xì)胞33眼，上皮細(xì)胞21眼，混合細(xì)胞17眼；右眼39例，左眼32例；腫瘤部位：睫狀體25眼，脈絡(luò)膜46例；出現(xiàn)鞏膜浸潤(rùn)31眼。所有患者留取葡萄膜黑色素瘤組織標(biāo)本，置于液氮中，-80 ℃保存。同期，選取因外傷摘除且葡萄膜完整、眼球正常的患者40例40眼作為正常組，取患者眼球組織行病理學(xué)檢查以排除葡萄膜黑色素瘤，其中男26例，女14例，年齡22～77(47.1±12.8)歲；右眼24例，左眼16例，均置于液氮中，-80 ℃保存。正常組患者與葡萄膜黑色素瘤組患者性別構(gòu)成、年齡、患眼眼別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。本研究遵循《赫爾辛基宣言》所要求的倫理學(xué)原則，患者均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組患者眼球組織中SNHG7表達(dá)取患者眼球組織，剪碎、冰上研磨，加入細(xì)胞裂解液，按試劑盒說明書步驟提取總RNA并檢測(cè)其純度。分別利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR完成逆轉(zhuǎn)錄及引物擴(kuò)增。SNHG7：上游引物序列：5’-GCCCTGCAGCCTCGC-3’，下游引物序列：5’-CAGCGGCGCCTCCTC-3’；GAPDH：上游引物序列：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，下游引物序列：5’-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。采用2-△△Ct法計(jì)算SNHG7相對(duì)表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分

1.3.1 主要試劑和設(shè)備總RNA提取試劑(Trizol法)、Lipofectamine 2000試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，人葡萄膜黑色素瘤M23細(xì)胞(上海信裕生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、鏈霉素和青霉素(青島捷世康生物科技有限公司)，CCK-8試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，Transwell小室(上海玉博生物科技有限公司)，Martrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)，StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。SNHG7引物序列由上海索萊寶生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，SNHG7干擾序列及對(duì)照序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理將M23細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放入37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行分組處理。(1)SNHG7干擾組：轉(zhuǎn)染SNHG7干擾序列(正義鏈：5’-CCCAAGCTTCTCTGCGTGCGCCGGAGGCT-3’，反義鏈：5’-CCCGGGAACGTTTTCCATTCAAGACCAATTTA-3’)；(2)陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列(正義鏈：5’-CCCAAGCTTGGGTGGCGAATTCGGCACGA-3’，反義鏈：5’-CATGCCATGGTGGTAAACCAAACCAATGATAAA-3’)；(3)空白組：不作任何處理。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中SNHG7表達(dá)取各組轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，其余步驟同1.2。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性M23細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種于96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，分組處理后，各組細(xì)胞分別于轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)，各孔加入CCK-8液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)60 min。利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處分別檢測(cè)各孔光密度(D)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力用不含血清的DMEM液對(duì)基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋，取80 μL加入到Transwell 小室上室，過夜風(fēng)干。取各組轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，沉淀后加入無血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為500×106個(gè)·L-1，取0.2 mL加入到小室上室，下室則加入0.6 mL含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，用棉簽將散落細(xì)胞去除，鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者眼球組織中SNHG7表達(dá)情況葡萄膜黑色素瘤組患者眼球組織中SNHG7的相對(duì)表達(dá)量為2.05±0.16，正常組患者眼球組織中SNHG7的相對(duì)表達(dá)量為1.01±0.07，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=39.461，P<0.001)。

2.2 葡萄膜黑色素瘤組不同臨床指標(biāo)患者眼球組織中SNHG7表達(dá)情況葡萄膜黑色素瘤組患者不同性別、年齡、腫瘤高度、病理學(xué)類型、患眼眼別、腫瘤部位和是否視網(wǎng)膜脫離眼球組織中SNHG7相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；而發(fā)生鞏膜浸潤(rùn)和眼外生長(zhǎng)的患者眼球組織中SNHG7相對(duì)表達(dá)量均較無鞏膜浸潤(rùn)和無眼外生長(zhǎng)的患者高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(表1)。

表1 葡萄膜黑色素瘤組不同臨床指標(biāo)患者眼球組織中SNHG7表達(dá)情況

2.3 3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后SNHG7表達(dá)情況轉(zhuǎn)染后48 h，SNHG7干擾組細(xì)胞SNHG7相對(duì)表達(dá)量(0.27±0.09)明顯低于陰性對(duì)照組(1.01±0.07)和空白組(1.03±0.09)(均為P<0.001)。

2.4 3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后增殖情況CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白組相比，SNHG7干擾組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)D均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；培養(yǎng)12 h時(shí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間D

2.5 3組細(xì)胞的侵襲情況轉(zhuǎn)染后48 h，SNHG7干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)為(89.77±9.82)個(gè)，顯著低于陰性對(duì)照組[(133.14±7.54)個(gè)]和空白組[(137.09±10.05)個(gè)](均為P<0.001)(圖1)。

圖1 結(jié)晶紫染色顯示轉(zhuǎn)染后48 h 3組細(xì)胞侵襲情況

3 討論

葡萄膜黑色素瘤癌細(xì)胞是一種增殖活性高、侵襲力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞，可經(jīng)血流而轉(zhuǎn)移至眼外其他組織或器官，在腫瘤早期階段便可發(fā)生轉(zhuǎn)移[7]，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者死亡率在50%以上，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移成為影響患者預(yù)后的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[8]。然而，與葡萄膜黑色素瘤癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制及敏感基因尚不確定。lncRNA是一類不編碼或少量編碼蛋白的RNA序列，可在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，從而參與各種疾病的發(fā)生及發(fā)展[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與眼內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)生和惡化密切相關(guān)[9]。SNHG7作為一種lncRNA，位于人染色體9q34.3，在乳腺癌[10]、胃癌[11]等多種惡性腫瘤組織中均表達(dá)異常，且與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，SNHG7在葡萄膜黑色素瘤患者眼球組織中的相對(duì)表達(dá)量高于正常眼球組織，說明葡萄膜黑色素瘤組織中SNHG7呈高表達(dá)，其可能參與了葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病過程。此外，在發(fā)生鞏膜浸潤(rùn)和眼外生長(zhǎng)的患者眼球組織中SNHG7相對(duì)表達(dá)量均較無鞏膜浸潤(rùn)和無眼外生長(zhǎng)的患者高，說明SNHG7可能參與了葡萄膜黑色素瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程。

Wang等[12]研究指出，SNHG7通過抑制P15和P16蛋白表達(dá)來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。同時(shí)，SNHG7可促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖[13]。本研究通過轉(zhuǎn)染干擾序列的方法特異性下調(diào)M23細(xì)胞中SNHG7表達(dá)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后48 h SNHG7干擾組細(xì)胞SNHG7相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組和空白組，說明SNHG7干擾組細(xì)胞中SNHG7基因表達(dá)被成功抑制。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白組相比，SNHG7干擾組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)D均降低，說明下調(diào)M23細(xì)胞中SNHG7表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，提示SNHG7可能參與了M23細(xì)胞增殖過程。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG7通過上調(diào)SOX4促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。且SNHG7可加速宮頸癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白組相比，轉(zhuǎn)染后48 h SNHG7干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，說明下調(diào)SNHG7表達(dá)可抑制細(xì)胞侵襲，提示SNHG7可能參與了M23細(xì)胞侵襲過程。

綜上所述，葡萄膜黑色素瘤患者眼球組織中SNHG7呈高表達(dá)，且SNHG7高表達(dá)與腫瘤組織鞏膜浸潤(rùn)和眼外生長(zhǎng)有關(guān)，下調(diào)SNHG7表達(dá)可阻礙M23細(xì)胞增殖和侵襲，這可能為葡萄膜黑色素瘤發(fā)病機(jī)制及臨床診療提供新的研究方向。