黑魚膠原溶液的流變、熱穩(wěn)定性及化學(xué)交聯(lián)改性研究

劉文濤，白聰，沈里瑞

（1.四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065；2.四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國(guó)家工程研究中心，四川 成都 610065；3.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065）

引言

膠原是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分，是動(dòng)物結(jié)締組織的主要纖維蛋白，因其優(yōu)良的生物相容性、生物降解性、低抗原性等性質(zhì)，被廣泛用于化妝品、制藥、食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1-3]。目前，商品化膠原主要取材于牛、豬等陸生哺乳動(dòng)物的皮、腱、骨等結(jié)締組織，但由于瘋牛病、口蹄疫等人畜共患病在世界范圍內(nèi)的頻繁爆發(fā)，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物膠原及其制品存在較大的生物安全風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。因此，尋求能夠完全或部分替代哺乳動(dòng)物膠原的新型膠原材料是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[7-9]。相對(duì)而言，從魚加工廢棄物中提取的魚膠原具有生物安全性好、原料來(lái)源豐富且成本低廉等優(yōu)勢(shì)，因而當(dāng)前圍繞魚膠原的制備、改性及應(yīng)用的研究方興未艾[10-12]。

I型膠原是動(dòng)物皮（牛皮、魚皮等）中含量最多的膠原類型[1]。不論是牛皮還是魚皮，從中提取的I型膠原分子都具有由3條多肽鏈相互纏繞而成的三股螺旋結(jié)構(gòu)，其分子長(zhǎng)度約為300 nm，相對(duì)分子質(zhì)量約為30萬(wàn)[1，10，13]。然而，膠原的氨基酸組成、熱穩(wěn)定性等性質(zhì)與動(dòng)物的種屬及生存環(huán)境密切相關(guān)。一般而言，陸生哺乳動(dòng)物膠原比魚膠原的熱穩(wěn)定性更好，這主要是由于前者的亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量更高，而亞氨基酸對(duì)于氫鍵的形成及三股螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定都至關(guān)重要[13，14]。因此，基于魚膠原和牛皮膠原結(jié)構(gòu)與性能的異同，目前已有大量關(guān)于不同來(lái)源魚膠原的研究報(bào)道，但其相關(guān)信息仍然不足以支撐魚膠原的規(guī)模化開(kāi)發(fā)利用。其一，魚膠原在制備與應(yīng)用過(guò)程中通常會(huì)涉及膠原溶液的加工處理（如萃取、膠凝、紡絲和成膜），故充分了解膠原溶液的流變性能非常重要[15-17]，然而鮮見(jiàn)有關(guān)魚膠原溶液的流變學(xué)研究。例如，Zhang等[18]測(cè)試了較高濃度（10~20 mg/mL）大鰭鳠魚皮膠原溶液的流變性能，但也有必要了解較低濃度的魚膠原溶液（如膠原提取液）的流變行為及其與牛皮膠原溶液的差異。其二，魚膠原作為一類蛋白質(zhì)材料，理解其熱穩(wěn)定性及與哺乳動(dòng)物膠原的區(qū)別對(duì)其實(shí)際應(yīng)用具有重要意義[19-22]，但膠原的熱穩(wěn)定性測(cè)試高度依賴于樣品狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)條件[10，14]，甚至于針對(duì)同一來(lái)源魚膠原的不同文獻(xiàn)報(bào)道的膠原變性溫度數(shù)值存在差異，從而缺乏在相同條件下對(duì)各種膠原材料熱穩(wěn)定性的比較研究。其三，與哺乳動(dòng)物膠原相比，魚膠原較差的熱穩(wěn)定性與機(jī)械力學(xué)性能限制了其實(shí)際應(yīng)用[11]，進(jìn)而需要通過(guò)交聯(lián)或共混策略強(qiáng)化材料的綜合性能，但關(guān)于魚膠原的改性研究較為少見(jiàn)。例如，已有報(bào)道采用“零長(zhǎng)度”的碳化二亞胺交聯(lián)劑增強(qiáng)鮭魚膠原的熱穩(wěn)定性[11]，然而關(guān)于交聯(lián)劑分子長(zhǎng)度對(duì)魚膠原改性效果的影響尚不清楚。

本文對(duì)比研究了相同濃度（5 mg/mL）的黑魚膠原與牛皮膠原溶液的流變和熱穩(wěn)定性，并考察了溫度對(duì)黑魚膠原的動(dòng)態(tài)粘彈性以及成纖維性能的影響，最后分析比較了兩種交聯(lián)劑（己二酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯、戊二醛）對(duì)黑魚膠原溶液的交聯(lián)改性效果，為黑魚膠原的高值轉(zhuǎn)化利用提供理論和技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 主要材料

黑魚魚皮和牛皮I型膠原海綿均為實(shí)驗(yàn)室自制，分別參照文獻(xiàn)方法制備[8，16]；冰醋酸、己二酸、戊二醛、丙酮、二甲亞砜（DMSO）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉均為分析純，購(gòu)自成都科龍化工試劑廠；高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為電泳級(jí)，購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）均為分析純，購(gòu)自上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司；去離子水（自制）；其它化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器

3700高速冷凍離心機(jī)，日本KUBOTA公司；FD-1冷凍真空干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DZF-300真空干燥箱，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；pHS-3C型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Mini-PROTEAN 3 Cell Assembly電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Gemini 200動(dòng)態(tài)流變儀，英國(guó)Malven公司；Lambda 25紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)PERKIN-ELMER公司；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜（FTIR）儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；DSC 200PC差示掃描量熱儀，德國(guó)NETZSCH公司；Agilent 400-MR DD2核磁共振波譜儀，美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠原溶液的流變測(cè)試

動(dòng)態(tài)頻率掃描：用0.1 mol/L醋酸分別配制相同濃度（5 mg/mL）的黑魚魚皮膠原和牛皮膠原溶液，在18℃下用動(dòng)態(tài)流變儀檢測(cè)彈性模量G‘、粘性模量G‘‘、損耗角正切Tanδ（G‘‘/G‘）和復(fù)數(shù)粘度η*隨掃描頻率的變化情況；采用錐形板夾具（錐角4°、直徑40 mm），應(yīng)變5%，掃描頻率為0.01~10 Hz。

溫度對(duì)膠原溶液動(dòng)態(tài)粘彈性的影響：用上述動(dòng)態(tài)流變儀對(duì)5 mg/mL黑魚膠原溶液進(jìn)行線性升溫并掃描收集流變數(shù)據(jù)；固定頻率1 Hz，應(yīng)變5%，升溫速率0.5℃/min，掃描溫度區(qū)間18~40℃。

1.2.2 差示掃描量熱（DSC）分析

分別以相同濃度（5 mg/mL）的黑魚膠原和牛皮膠原溶液為測(cè)試對(duì)象，考察膠原熱變性DSC曲線隨升溫速率的變化規(guī)律。樣品參比為0.1 mol/L醋酸，氮?dú)獗Ｗo(hù)60 mL/min，升溫速率采用2、5和8℃/min，溫度區(qū)間4~60℃。

1.2.3 熱動(dòng)力學(xué)分析

采用熱動(dòng)力學(xué)分析手段（基于多重升溫速率的等轉(zhuǎn)化率法：Friedman法和OFW法）[21，22]，分別對(duì)1.2.2獲得的兩種膠原的DSC曲線進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，對(duì)比考察不同膠原熱變性活化能隨轉(zhuǎn)化率的變化規(guī)律。

1.2.4 膠原成纖維濁度曲線測(cè)定

用0.01 mol/L醋酸配制5 mg/mL黑魚膠原溶液，將其用含氯化鈉的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，最終所得膠原溶液的各項(xiàng)參數(shù)分別為：膠原濃度1 mg/mL、磷酸鹽濃度10 mmol/L、氯化鈉濃度80 mmol/L、pH值7.1。采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)樣品吸光度變化得到膠原成纖維濁度曲線，掃描波長(zhǎng)為313 nm。根據(jù)濁度曲線分別計(jì)算達(dá)到最大吸光度值一半所需時(shí)間（t1/2）和達(dá)到平衡時(shí)吸光度的變化值（h），對(duì)比考察溫度28、29、30、31和32℃對(duì)黑魚膠原成纖維動(dòng)力學(xué)的影響。

1.2.5 己二酸NHS酯的合成與表征

在文獻(xiàn)報(bào)道合成方法[23]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了調(diào)整：先用丙酮將己二酸和NHS溶解，然后向混合溶液中加入EDC·HCl，在常溫下攪拌反應(yīng)24 h后，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，采用結(jié)晶、真空干燥等方法對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到己二酸NHS酯。用核磁共振（NMR）對(duì)樣品結(jié)構(gòu)進(jìn)行1H NMR表征；采用FTIR驗(yàn)證酯基官能團(tuán)，掃描波數(shù)450~4000 cm-1，分辨率為2 cm-1。

1.2.6 黑魚膠原溶液的交聯(lián)改性

酸性條件下的交聯(lián)改性：用0.1 mol/L醋酸配制5 mg/mL黑魚膠原溶液，用DMSO配制0.125 mol/L己二酸NHS酯溶液，將其逐滴加入黑魚膠原溶液中，使得NHS酯活性基團(tuán)與膠原氨基的摩爾比為1，在18℃下分別反應(yīng)24 h和72 h后，用甘氨酸中止反應(yīng)并對(duì)0.1 mol/L醋酸進(jìn)行透析，分別得到NHS酯改性黑魚膠原SSC(a-N1)和SSC(a-N1×3)；按照類似方法，采用0.125 mol/L戊二醛水溶液，制備得到戊二醛改性黑魚膠原SSC(a-G1)和SSC(a-G1×3)。

堿性條件下的交聯(lián)改性：將0.125 mol/L己二酸NHS酯溶液分別逐滴加入四份5 mg/mL黑魚膠原溶液中，使得NHS酯活性基團(tuán)與膠原氨基的摩爾比分別為1/6、1/2、1和1，快速攪拌均勻，再用NaOH調(diào)pH約為10，在18℃下分別反應(yīng)24、24、24和72 h后，用甘氨酸中止反應(yīng)，再用0.1 mol/L醋酸透析，分別得到NHS酯改性黑魚膠原SSC(b-N1/6)、SSC(b-N1/2)、SSC(b-N1)和SSC(b-N1×3)；按照類似方法，分別制備得到戊二醛改性魚膠原樣品SSC(b-G1/6)、SSC(b-G1/2)、SSC(b-G1)和SSC(b-G1×3)。

1.2.7 交聯(lián)改性黑魚膠原的表征

電泳測(cè)定：參照文獻(xiàn)報(bào)道方法[12]，將1.2.6所述12種改性魚膠原樣品分別與電泳樣品處理液混合，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）手段考察不同的化學(xué)交聯(lián)改性條件對(duì)黑魚膠原結(jié)構(gòu)的影響，以未改性膠原樣品作為對(duì)照。

熱分析：采用DSC對(duì)比考察改性前后黑魚膠原樣品的熱變性情況，升溫速率5℃/min，掃描溫度區(qū)間4~70℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑魚膠原溶液的動(dòng)態(tài)流變性能

流變測(cè)試能夠獲得高分子材料在應(yīng)力/應(yīng)變條件下的動(dòng)態(tài)粘彈性信息。圖1展示了相同濃度的黑魚膠原和牛皮膠原溶液的動(dòng)態(tài)粘彈性參數(shù)（G‘、G‘‘、Tanδ和η*）隨頻率的變化規(guī)律。

由圖1（a）和（b）可知，兩種膠原溶液的彈性模量和粘性模量都隨著掃描頻率的增加而升高，而且在相同頻率下（個(gè)別高頻區(qū)除外）黑魚膠原溶液的粘彈性模量均低于牛皮膠原溶液的相應(yīng)模量。此外，從圖1（c）和（d）發(fā)現(xiàn)，牛皮膠原和黑魚膠原溶液由粘性流動(dòng)轉(zhuǎn)變?yōu)閺椥粤鲃?dòng)的交叉點(diǎn)頻率分別為0.88 Hz和1.51 Hz。在交叉點(diǎn)頻率以下，兩種膠原溶液的G‘＜G‘‘，表現(xiàn)為似液體的粘性流動(dòng)行為，而在交叉點(diǎn)頻率以上，二者轉(zhuǎn)變?yōu)樗乒腆w的彈性流動(dòng)行為（G‘＞G‘‘）。交叉點(diǎn)頻率與分子鏈段的松弛特性有關(guān)，頻率越大表明松弛越快，可見(jiàn)黑魚膠原比牛皮膠原分子的鏈段松弛更快。相對(duì)而言，兩種膠原溶液的損耗角正切都隨著頻率的增加而降低，且黑魚膠原溶液的Tanδ均大于相同頻率（當(dāng)頻率低于4 Hz）下牛皮膠原溶液的Tanδ（見(jiàn)圖1（e））。當(dāng)頻率低于0.8 Hz時(shí)，Tanδ都大于1，表明此時(shí)兩種膠原溶液都是粘性特征占主導(dǎo)地位，然而牛皮膠原比黑魚膠原的Tanδ小，這可能是由于牛皮膠原分子鏈段纏結(jié)程度更高[16]，鏈段運(yùn)動(dòng)時(shí)的內(nèi)摩擦力更大，從而使鏈段運(yùn)動(dòng)受阻，表現(xiàn)為彈性特征相對(duì)略強(qiáng)。另外，兩種膠原溶液的復(fù)數(shù)粘度也都隨著頻率增加而降低（圖1（f）），呈現(xiàn)剪切變稀流變行為，且在相同頻率下黑魚膠原比牛皮膠原溶液的η*更小，說(shuō)明黑魚膠原比牛皮膠原分子纏結(jié)程度更低。

圖1 黑魚膠原（SSC）和牛皮膠原（BHC）溶液的G‘（a）與G‘‘（b）對(duì)頻率的依賴關(guān)系；牛皮膠原（c）和黑魚膠原（d）溶液的G‘與G‘‘的交叉點(diǎn)頻率；膠原溶液的Tanδ（e）與η＊（f）對(duì)頻率的依賴關(guān)系Fig.1 The dependences of storage modulus(G‘)(a)and loss modulus(G‘‘)(b)for the snakehead skin collagen(SSC)and bovine hide collagen(BHC)solutions on dynamic frequency.The crossover frequency of dynamic modulus(G‘a(chǎn)nd G‘‘)for the BHC(c)and SSC(d)solutions.The dependences of loss tangent(Tanδ)(e)?and complex viscosity(η*)(f)for the collagen solutions on dynamic frequency

流變和熱穩(wěn)定性是魚膠原區(qū)別于哺乳動(dòng)物膠原的兩大顯著特征[1]。在上述動(dòng)態(tài)頻率掃描的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了溫度對(duì)黑魚膠原溶液動(dòng)態(tài)粘彈性的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 黑魚膠原溶液（5 mg/mL）的彈性模量G‘和粘性模量G"（a）以及復(fù)數(shù)黏度η＊和損耗角正切Tanδ（b）對(duì)溫度的依賴關(guān)系Fig.2 Temperature dependences of the dynamic modulus(G‘a(chǎn)nd G")(a)as well as the complex viscosity(η*)and loss tangent(tanδ)(b)for the snakehead skin collagen(SSC)solution(5 mg/mL)

從圖中可看出，當(dāng)溫度低于26℃時(shí)，隨著溫度的上升，G‘‘和η*逐漸下降而G‘和Tanδ變化不大；當(dāng)溫度介于26~32℃，G‘‘和η*都快速下降，同時(shí)Tanδ出現(xiàn)最大峰值，這是由于溫度誘導(dǎo)膠原構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，即從天然的三股螺旋結(jié)構(gòu)變性為無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象[16-18]。通常把升溫流變測(cè)試時(shí)Tanδ的峰值對(duì)應(yīng)的溫度稱為膠原的動(dòng)態(tài)變性溫度（Tdd），牛皮膠原、大鰭鳠膠原和黑魚膠原的Tdd分別為32.6℃[16]、29.5℃[18]和29.2℃，表明黑魚膠原的動(dòng)態(tài)流變穩(wěn)定性與大鰭鳠膠原相當(dāng)，但二者都低于牛皮膠原。

2.2 黑魚膠原溶液的熱穩(wěn)定性分析

本文從以下3個(gè)方面研究考察了黑魚膠原溶液的熱穩(wěn)定性：1）比較相同濃度黑魚膠原和牛皮膠原溶液在多個(gè)升溫速率下的DSC曲線，見(jiàn)圖3；2）基于等轉(zhuǎn)化率法動(dòng)力學(xué)分析，從活化能角度對(duì)比兩種膠原溶液的熱行為，見(jiàn)圖4；3）考察不同溫度對(duì)黑魚膠原成纖維過(guò)程的影響，見(jiàn)圖5。

由圖3可知，兩種膠原溶液的DSC吸熱峰都隨著升溫速率的增加而向高溫方向移動(dòng)，說(shuō)明二者的熱變性都是動(dòng)力學(xué)控制過(guò)程[21，22]。在相同升溫速率下，黑魚膠原的熱變性DSC峰值溫度明顯低于牛皮膠原的相應(yīng)數(shù)值，分別為2℃/min：31.1℃和39.3℃；5℃/min：32.3℃和40.4℃；8℃/min：32.9℃和40.9℃，說(shuō)明黑魚膠原的熱穩(wěn)定性相對(duì)牛皮膠原較弱。

為了進(jìn)一步挖掘圖3中DSC曲線的熱動(dòng)力學(xué)信息，采用等轉(zhuǎn)化率法（Friedman法和OFW法）考察了膠原熱變性活化能隨轉(zhuǎn)化率的變化規(guī)律。由圖4可知，盡管兩種等轉(zhuǎn)化率法對(duì)于同一膠原樣品的分析結(jié)果存在一定差異，但黑魚膠原和牛皮膠原的熱變性活化能隨轉(zhuǎn)化率的增加都是整體呈下降趨勢(shì)，且近似于先凹后凸，這說(shuō)明兩種膠原的熱變性過(guò)程都為多步復(fù)雜反應(yīng)[21,22]。特別需要強(qiáng)調(diào)的是，在熱變性的初始階段（轉(zhuǎn)化率小于0.5），相同轉(zhuǎn)化率下黑魚膠原的熱變性活化能低于牛皮膠原的活化能，表明黑魚膠原的熱穩(wěn)定性略差。

圖3 黑魚膠原（SSC）和牛皮膠原（BHC）溶液（5 mg/mL）在不同升溫速率下的DSC曲線Fig.3 DSC curves of the snakehead skin collagen(SSC)and bovine hide collagen(BHC)solutions(5 mg/mL)at different heating rates

圖4 黑魚膠原（SSC）和牛皮膠原（BHC）溶液（5 mg/mL）熱變性的等轉(zhuǎn)化率法動(dòng)力學(xué)分析Fig.4 Isoconversional kinetic analyses of the thermal denaturation of the snakehead skin collagen(SSC)and bovine hide collagen(BHC)solutions(5 mg/mL)

膠原在模擬生理?xiàng)l件下的自組裝成纖維性質(zhì)對(duì)于其高值應(yīng)用十分重要[1]。由圖5可知，隨著溫度的升高，黑魚膠原成纖維的速度加快（t1/2逐漸下降），同時(shí)成纖維濁度的最大值呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)（△h在30℃時(shí)達(dá)到峰值），這是由于膠原成纖維的主要驅(qū)動(dòng)力是疏水作用，而升溫有利于增強(qiáng)疏水作用[24]，從而促使膠原成纖維進(jìn)行，但當(dāng)溫度臨近膠原的熱變性溫度時(shí)，膠原分子結(jié)構(gòu)遭受破壞，進(jìn)而阻礙了自組裝膠原纖維的形成。可見(jiàn)，30℃是適于黑魚膠原成纖維的較優(yōu)溫度條件，但該溫度明顯低于人體的正常生理溫度。若想將黑魚膠原在人體內(nèi)進(jìn)行原位自組裝成纖維的應(yīng)用，有必要通過(guò)改性手段提高其在生理環(huán)境下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖5 溫度對(duì)黑魚膠原成纖維的影響（a）膠原成纖維濁度變化曲線；（b）達(dá)到最大吸光度值一半所需時(shí)間（t1/2）以及達(dá)到平衡時(shí)吸光度的變化值(h)對(duì)溫度的依賴關(guān)系Fig.5 Effect of temperature on the fibril formation of the snakehead skin collagen(SSC)(a)The turbidity curves for collagen fibril formation;(b)Temperature dependences of the rate of collagen fibril formation(t1/2)and total increase of absorbance(h)when equilibrium reached

2.3 黑魚膠原溶液的化學(xué)交聯(lián)改性

綜合2.1和2.2所述可知，黑魚膠原的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性比牛皮膠原差，在一定程度上限制了黑魚膠原的應(yīng)用，因而有必要通過(guò)化學(xué)交聯(lián)等手段改性提升膠原材料的穩(wěn)定性[10，11]。據(jù)報(bào)道，交聯(lián)劑的分子長(zhǎng)度對(duì)于有效穩(wěn)固膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)非常關(guān)鍵[25]，因而本文對(duì)比考察了兩種分子碳鏈長(zhǎng)度相當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑對(duì)黑魚膠原的改性效果：1）戊二醛，傳統(tǒng)的膠原交聯(lián)劑，反應(yīng)活性高，但生物相容性較差[1,26]；2）己二酸NHS酯，近年來(lái)新興的蛋白偶聯(lián)劑，反應(yīng)活性和生物相容性都較好[1,14]。

圖6為合成的己二酸NHS酯的1H NMR和FTIR圖譜。由圖6（a）可知，化學(xué)位移為2.775、2.707和1.675的氫個(gè)數(shù)分別對(duì)應(yīng)為8、4和4，故總氫個(gè)數(shù)為16，證明己二酸與NHS成功反應(yīng)生成了己二酸NHS酯?；瘜W(xué)位移為2.467和3.360分別對(duì)應(yīng)DMSO溶劑峰和水峰。此外，圖6（b）在1739 cm-1、1210 cm-1和1065 cm-1等處顯示了酯基的特征吸收峰，進(jìn)一步驗(yàn)證了合成產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。

圖6 己二酸NHS酯的核磁共振氫譜（a）和紅外光譜（b）Fig.6 The 1H NMR(a)and FTIR(b)spectra of the adipic acid N-hydroxysuccinimide(NHS)ester

圖7是在不同反應(yīng)條件下己二酸NHS酯與戊二醛交聯(lián)改性黑魚膠原的電泳圖譜。由圖7（a）可知，在酸性條件下改性膠原的電泳條帶跟未改性膠原相比幾乎沒(méi)有差別，而且延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)電泳圖譜沒(méi)有影響；在堿性條件下改性膠原的電泳條帶明顯不同于未改性膠原，當(dāng)NHS酯活性基團(tuán)與膠原氨基的摩爾比分別為1/6和1/2時(shí)，兩條膠原α鏈的顏色都變淺，而且SSC(b-N1/2)比SSC(b-N1/6)的α鏈顏色更淺，同時(shí)均可見(jiàn)γ鏈以上組分出現(xiàn)，證明發(fā)生了分子間交聯(lián)。可見(jiàn)，交聯(lián)反應(yīng)在堿性條件下更容易進(jìn)行，而且膠原α鏈之間的締合隨交聯(lián)劑用量的增加而更加明顯。當(dāng)NHS酯活性基團(tuán)與膠原氨基的摩爾比為1時(shí)，樣品的兩條α鏈都消失，而只能看到少量γ鏈以上的條帶，且延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)改性膠原的電泳圖譜也沒(méi)有影響，表明此時(shí)的交聯(lián)劑用量可以獲得足夠高的交聯(lián)強(qiáng)度，并且膠原分子間的交聯(lián)占主導(dǎo)地位。

圖7 （a）己二酸NHS酯交聯(lián)改性黑魚膠原的電泳圖譜：條帶1，未改性膠原；2，SSC(b-N1×3)；3，SSC(a-N1×3)；4，SSC(b-N1)；5，SSC(a-N1)；6，SSC(b-N1/2)；7，SSC(b-N1/6)；8，標(biāo)準(zhǔn)蛋白（b）戊二醛交聯(lián)改性黑魚膠原的電泳圖譜：條帶1，標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2，SSC(b-G1/6)；3，SSC(b-G1/2)；4，SSC(b-G1)；5，SSC(a-G1)；6，SSC(b-G1×3)；7，SSC(a-G1×3)；8，未改性膠原Fig.7(a)SDS-PAGE patterns of the snakehead skin collagen(SSC)crosslinked by the adipic acid N-hydroxysuccinimide(NHS)ester.Lane 1,unmodified SSC;2,SSC(b-N1×3);3,SSC(a-N1×3);4,SSC(b-N1);5,SSC(a-N1);6,SSC(b-N1/2);7,SSC(b-N1/6);8,standard protein marker(b)SDS-PAGE patterns of the snakehead skin collagen(SSC)crosslinked by glutaraldehyde.Lane 1,standard protein marker;2,SSC(b-G1/6);3,SSC(b-G1/2);4,SSC(b-G1);5,SSC(a-G1);6,SSC(b-G1×3);7,SSC(a-G1×3);8,unmodified SSC

從圖7（b）中可以看出，在酸性條件下以及在堿性條件下當(dāng)醛基與膠原氨基的摩爾比分別為1/6和1/2時(shí)，戊二醛改性膠原的電泳圖譜跟上述NHS酯改性樣品的規(guī)律基本一致，唯一不同的是，SSC(b-G1/2)與SSC(b-G1/6)的電泳圖譜差別比SSC(b-N1/2)與SSC(b-N1/6)的電泳圖譜差別更為明顯。此外，當(dāng)醛基與膠原氨基的摩爾比為1時(shí)，反應(yīng)24 h就看不到任何電泳條帶，這說(shuō)明戊二醛比NHS酯具有更強(qiáng)的交聯(lián)反應(yīng)能力。

圖8為己二酸NHS酯與戊二醛交聯(lián)改性黑魚膠原溶液的DSC曲線。由圖8可知，酸性條件改性膠原SSC(a-N1)、SSC(a-G1)與未改性膠原樣品的熱變性峰略有差別，但峰值溫度都在32℃左右，而且改性后膠原的DSC曲線變得不規(guī)則，這可能是由于交聯(lián)作用誘導(dǎo)溶液體系內(nèi)部生成了少量膠原聚集體。相對(duì)而言，SSC(b-N1/2)與SSC(b-N1/6)的熱變性峰可以分為兩個(gè)區(qū)域：其一的峰值溫度在32℃附近，與未改性膠原的熱變性峰十分相似；其二的峰值溫度在50℃左右，且形狀不規(guī)則。SSC(b-N1)和SSC(b-G1)的熱變性峰在整體上呈現(xiàn)為跨度很大的多重吸熱峰，但在32℃附近沒(méi)有單獨(dú)的吸熱峰。

圖8 不同交聯(lián)改性條件處理黑魚膠原溶液（5 mg/mL）的DSC曲線Fig.8 DSC curves of the snakehead skin collagen(SSC)solutions crosslinked by different conditions

綜合上述電泳和DSC分析結(jié)果可知，交聯(lián)改性魚膠原的電泳圖譜與其DSC吸熱峰有所關(guān)聯(lián)，即隨著交聯(lián)程度不斷增加，改性膠原樣品的熱效應(yīng)從以單一吸熱峰為特征的膠原分子熱變性，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐远嘀匚鼰岱鍨樘攸c(diǎn)的交聯(lián)膠原聚集體熱變性，這與文獻(xiàn)報(bào)道[25]牛皮膠原的交聯(lián)改性結(jié)果一致。

3 結(jié)論

相同濃度的黑魚膠原與牛皮膠原溶液的流變行為和熱穩(wěn)定性存在較大差別，黑魚膠原的分子纏結(jié)程度更低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更差。在確保膠原不變性的前提下，通過(guò)改變溫度能夠有效調(diào)節(jié)黑魚膠原的動(dòng)態(tài)粘彈性與成纖維性能。盡管己二酸NHS酯的反應(yīng)活性比戊二醛弱，但其更好的生物相容性以及足夠高的交聯(lián)改性程度，使其有望用于提升膠原材料的綜合性能，以此推動(dòng)魚膠原基生物材料的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。