核桃細菌性黑斑病菌中脂蛋白預測及其特性研究

覃 悅，韓長志

（1.西南林業(yè)大學 生物多樣性保護學院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學 研究生院，云南 昆明 650224；3.云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224）

【研究意義】近年來，核桃產(chǎn)業(yè)已成為云南破解貧困問題的重要高原特色產(chǎn)業(yè)之一，全省90%以上地區(qū)均有核桃種植，2017年云南核桃的種植面積（4 300萬畝）、產(chǎn)量（115萬噸）、產(chǎn)值（315億元）均居全國之首[1-2]。然而，核桃炭疽病、細菌性黑斑病等病害嚴重影響著該省核桃產(chǎn)業(yè)的健康、有序和快速發(fā)展[3]。由黃單胞菌屬細菌Xanthomonas arboricolapv.juglandis引起的核桃細菌性黑斑病是世界性的核桃病害，植株受害率高達90%以上[4-5]，果實容易腐爛、早落，出仁率和含油率均降低，嚴重時落果率高達60%～80%?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內(nèi)外學者關于該病的研究，主要集中在病害癥狀、病原、侵染循環(huán)、檢測技術、預測預報技術[6]、發(fā)病規(guī)律及防治[7-9]等方面。植物病原物中的分泌蛋白在實現(xiàn)侵染、定殖寄主植物過程中發(fā)揮著重要作用[10]，學術界對植物病原真菌、卵菌等真核生物分泌蛋白的預測較多，而對植物病原細菌特別經(jīng)濟林木上的病原細菌研究較少[11]?！颈狙芯壳腥朦c】原核生物脂蛋白最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)[12]，之后諸多學者研究發(fā)現(xiàn)脂蛋白前體在胞質(zhì)中合成，可以通過Sec 分泌途徑以未折疊形式穿過胞質(zhì)膜，也可通過雙精氨酸轉(zhuǎn)位TAT 途徑或SecA 突變體以折疊形式穿過胞質(zhì)膜。同時，脂蛋白信號肽對于錨定蛋白的正確定位、修飾和轉(zhuǎn)運對細菌維持膜的穩(wěn)定性、細胞分裂、營養(yǎng)獲取等生理功能的發(fā)揮具有重要作用[13]。在核桃細菌性黑斑病菌分泌系統(tǒng)中SPaseI和SPaseII等不同信號肽類型的外泌蛋白還未被界定，前人對黃單胞菌中脂蛋白的研究主要集中在相關蛋白的表達、純化以及結(jié)晶等[14]。前期項目組已經(jīng)明確了CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj417 等7 個核桃細菌性黑斑病菌菌株中分泌蛋白數(shù)量及其所具有的特征[15-16]?！緮M解決的關鍵問題】為了更好地解析該病菌的致病機理以及找尋防治該病害的作用靶標藥劑，本研究通過LipoP v1.0[17]在線分析軟件，選擇11 個已經(jīng)報道全基因組序列的核桃細菌性黑斑病菌菌株開展SPaseII 脂蛋白預測。同時，對以上蛋白所具有的跨膜區(qū)結(jié)構域、亞細胞定位和理化性質(zhì)等特征進行明確，并通過遺傳關系分析進一步明確該菌中脂蛋白之間的親緣關系，為深入探索脂蛋白在其致病過程中的作用提供重要的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 核桃細菌性黑斑病菌序列來源

核桃細菌性黑斑病菌11 個菌株中的全蛋白組序列來源NCBI 數(shù)據(jù)庫，其菌株編號分別為Xaj 417、CFBP 2528、DW3F3、CPBF 426、CPBF 367、CFBP 7179、CPBF 427、CPBF 1521、CFBP 8253、J303、NCPPB 1447。

1.2 方法

1.2.1 脂蛋白序列獲取 利用LipoP v1.0[17]在線程序預測具有脂蛋白信號肽的蛋白質(zhì)序列。信號肽則用SignalP 5.0 Server[18]進行預測。

1.2.2 跨膜區(qū)結(jié)構預測 利用2 種不同跨膜區(qū)結(jié)構預測網(wǎng)站HMMTOP version 2.0[19]等對脂蛋白進行預測。

1.2.3 亞細胞定位分析 利用亞細胞定位分析軟件ProtComp v9.0[20]對脂蛋白進行預測。

1.2.4 理化性質(zhì)分析 利用理化性質(zhì)測定程序?qū)χ鞍仔盘栯牡鞍走M行測定[21]。

1.2.5 轉(zhuǎn)運肽預測 利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運肽線在分析軟件TargetP 1.1 Server[22]對脂蛋白進行分析。

1.2.6 基本特征分析 利用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計和分析具有脂蛋白中氨基酸殘基和信號肽特征，并采用Origin 2019作圖軟件做圖。

1.2.7 遺傳關系分析 利用ClustalX[23]和MEGA X 軟件[24]分別對細菌性黑斑病菌中脂蛋白序列開展多重序列比對分析和構建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂蛋白基本信息

對11 個核桃細菌性黑斑病菌株進行脂蛋白找尋，總共獲得1 718 個脂蛋白，每個菌株中平均含有156 個蛋白，所占比例為3.77%（表1）。進一步分析脂蛋白在全部蛋白中所占比例情況，發(fā)現(xiàn)菌株CPBF 367 中脂蛋白所占比例最高，為4.02%，而菌株CPBF 1521 中脂蛋白的比例最低，為3.62%（表1），其他菌株中脂蛋白比例則介于上述兩者之間。

表1 核桃細菌性黑斑病菌脂蛋白的基本信息Tab.1 Basic information of lipoprotein in X. arboricola pv. juglandis

同時，分別對每個菌株中所含有的脂蛋白氨基酸長度以及其組成進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，脂蛋白氨基酸長度集中于150～450 aa，其中長度在100～200 aa 的脂蛋白數(shù)量最多，平均為43 個，所占比例為27.56%（圖1A）。在上述核桃細菌性黑斑病菌中，脂蛋白氨基酸組成以A（丙氨酸）所占比例最高，其范圍為14.4～14.8%，其次為L（亮氨酸）和G（甘氨酸）氨基酸殘基，含量范圍為8.1～9.1%；而C（天冬氨酸）、H（組氨酸）、M（甲硫氨酸）、W（色氨酸）氨基酸殘基含量最低，平均含量僅為1%～2%（圖1B）。上述分析結(jié)果說明，脂蛋白作為重要的蛋白類別，其氨基酸長度較小。

圖1 核桃細菌性黑斑病菌脂蛋白的氨基酸長度及其組成情況分析Fig.1 Amino acid length and composition analysis of lipoprotein in X.arboricola pv.juglandis

2.2 脂蛋白跨膜結(jié)構域分析

基于HMMTOP version 2.0 跨膜結(jié)構域分析，1 718 個蛋白中具有1 次以上無跨膜結(jié)構域的蛋白數(shù)量僅有28 個，具體而言，在Xaj 417、CFBP 2528、DW3F3、CPBF 426、CPBF 367、CFBP 7179、CPBF 427、CPBF 1521、CFBP 8253、J303、NCPPB 1447中具有1次以上無跨膜結(jié)構域的蛋白序列分別有2、2、2、3、3、3、3、3、2、3和2條（表2），而其他蛋白則均不含有跨膜結(jié)構域。

表2 核桃細菌性黑斑病菌中具有多個跨膜結(jié)構域的脂蛋白情況Tab.2 Prediction of transmembrane of lipoprotein in X. arboricola pv. juglandis

2.3 脂蛋白亞細胞定位分析

對11個核桃細菌性黑斑病菌中脂蛋白序列開展亞細胞定位情況預測。結(jié)果顯示，在所獲得的1 718個脂蛋白中，定位在線粒體的脂蛋白數(shù)量最多，為66～75個；其次為細胞外，為50～62個；其他蛋白則定位在細胞核、質(zhì)膜、細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體、溶酶體及高爾基體（圖2）。

圖2 核桃細菌性黑斑病菌中脂蛋白亞細胞定位情況分析Fig.2 Subcellular localization of lipoprotein in X.arboricola pv.juglandis

2.4 脂蛋白理化性質(zhì)分析

進一步對1 718 個脂蛋白理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示，尤以理論等電點位于5.51～6.00 的脂蛋白數(shù)量最多，平均數(shù)量為32 個，所占比例為20.4%，其次為9.01～9.50，平均數(shù)量為18 個，所占比例分別為11.54%（圖3A）；就蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性系數(shù)而言，每個菌株中平均有74個脂蛋白的不穩(wěn)定性小于40，所占比例為47.44%，其余蛋白不穩(wěn)定性系數(shù)大于40（圖3B）；就總平均親水性（GRAVY）而言，總平均親水性小于0的蛋白數(shù)量大于總平均親水性大于0的蛋白數(shù)量，平均為-0.181（圖3B），屬于親水性蛋白；就脂肪族氨基酸指數(shù)而言，共有139個脂蛋白氨基酸數(shù)量大于70 aa，所占比例為89.1%，其中在80～90 aa的脂蛋白數(shù)量最多，為60 個，所占比例為38.46%（圖3C）。通過上述分析，明確11 個核桃細菌性黑斑病菌中的脂蛋白在理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)以及總平均親水性等方面存在著一定的差異，但是總體而言供試菌株中的脂蛋白在理化性質(zhì)方面具有趨同的特性，該分析結(jié)果對于深入解析某一菌株中脂蛋白結(jié)構及功能從而研究其他菌種中脂蛋白特性提供了重要的理論支撐。

圖3 核桃細菌性黑斑病菌中脂蛋白基本理化性質(zhì)分析Fig.3 Theoretical isoelectric point analysis of lipoprotein in X.arboricola pv.juglandis

2.5 脂蛋白的信號肽及轉(zhuǎn)運肽特征

通過SingnalP 5.0 分析，在11 個核桃細菌性黑斑病菌中，分別僅有7、7、8、9、13、9、9、9、7、8、8 條蛋白不具有信號肽序列，不屬于典型分泌蛋白，而其他序列則具有信號肽序列。進一步對具有信號肽脂蛋白基本特征分析，結(jié)果表明，信號肽長度位于20～25 aa 的數(shù)量最多，平均為78 個，所占比例為50.24%，且25%～75%的脂蛋白信號肽預測可靠性位于25%～50%（圖4A）。對信號肽切割位點特征進行分析，在上述1 718個脂蛋白中，尤以A（丙氨酸）所占比例最高，為21.52%，F(xiàn)（苯丙氨酸）、I（異亮氨酸）、W（色氨酸）和Y（酪氨酸）的平均含量最低，僅為0.27%、0.34%、0.1%和0.44%（圖4B）。

此外，在信號肽切割位點-3、-2、-1、1、2 處，A（丙氨酸）、A（丙氨酸）、C（天冬氨酸）、A（丙氨酸）、P（脯氨酸）的含量最高，平均所占比例分別為38.08%、22.45%、28.19%、13.87%、20.15%（圖4C）。氨基酸的組成在-3 和-1 位上相對比較保守，屬于A-X-C 類型，在-3 位上，除A（丙氨酸）之外，C（天冬氨酸）、G（甘氨酸）、T（蘇氨酸）、V（纈氨酸）平均所占比例分別為26.06%、7.7%、10.55%、5.8%，其余氨基酸含量所占比例均小于1%；在-1 位除了C 外，氨基酸A（丙氨酸）、G（甘氨酸）、P（脯氨酸）、S（絲氨酸）、T（蘇氨酸）平均所占比例分別為28.04%、20.35%、1.36%、14.86%、5.37%，其余氨基酸含量所占比例均小于1%（圖4C）。

圖4 核桃細菌性黑斑病菌中脂蛋白的信號肽基本特征分析Fig.4 Theoretical isoelectric point analysis of lipoprotein in X.arboricola pv.juglandis

對上述1 718個脂蛋白開展轉(zhuǎn)運肽分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有轉(zhuǎn)運肽的脂蛋白數(shù)量較少，且預測可靠性不高。除DW3F3菌株外，其他10個菌株中的一個蛋白（其蛋白ID為WP_016904744.1）具有轉(zhuǎn)運肽，轉(zhuǎn)運肽定位點均位于26～27，定位點氨基酸殘基均為ARS-GH（表3）。該結(jié)果再次印證了之前對于核桃細菌性黑斑病菌中脂蛋白理化性質(zhì)的分析，即該病菌中脂蛋白具有較大的相似性。

表3 核桃細菌性黑斑病菌中脂蛋白的潛在轉(zhuǎn)運肽的可能性預測Tab.3 Possibility prediction of transit peptides of lipoprotein in X. arboricola pv. juglandis

2.6 脂蛋白的遺傳關系分析

細菌性黑斑病菌脂蛋白信號肽1 718 個蛋白序列，通過氨基酸比對，去除重復序列后獲得687 個蛋白序列，進一步利用ClustalX[23]和MEGA X 軟件[24]分別進行多重比對分析和構建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，細菌性黑斑病菌中的脂蛋白序列根據(jù)遺傳關系可明顯的分為6 個大類，表明該菌中大部分脂蛋白之間有較高的同源性以及較近親緣關系（圖5），其中Ⅱ類和Ⅳ類所含蛋白數(shù)量最多，分別有171 和124 個蛋白，Ⅲ類所含蛋白數(shù)量較少，有64 個蛋白。

圖5 細菌性黑斑病菌脂蛋白信號肽序列之間的遺傳關系Fig.5 The genetic relationship between the lipoprotein sequences in X.arboricola pv.juglandis

3 結(jié)論與討論

本研究通過LipoP 分析，首先明確了11 個核桃細菌性黑斑病菌菌株中的脂蛋白情況，總共獲得1 718 個脂蛋白，平均每個菌株含有156 個蛋白，所占比例為3.77%，氨基酸長度集中于150～450 aa；其次，通過在線分析軟件HMMTOP、SignalP 等，明確脂蛋白具有1 次以上跨膜結(jié)構域不多，多數(shù)脂蛋白定位在線粒體核胞外，并且在理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)以及總平均親水性等方面存在著一定的差異，但是總體而言上述菌株中的脂蛋白在理化性質(zhì)方面具有趨同的特性，且僅有少數(shù)蛋白不具有信號肽序列，不屬于典型分泌蛋白，而具有轉(zhuǎn)運肽的脂蛋白數(shù)量也相對較少，預測可靠性相對較低。同時，具有脂蛋白信號肽的蛋白序列是以信號肽切割位置為界，在-3、-2、-1、1位有4個保守的氨基酸殘基，一般為LA（G/A）C，信號肽長度一般為20 個氨基酸殘基[25]，然而，本研究中所獲得的諸多脂蛋白信號肽切割位點多為AACA，且在-3 和-1 位上相對比較保守，尚不清楚是何種原因造成該現(xiàn)象出現(xiàn)，有待于今后進一步解析。最后，通過遺傳關系分析發(fā)現(xiàn)細菌性黑斑病菌中脂蛋白序列之間在具有較高同源性以及較近親緣關系的同時，還可能面臨著諸多選擇壓力，推測可能在進化過程中為了應對不同的生存環(huán)境而產(chǎn)生了較大的分化。上述研究結(jié)果為深入研究細菌性黑斑病菌脂蛋白功能提供重要的理論借鑒作用。同時，核桃細菌性黑斑病菌分泌系統(tǒng)中SPaseI 和SPaseII 等不同信號肽類型的外泌蛋白在同源關系上、功能類別上是否保守，是否都具有上述研究結(jié)果的（種內(nèi)、種間的）獨特生物學功能還有待進一步深入研究。

一般而言，植物病原真菌在實現(xiàn)成功侵染植物過程中，經(jīng)歷了克服植物固有防御反應、基礎免疫反應以及系統(tǒng)免疫等一系列防衛(wèi)反應，從而實現(xiàn)對寄主植物的侵染、定殖以及系統(tǒng)操控等。脂蛋白幾乎存在于所有細菌中，其通過N 端脂質(zhì)結(jié)構錨定在膜中，并參與諸多重要的代謝過程，包括營養(yǎng)吸收、信號轉(zhuǎn)導、粘附、結(jié)合和孢子形成、參與抗生素抗性的生成、轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)的胞質(zhì)折疊[26]。作為外泌蛋白中的一類，具有脂蛋白信號肽的蛋白則對于錨定蛋白的正確定位、修飾和轉(zhuǎn)運，從而對細菌維持膜的穩(wěn)定性、細胞分裂、信號轉(zhuǎn)導、營養(yǎng)獲取等生理功能的正常發(fā)揮具有非常重要的作用，同時還在細菌生理、致病性和耐藥性等方面發(fā)揮著重要作用。由于脂蛋白是通過信號肽合成，并將其固定在細胞質(zhì)膜上，而脂蛋白結(jié)構域存在于細胞周質(zhì)或細胞外等特征，因此多將其作為靶標用作藥物開發(fā)[27]等。近年來，國內(nèi)外學者對植物病原真菌、卵菌及細菌等的分泌蛋白預測較多，包括本研究小組在內(nèi)的諸多國內(nèi)外學者對植物生物分泌蛋白進行了大量的生物信息分析，如對真菌[28]、卵菌[29]以及枯草芽孢桿菌、細菌性黑斑病菌[15]等植物病原物。前人對脂蛋白的研究主要集中在相關蛋白的表達、純化以及結(jié)晶等[14]。本研究通過對核桃細菌性黑斑病菌脂蛋白的預測及特征分析，發(fā)現(xiàn)菌株中的脂蛋白之間具有較大的相似性，然而，上述研究僅針對1種病原物的預測分析，尚缺乏對于多種植物病原物中脂蛋白預測及特征分析等工作。由于天然狀態(tài)下的生物多糖大分子的高聚合度和不可溶性，微生物的多糖降解酶需要分泌到胞外才能與底物接觸，實現(xiàn)多糖的降解。酶組分在胞質(zhì)中被合成前體到分泌到胞外或與細胞膜結(jié)合的過程中，脂蛋白在此過程中發(fā)揮了哪些作用？脂蛋白是否參與或影響胞吞作用？脂蛋白在細菌性黑斑病菌致病過程中占據(jù)怎樣的地位等等問題還有待進一步驗證。