基于羧基化碳納米管檢測磺酰胺的電化學(xué)傳感方法研究

曾一芳，邱道揚，陳麗麗，趙 利，文陽平，湯凱潔*

（1.江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 功能材料與農(nóng)業(yè)應(yīng)用化學(xué)研究所，江西 南昌 330045）

【研究意義】磺胺類（Sulfonamides，SAs）抗生素是一類廣譜抗菌藥物的總稱，在臨床上常被用于預(yù)防和治療革蘭氏陽性菌或陰性菌感染的疾病，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中預(yù)防和治療疾病[1]。對氨基苯磺酰胺（Sulfanilamide，SA），簡稱磺酰胺，是磺胺類藥物中結(jié)構(gòu)最簡單的一種，也是其他磺胺衍生物的母體結(jié)構(gòu)。有報道SAs 在食品中的殘留對消費者健康具有潛在的風(fēng)險，可能會引起過敏反應(yīng)、誘導(dǎo)人體產(chǎn)生耐藥性、損害泌尿系統(tǒng)、降低人體免疫力、嚴重的甚至?xí)种瓢准毎铣苫蛘T發(fā)癌癥風(fēng)險等[2]?！厩叭搜芯窟M展】有研究表明水中的磺胺類溶度在0.15～0.30 mg/dm3可以改變鯉魚血漿中蛋白質(zhì)圖譜[3]。隨著SAs 藥物在養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用，加之養(yǎng)殖戶法律意識淡薄以及趨利心理，常有不遵守休藥期或擅自加大用藥量行為的發(fā)生，導(dǎo)致SAs 藥物在食品中的殘留問題日趨嚴重。從福建養(yǎng)殖的草魚、羅非魚和鰻魚中36 種抗生素的殘留檢測結(jié)果分析，磺胺嘧啶含量高達161.2 μg/kg[4]，超過國家安全限量標準（100 μg/kg）。埃及的K?rkan 等[5]報道了13 個蜂蜜樣品中有4 個樣品為陽性。越南的Yen等[6]報道了40 個蝦樣品中有22.5%檢出抗生素殘留，包括SAs 的殘留。加拿大的Dinh 等[7]報道了56 個海產(chǎn)品中SAs 的檢出率為11%，可見SAs 在食品中的殘留是全球性的問題，應(yīng)該引起各國監(jiān)管部門高度重視。目前檢測磺胺類藥物的常見方法有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography mass spectrometer，LC-MS）法[9]、免疫分析法[10]、毛細管電泳法[11]等。HPLC 和LC-MS 法檢測SAs 不僅定性定量準確，而且可以實現(xiàn)多殘留同時檢測，是目前實驗室最常用的一種方法。

【本研究切入點】但是采用HPLC，LC-MS方法，樣品一般都需要經(jīng)過多步液液萃取、凈化柱凈化和富集等操作。這些預(yù)處理不僅步驟繁瑣、耗時，而且消耗多種有機試劑，污染環(huán)境和對操作人員的健康造成潛在危害；另外這些大型儀器比較昂貴，且需要熟練的專業(yè)技術(shù)人員操作，因此難于滿足現(xiàn)場快速檢測要求。免疫分析方法需要免疫動物制備抗體，成本較高，而且生物抗體脆弱，容易受環(huán)境條件影響；毛細管電泳法進樣量少，電滲會因樣品組成而變化，進而影響分離和重現(xiàn)性。隨著食品工業(yè)快速的發(fā)展及市場需求水平的提高，操作簡便快速、靈敏度高、成本低的電化學(xué)傳感檢測方法已成為研究的熱點[12-13]。【擬解決的關(guān)鍵問題】理想的修飾材料能提高工作裸電極（玻碳電極）對磺酰胺的響應(yīng)靈敏度，對建立簡便快速、穩(wěn)定性好和靈敏度高的電化學(xué)傳感方法至關(guān)重要。羧基化碳納米管（COOH-CNTs）以其獨特的一維圓管結(jié)構(gòu)、優(yōu)良的電子傳遞特性和化學(xué)穩(wěn)定性等成為電極修飾材料研究的熱點之一，表面大量羧基化的化學(xué)活性位點對電極進行修飾可以提高檢測方法的靈敏度[14-15]。本文制備了羧基化碳納米管修飾的玻碳電極，并通過DPV 研究磺酰胺在該修飾電極上的電化學(xué)行為及優(yōu)化了電化學(xué)檢測條件。以草魚和牛奶為加標樣品，建立的檢測方法回收率高和穩(wěn)定性好，取得了滿意的結(jié)果，適用于草魚和牛奶中磺酰胺殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

磺酰胺（中國食品藥品檢定研究院）；羧基化碳納米管（COOH-CNTs，98%，中國科學(xué)院成都有機化學(xué)有限公司）；氯化鉀、羧甲基纖維素鈉、氫氧化鈉、磷酸、醋酸、硼酸、乙腈等其他試劑均為分析純；鐵氰化鉀混合液由5 mmol/L[Fe（CN）6]3-、5 mmol/L[Fe（CN）6]4-和0.1 mmol/L KCl 配制；0.04 mol/L Britton Robison（BR）緩沖溶液由0.04 mol/L 磷酸溶液、醋酸溶液以及硼酸配制，并用0.04 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值得到所需緩沖液；實驗室用水為超純水。

草魚：購于南昌市不同養(yǎng)殖場；牛奶為市售蒙牛純牛奶、伊利純牛奶、陽光鮮牛奶。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI620E 電化學(xué)工作站（上海辰華）；SB-5200D 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；CT-6023便攜式pH 計（成都恒通興業(yè)科技有限責(zé)任公司）；WS70-1紅外快速干燥箱（鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司）；玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE，Φ=3 mm）、飽和甘汞電極（SCE）、鉑電極（武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司）；TG16G離心機（常州市金壇勒普儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 玻碳電極的預(yù)處理 首先在干凈的麂皮上撒少許0.05 μm 粒度的Al2O3拋光粉，加適量超純水混勻至形成白色漿狀物，垂直均勻畫“8”字打磨電極至光亮鏡面，再依次用超純水、無水乙醇、超純水于超聲清洗機中超聲清洗5 min。電極取出后用超純水沖洗，氮氣吹干電極上的水膜后采用循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）在濃度為5 mmol/L 的鐵氰化鉀溶液中進行掃描（掃描速率50 mV/s，掃描電壓范圍為-0.2～0.6 V），得到對稱、可逆的氧化還原峰，當(dāng)峰電位差（ΔEp）小于100 mV即為合格，可以保證每次實驗電極的表面狀態(tài)和性能基本一致。

1.3.2 不同材料修飾電極的制備 分別精確稱取1.00 mg 羧基化碳納米管（carboxylic carbon nanotubes，COOH-CNTs）、氨基化碳納米管（aminated carbon nanotubes，NH2-CNTs）、摻鉑石墨烯（platinum-doped graphene，Pt-Gr）、多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）、摻氮石墨烯（nitrogen-doped graphene，N-Gr）、二硫化鎢（tungsten disulfide，WS2）、羧基化石墨烯（carboxyl graphene，COOH-Gr，分別分散到1 mL 0.3 mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中，超聲30 min，制成7種濃度為1 mg/mL的分散液。在玻碳電極表面滴涂一定量修飾材料的分散液，用DPV法檢測磺酰胺。

1.3.3 DPV 法測定磺酰胺 將電極放入5.0 mL pH=7.0的BR 緩沖溶液中掃描多次至溶液穩(wěn)定，取20 μL 1 mg/mL 的磺酰胺標準液于緩沖溶液中，攪拌溶液1 min 并靜置1 min 后在電位范圍為0.3～1.3 V 用DPV進行檢測。所有實驗均在室溫，所有峰值電流的分析數(shù)據(jù)都是通過切線法扣除背景電流得到的DPV峰高。

1.3.4 樣品的制備 草魚樣品：取2 g剪小并搗碎的草魚樣品于離心管中，加5 mL乙腈提取液，渦旋震蕩2 min，超聲處理10 min，4 000 r/min 條件下離心10 min 后取上清液，剩余殘渣加5 mL 乙腈提取液重復(fù)提取1次，合并2次上清液，用乙腈定容至5 mL待用；牛奶樣品：取50 μL牛奶樣品置于離心管中，加入乙腈溶液，混勻后渦旋振蕩2 min，超聲處理10 min，然后在12 000 r/min 條件下離心30 min，取上清液乙腈定容至5 mL待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 修飾電極材料的篩選

玻碳裸電極電催化性能比較弱，為了提高電極對目標檢測物的靈敏度，比較了7 種不同修飾材料對磺酰胺的電化學(xué)響應(yīng)，以制備的修飾電極作為工作電極，鉑絲電極作為對電極，甘汞電極作為參比電極構(gòu)成三電極體系。DPV實驗結(jié)果見圖1，磺酰胺在氨基化碳納米管（NH2-CNTs）、多壁碳納米管（MWCNTs）、二硫化鎢（WS2）3 種修飾材料的峰電流比較弱，所以這3 種DPV 圖沒有放在圖1。圖1 只選擇了COOH-CNTs、摻鉑石墨烯（Pt-Gr）、摻氮石墨烯（N-Gr）、羧基化石墨烯（COOH-Gr）4 種修飾電極和裸玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）在含2.3×10-5mol/L 磺酰胺的BR 緩沖液（pH=8.5）的DPV 掃描圖。如圖1所示，磺酰胺在COOH-CNTs 修飾的電極峰電流響應(yīng)最大（11.89 μA），且催化電位相對于其他的材料也略低（0.76 V），說明COOH-CNTs對磺酰胺的氧化具有最好的電催化作用。其次是N-Gr，最差的是COOH-Gr。因此，后面的實驗都采用COOH-CNTs 修飾GCE制備工作電極（COOH-CNTs/GCE）。

圖1 4種不同修飾材料制備工作電極的DPV掃描圖Fig.1 The comparison of DPV between bare electrode and four modified electrodes

2.2 檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 電極修飾材料用量的確定 采用滴涂和紅外干燥法修飾電極時，如果修飾材料用量過少，則無法將裸玻碳電極表面覆蓋完全，不能完全發(fā)揮出修飾材料的優(yōu)勢；當(dāng)修飾材料用量過多時，修飾材料在電極表面形成的薄膜厚度過大，導(dǎo)致電子移動距離增大，不僅不能提升電極的靈敏度，甚至可能會削弱電極對目標物質(zhì)的響應(yīng)，從而直接影響實驗結(jié)果。所以需要對電極修飾材料用量進行優(yōu)化，選擇合適的滴涂量以提高電極的氧化響應(yīng)靈敏度。

滴涂不同體積的COOH-CNTs后在相同濃度的磺酰胺溶液中用DPV法進行掃描。如圖2所示，當(dāng)修飾用量在4～5 μL 的范圍內(nèi)峰值電流呈急劇上升趨勢，5 μL 達到最大值，當(dāng)用量在5～9 μL 時隨著滴涂用量的增加，磺胺的峰值電流反而直線下降，且9 μL峰電流值最小。這是由于COOH-CNTs 在電極表面分布達到飽和，再增加滴涂量也不會再增加電極的比表面積和催化性能，故電極修飾用量選取5 μL作為后面實驗的最適修飾用量。

圖2 修飾材料用量與峰值電流關(guān)系的對比Fig.2 The comparison of the relation between the amount of modification material and the peak current

2.2.2 緩沖液pH 值的選擇 電化學(xué)傳感方法檢測待測物的原理是被分析物在工作電極上的電化學(xué)行為與濃度變化關(guān)系，如電流響應(yīng)大小隨物質(zhì)濃度變化的關(guān)系。而電解質(zhì)溶液的pH值會影響工作電極環(huán)境中電子和質(zhì)子的含量，從而直接影響電極氧化響應(yīng)的靈敏度。COOH-CNTs 修飾電極在不同pH 值（pH=6.0、pH=6.5、pH=7.0、pH=7.5、pH=8.0、pH=8.5、pH=9.0）的BR 緩沖溶液中對相同濃度的磺酰胺溶液的氧化響應(yīng)電化學(xué)表征。

如圖3 所示，緩沖液pH 值在6.0～8.5，磺酰胺的氧化響應(yīng)峰的峰值電流在逐漸增大。當(dāng)緩沖液的pH值達到8.5 時，氧化響應(yīng)峰值電流達到最大值。之后隨著pH 值的增大，峰值電流又開始逐漸減小，這表示緩沖液在pH 為8.5 時，修飾電極對磺酰胺的氧化還原響應(yīng)最強，故選取pH=8.5 的BR 緩沖液作為實驗的最佳電解質(zhì)溶液。

圖3 不同pH的緩沖液對磺酰胺電化學(xué)響應(yīng)的影響Fig.3 The effect of buffers with different pH values on the electrochemical response of sulfanilamide

2.3 COOH-CNT/GCE的電化學(xué)表征

2.3.1 COOH-CNT/GCE 的電化學(xué)阻抗性能 交流阻抗性能可以反應(yīng)電極導(dǎo)電性的強弱，為了研究修飾電極COOH-CNT/GCE 的導(dǎo)電性，進行了交流阻抗實驗，在5 mmol/L 的鐵氰化鉀混合液中研究了電極的界面性質(zhì)，通過奈奎斯特圖中半圓的直徑來評價不同改性的電極的轉(zhuǎn)移電阻（Rct）。從圖4 可以看出，COOH-CNT/GCE 的電極明顯比未修飾電極的Rct小，反映了采用COOH-CNT 材料修飾玻碳電極后大大提高了工作電極的導(dǎo)電能力。

圖4 在5 mmol/L鐵氰化鉀混合液中GCE和COOH-CNT/GCE 的奈奎斯特圖Fig.4 The nyquist plots of GCE and COOH-CNT/GCE in 5 mmol/L potassium ferricyanide mixture

2.3.2 COOH-CNT/GCE 電極催化有效面積 電極催化有效表面積的大小決定了電化學(xué)傳感器的響應(yīng)位點數(shù)量，通常有效面積越大，電極電催化性能越好，響應(yīng)靈敏度越高。在含0.1 mol/L KCl 的1 mmol/L K3[Fe（CN）6]為支撐電解質(zhì)溶液中，對所制備的電化學(xué)傳感器進行了電化學(xué)有效表面積的研究。圖5顯示COOH-CNT/GCE大大提高了未修飾電極的電化學(xué)有效面積，增強了對磺酰胺的識別與響應(yīng)。

圖5 在含0.1 mmol/L的1 mmol/L的鐵氰化鉀溶液中對GCE和COOH-CNT/GCE 的電化學(xué)有效表面積測試Fig.5 The electrochemically available surface area measurements of GCE and COOH-CNT/GCE in 1 mmol/L potassium ferricycyanide solution containing 0.1 mmol/L

2.3.3 繪制標準曲線及檢測限的計算 在最優(yōu)實驗條件下，用修飾電極在0.3～1.3 V 電位下采用DPV 法對含不同濃度磺酰胺（9.29×10-6，1.63×10-5，1.97×10-5，2.32×10-5，3.25×10-5，8.31×10-5，1.16×10-4，2.32×10-4，2.90×10-4mol/L）的緩沖液進行檢測分析，得到不同濃度下的氧化響應(yīng)峰值電流圖。根據(jù)濃度與氧化峰值電流的關(guān)系，以濃度為橫軸、峰值電流為縱軸繪制標準曲線，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，磺酰胺濃度在9.29×10-6～2.9×10-4mol/L的范圍內(nèi)，氧化響應(yīng)峰值電流與磺酰胺濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=0.008 7x+0.095 5，R2=0.991 6，檢測限為6.21×10-6mol/L。

圖6 磺酰胺濃度與峰電流響應(yīng)的線性關(guān)系Fig.6 Linear relationship between sulfonamide concentration and peak current

2.3.4 重復(fù)性和重現(xiàn)性 使用同一根COOH-CNTs 修飾電極在最優(yōu)實驗條件下對含2.3×10-5mol/L 磺酰胺濃度的緩沖溶液進行重復(fù)性實驗，采用DPV 法重復(fù)掃描12 次（如圖7A），測得12 次實驗結(jié)果的氧化峰值電流的相對標準偏差RSD=1.99%，表明該傳感器對磺酰胺檢測的重復(fù)性非常好。

使用6 根COOH-CNTs 修飾的不同電極，在最優(yōu)實驗條件下對含2.3×10-5mol/L 磺酰胺濃度的緩沖溶液進行重現(xiàn)性實驗，使用DPV 法重復(fù)掃描5 次得到平均峰電流值（如圖7B），測得平均氧化峰值電流值的相對標準偏差RSD=3.74%，表明該傳感器對磺酰胺檢測的重現(xiàn)性良好。

圖7 DPV法掃描同一根修飾電極峰值電流變化（A）；6根COOH-CNT/GCE 修飾電極的峰值電流變化（B）Fig.7 Peak current variation diagram of the same modified electrode by DPV method（A）；Peak current changes of six COOH-CNTs/GCE modified electrodes（B）.

2.3.5 加標實驗及實際樣品的測定 加標回收率的測定不僅可以評估基質(zhì)效應(yīng)對方法的影響，而且可以評估該方法的準確度[16-17]。采用江西最大的淡水魚品種草魚和蒙牛牛奶作為加標樣品進行方法驗證，選擇了4個不同的加標濃度，測定了加標回收率和RSD值，結(jié)果見表1。

由表1 可知，添加4 個不同濃度的草魚加標回收率在97.91%～105.32%，RSD 在0.81%～2.79%。牛奶樣品的加標回收率達到91.48%～101.75%，RSD 在0.63%～3.72%。可見本研究以草魚和鮮奶樣品為基質(zhì)建立的電化學(xué)傳感方法表現(xiàn)了非常好的回收率和精密度，表明該建立的方法可以適用于上述兩類樣品檢測，進一步采用該傳感方法檢測了10 種不同養(yǎng)殖地的草魚樣品和3 種品牌的牛奶樣品都未檢出磺酰胺殘留。

表1 草魚和牛奶樣品的加標回收率（n=5）Tab.1 The recovery rate of grass carp and milk sample with spiked standard（n=5）

3 結(jié)論與討論

本次研究成功開發(fā)了一種簡便、快速、靈敏度高和成本低的檢測磺酰胺的電化學(xué)傳感方法，當(dāng)采用COOH-CNTs 修飾的玻碳電極表現(xiàn)出優(yōu)良的電子催化性能、高比表面積，該電極對磺酰胺電化學(xué)響應(yīng)靈敏度高。制備的電極在重復(fù)使用12次穩(wěn)定性非常好，采用相同的滴涂條件制備了6根電極，重現(xiàn)性也非常滿意。建立的電化學(xué)傳感方法檢測磺酰胺，操作簡便快速、靈敏度高，采用該方法對草魚和牛奶樣品中磺酰胺的4個加標濃度樣品進行檢測，回收率為91.48%～105.32%，表明建立的方法可以適用于實際樣品檢測。從2020年磺胺類藥物殘留報道來看，水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品、鮮奶和蜂蜜產(chǎn)品，甚至飲用水等都有陽性樣品報道，因此磺胺類在食品中的殘留應(yīng)該引起監(jiān)管部門的重視。目前已開發(fā)的磺胺類藥物有30多種，食品中常見殘留的有10多種磺酰胺的衍生物，因此后期實驗研究能同時檢測多種磺胺的電化學(xué)傳感方法具有更重要的意義。