健之素對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、 銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌殺菌效果的研究

劉菁，丁淑琴，張瑋，張怡清，賀嘉夫茹孜

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004)

0 引言

近年來，高校實(shí)驗(yàn)室安全事故頻繁發(fā)生，不僅威脅師生的生命安全，也給社會(huì)帶來了一定的負(fù)面影響。實(shí)驗(yàn)室安全包括水、電、危險(xiǎn)化學(xué)品、消防、生物安全等方面，尤其是生物安全，一旦出現(xiàn)菌種泄露，帶來的危害將無法預(yù)估。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)教學(xué)菌種，如果選擇不合適的消毒劑，其消毒效果不能完全殺滅細(xì)菌，菌種會(huì)被學(xué)生帶出實(shí)驗(yàn)室，造成菌種泄露，危害師生生命安全。此外，消毒劑質(zhì)量的良莠不齊也將導(dǎo)致消毒效果不能達(dá)到如期效果。

健之素是中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)推薦使用的廣譜高效消毒劑[1]，其對(duì)不同的菌種消毒效果均不相同，而且其濃度隨著配置時(shí)間的延長逐漸降低。因此，研究了健之素對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌五種不同菌種的殺菌結(jié)果，觀察健之素的消毒效果，為防止菌種泄露，保障實(shí)驗(yàn)室的生物安全提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

健之素(北京長江脈醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號(hào)201022W，有效含量250±25mg/每片)；硫代硫酸鈉；pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)；有機(jī)干擾物為3%的牛血清白蛋白；營養(yǎng)肉湯；營養(yǎng)瓊脂；哥倫比亞血瓊脂；生理鹽水；胰蛋白胨。

1.2 菌種和菌懸液的制備

大腸埃希菌菌(44155)、銅綠假單胞菌(10102)、肺炎克雷伯桿菌(46117)、陰溝腸桿菌(ATCC700323)和鮑曼不動(dòng)桿菌(ATCC19606)由本實(shí)驗(yàn)室保存。常規(guī)復(fù)蘇細(xì)菌，并經(jīng)正常傳代2～3次后使用。將細(xì)菌接種至哥倫比亞血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，從瓊脂哥倫比亞血平板中挑選幾個(gè)菌落直接在無菌生理鹽水中制成菌懸液，校準(zhǔn)菌懸液濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?含1×108CFU/mL)。

1.3 中和劑鑒定試驗(yàn)

選擇大腸埃希菌做中和劑鑒定試驗(yàn)。將大腸埃希菌制成含有機(jī)干擾物質(zhì)的菌懸液(細(xì)菌濃度1×108CFU/mL)。試驗(yàn)分6組，按2002版《消毒學(xué)技術(shù)規(guī)范》中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)程序進(jìn)行。試驗(yàn)在常溫下，重復(fù)3次。

1.4 最低抑菌濃度(MIC)檢測(cè)

用微量肉湯稀釋法[2]檢測(cè)健之素的最小抑菌抑菌濃度。將健之素用營養(yǎng)肉湯做倍比系列稀釋后加入試驗(yàn)孔(100μL/孔) 后，每孔加入細(xì)菌懸液10μL(細(xì)菌終5*104CFU/mL)。將相同濃度細(xì)菌接種于肉湯(100μL/孔)的培養(yǎng)基中為陽性對(duì)照。只含有等體積培養(yǎng)基的試驗(yàn)孔為陰性對(duì)照。將已接種的微量稀釋盤置于(35+2)℃孵育箱孵育16-20h。為保持所有培養(yǎng)物的孵育溫度相同，重疊放置的微量稀釋盤不應(yīng)超過4個(gè)。為防止干燥，應(yīng)將稀釋盤用塑料袋密封。試驗(yàn)在常溫下，重復(fù)3次。

1.5 最低殺菌濃度(MBC)檢測(cè)

采用瓊脂平板法檢測(cè)最小殺菌濃度。最小抑菌濃度檢測(cè)完后，取肉眼清亮實(shí)驗(yàn)孔液體做平板劃線，每份樣液接種2個(gè)培養(yǎng)孔，結(jié)果取均值。置于(35±2)℃孵育箱孵育16-20h后計(jì)數(shù)各組平板上的菌落數(shù)。

1.6 懸液定量殺菌試驗(yàn)

將細(xì)菌懸液和3%BSA等比例混合，制備含有機(jī)干擾物質(zhì)的細(xì)菌懸液(細(xì)菌濃度為5×107/mL)，置20℃±1℃水浴中備用。實(shí)驗(yàn)在48孔微孔板中進(jìn)行。在已含有倍比稀釋健之素的微孔(400μL/孔)中，分別加入含有機(jī)干擾物質(zhì)的細(xì)菌懸液(100μL/孔)作用不同時(shí)間(5min、10min、15min、20min、25min、30min)。取出混合液(50μL/孔)加入到已含中和劑(450μL/孔)的試驗(yàn)孔中。作用10min后，每孔分別吸取100μL，接種培養(yǎng)平板每份樣液接種2個(gè)培養(yǎng)孔，結(jié)果取均值。同時(shí)，用無菌水代替消毒液作為陽性對(duì)照。用水代替碘伏和細(xì)菌的試驗(yàn)孔為空白對(duì)照。試驗(yàn)板置于(35+2)℃孵育箱孵育48h后觀察最終結(jié)果，計(jì)數(shù)各組菌落數(shù)(CFU/mL)。試驗(yàn)在常溫下，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果以第1組無試驗(yàn)菌生長，或僅有極少數(shù)試驗(yàn)菌菌落生長，第2組有較第1組為多，但較第3、4、5(組)為少的試驗(yàn)菌菌落生長，第3、4、5(組)有相似量試驗(yàn)菌生長，其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過15%，第6組無菌生長為合格。含3%硫代硫酸鈉的中和劑，可有效中和健之素消毒劑對(duì)大腸埃希菌的殘留作用且中和劑和中和產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌生長及培養(yǎng)基無影響，該中和劑對(duì)健之素2000mg/L合格(表1)。

表1 中和劑鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 最低抑菌濃度(MIC)

結(jié)果顯示，健之素對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和陰溝腸桿菌的MIC均為 250mg /L。健之素對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為125mg /L(圖1)。

圖1 健之素對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌最小抑菌濃度 (MIC)結(jié)果

2.3 最低殺菌濃度(MBC)

肉眼觀察瓊脂平板的結(jié)果，結(jié)果如表2所示。健之素對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和陰溝腸桿菌的MBC均為 250mg /L。健之素對(duì)銅綠假單胞菌的MBC為125mg /L。

表2 健之素對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌最小殺菌濃度 (MBC)

2.4 健之素對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌的殺滅作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：濃度250～2000mg/L的健之素對(duì)肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌分別作用5min～30min，菌落計(jì)數(shù)均為0 CFU/mL。濃度250～2000mg/L的健之素對(duì)大腸埃希菌作用5min～30min，500mg～2000mg/L的健之素可以完全殺滅大腸埃希菌，250mg健之素對(duì)大腸埃希菌的消毒效果隨著作用時(shí)間的延長殺滅率達(dá)到100%。結(jié)果如圖2所示。1000mg～2000mg/L的健之素可以完全殺滅陰溝腸桿菌和銅綠假單胞菌，250mg～500mg健之素對(duì)陰溝腸桿菌和銅綠假單胞菌的消毒效果隨著作用時(shí)間的延長殺滅率達(dá)到100%。結(jié)果如圖3和表3所示。

表3 不同濃度健之素對(duì)銅綠假單胞菌不同消毒作用時(shí)間后的細(xì)菌殺滅率(%)

圖2 不同濃度健之素對(duì)大腸埃希菌在不同的消毒作用時(shí)間后生長的菌落數(shù)(CFU/mL)

圖3 不同濃度健之素對(duì)陰溝腸桿菌不同消毒作用時(shí)間后生長的菌落數(shù)(CFU/mL)

3 討論

根據(jù)2018年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)統(tǒng)計(jì)，全國醫(yī)院革蘭陰性菌分離前五位的分別是：大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌。它們?cè)卺t(yī)院環(huán)境長期存活，并在醫(yī)院內(nèi)通過空氣、飛沫、醫(yī)護(hù)人員的手及各種醫(yī)療器械、輔助材料等傳播流行，甚至引起醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)流行[3]。在醫(yī)學(xué)院校，這五種細(xì)菌作為腸桿菌科和非發(fā)酵菌屬的代表菌種，在《臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)課程中用于學(xué)生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。在實(shí)驗(yàn)中，會(huì)出現(xiàn)學(xué)生將菌種遺漏在桌面、地面或者個(gè)人防護(hù)用品上，如果沒有選擇合適的消毒劑進(jìn)行消毒，菌種會(huì)被帶出實(shí)驗(yàn)室，造成菌種泄露，嚴(yán)重者會(huì)影響師生生命。

健之素作為醫(yī)院常用的醫(yī)用消毒劑，其殺菌效果較好。健之素對(duì)不同的菌種有不同的消毒時(shí)間，而且其濃度隨著配置時(shí)間的延長逐漸降低。因此本研究健之素對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌的殺菌效果，為實(shí)驗(yàn)室的生物安全提供科學(xué)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，健之素對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和陰溝腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為250mg/L。健之素對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為125mg/L。微孔板懸液定量殺滅實(shí)驗(yàn)顯示，1000～2000mg/L健之素的消毒作用時(shí)間5min～30min，可以完全殺滅大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌。250～500mg/L健之素隨著消毒作用時(shí)間的延長(延長到30min)，可以完全殺滅大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌。因此，各實(shí)驗(yàn)室可以使用濃度1000～2000mg/L健之素，消毒作用5min，對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌殺滅率達(dá)到100%，避免菌種泄露危害的發(fā)生，為實(shí)驗(yàn)室生物安全提供保障。