HPLC法測定舞陽貝母水溶性成份含量及指紋圖譜分析

李 珊，王曉燕，黃 霞，張紅偉*，劉 菊，趙一擎，茹慶國

(1 河南省食品藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點實驗室，鄭州 450018；2 鄭州市中醫(yī)院，鄭州 450007)

貝母為百合科貝母屬多種植物的干燥鱗莖，主要分布于浙江、四川、新疆、甘肅、湖北、安徽等省[1]。2020年版《中國藥典》一部藥材與飲片項下收載了6種不同來源的藥用貝母，分別為浙貝母(百合科植物浙貝母FritillariathunbergiiMiq.的干燥鱗莖)、土貝母[葫蘆科植物土貝母Bolbostemmapaniculatum(Maxim.)Franquet的干燥塊莖]、湖北貝母(百合科植物湖北貝母FritillariahupehensisHsiao et K.C.Hsia的干燥鱗莖)、川貝母[百合科植物川貝母FritillariacirrhosaD.Don、暗紫貝母FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母FritillariaprzezvalskiiMaxim.、梭砂貝母FritillariadelavayiFranch.、太白貝母FritillariataipaiensisP.Y.Li或瓦布貝母FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsiavar.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu, S.Wang et S.C.Chen的干燥鱗莖]、平貝母(百合科植物平貝母FritillariaussuriensisMaxim.的干燥鱗莖)、伊貝母(百合科植物新疆貝母FritillariawalujewiiRegel或伊犁貝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鱗莖)。貝母的植物來源種類繁多，遍布全國各地，但藥典中收載的川貝母野生資源逐漸枯竭，因此各地均有替代品[2]。

現(xiàn)代藥理研究表明，貝母具有抑菌[3-5]、鎮(zhèn)咳[6-7]、平喘[8-9]、抗腫瘤[10-12]等作用。核苷類屬于貝母中的水溶性成份，有研究表明，貝母的水溶性成份具有松弛平滑肌、抑制血小板聚集、降壓、抗炎等作用[13]，而貝母的抗炎作用能協(xié)同治療呼吸道感染，是貝母止咳化痰的藥理學基礎[14]。

舞陽貝母為百合科植物舞陽貝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鱗莖或鱗葉，于1983年在河南省野生經(jīng)濟植物資源考察中發(fā)現(xiàn)，以舞鋼市為中心，多分布在海拔230～700 m的疏林草地或山坡草叢，療效確切，是河南省特有的中藥材貝母資源[15]。舞陽貝母質(zhì)量標準于2019年通過專家評審，現(xiàn)收入《河南省中藥飲片炮制規(guī)范標準草案》，且已進入“河南省中藥飲片炮制規(guī)范研究”課題品種名單。但由于相關(guān)研究基礎薄弱，特別是對其化學成份的研究較少，現(xiàn)有質(zhì)量標準較為簡單，只有性狀、鑒別、檢查、浸出物項目，沒有含量測定項目，未制定質(zhì)量等級，也未與其他川貝母、浙貝母等藥材進行更加深入的質(zhì)量比較。因此，作為豫產(chǎn)特色中藥材，對舞陽貝母進行質(zhì)量評價研究，在提高藥材質(zhì)量控制水平、確保藥材質(zhì)量、保證臨床用藥的穩(wěn)定性和有效性方面具有重要意義。

舞陽貝母入藥多為水煎口服，已有多項研究針對貝母中核苷類成份的含量進行了測定[16-24]。核苷類物質(zhì)是生物機體細胞維持生命活動的基本組成元素，具有多種生物活性[25]，可作為舞陽貝母的質(zhì)量評價指標之一。本研究對舞陽貝母中的9種核苷類成份進行含量測定，并首次建立其水溶性成份HPLC指紋圖譜，以期為舞陽貝母的進一步開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity液相色譜系統(tǒng)、AgilentDEAA311731二極管陣列檢測器(美國安捷倫公司)；XPE205萬分之一電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司]；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；粉碎機(漯河金田試驗設備研究所)；SIGMA3-30KS高速臺式冷凍離心機(德國西格瑪公司)；Mili-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 試藥

尿嘧啶對照品(批號：100469-201302，含量以99.6%計算)、次黃嘌呤對照品(批號：140661-200402，含量以99.0%計算)、腺苷對照品(批號：110879-200202，含量以100.0%計算)、尿苷對照品(批號：887-200202，含量以100.0%計算)、腺嘌呤對照品(批號:110886-200001，含量以100.0%計算)、鳥苷對照品(批號：111977-201501，含量以93.6%計算)均購自中國食品藥品檢定研究院；胸苷對照品(批號:ML190825-06，含量以98.0%計算)、胞苷對照品(批號:TI180107-17，含量以98.0%計算)、2′-脫氧腺苷對照品(批號:AL181124-13，含量以98.0%計算)均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇(德國默克股份兩合公司，色譜純)；超純水為自制。

實驗用9批舞陽貝母樣品來自不同產(chǎn)地，采用3種不同加工方式加工而成，經(jīng)河南省食品藥品檢驗所鑒定為百合科植物舞陽貝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鱗莖或鱗葉。樣品信息見表1。

表1 9批舞陽貝母樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取舞陽貝母樣品適量，粉碎機粉碎，過3號篩。取約1.5 g，精密稱定，置50 ml具塞錐形瓶中，加純水10 ml，搖勻，稱定重量，室溫下超聲提取60 min(功率300 W，頻率50 kHz)，取出放冷至室溫，加純水補足減失的重量，搖勻，轉(zhuǎn)移至10 ml離心管，離心5 min(10 000 r/min)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

分別取尿嘧啶對照品、胞苷對照品、次黃嘌呤對照品、尿苷對照品、腺嘌呤對照品、鳥苷對照品、胸苷對照品、腺苷對照品、2′-脫氧腺苷對照品適量，精密稱定，加水制成質(zhì)量濃度分別為118.325、101.528、103.356、101.520、102.400、91.653、109.760、111.520、119.717 μg/ml的混合對照品儲備液，置4 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

2.3 色譜條件

采用YMC-Triart C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水為流動相進行梯度洗脫(見表2)；柱溫為30 ℃；流速為1.0 ml/min；檢測波長為260 nm；進樣量為10 μl。

表2 梯度洗脫程序

2.4 方法學考察

2.4.1系統(tǒng)適用性試驗

按照“2.3”項下色譜條件，取對照品溶液和供試品溶液分別進樣，色譜圖見圖1。

1：尿嘧啶；2：胞苷；3：次黃嘌呤；4：尿苷；5：腺嘌呤；6：鳥苷；7：胸苷；8：腺苷；9：2′-脫氧腺苷

各相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10 000，表明上述色譜條件可有效分離各目標成份，可用于舞陽貝母的含量測定研究。

2.4.2線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液0.1、1、2、4、8、10、20 ml，分別置于7個20 ml容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，制成系列濃度梯度的混合對照品溶液，精密吸取10 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線，由結(jié)果可知9種核苷類成份在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表3。

表3 9種核苷類成份的線性關(guān)系

2.4.3精密度試驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣6次。測得胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鳥苷、腺苷、2′-脫氧腺苷峰面積的RSD分別為1.05%、1.23%、0.85%、0.34%、0.67%、0.34%、0.29%、0.48%和0.98%，表明儀器精密度良好。

2.4.4重復性試驗

取S4號樣品粉末1.5 g，共6份，精密稱定，平行制備6份供試品溶液(按“2.1”項下方法)，測定9個核苷類成份含量(按“2.3”項下色譜條件)，結(jié)果胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鳥苷、腺苷、2′-脫氧腺苷RSD分別為1.86%、1.57%、2.11%、0.98%、1.84%、1.95%、1.49%、1.36%、1.77%，表明本方法重復性良好。

2.4.5穩(wěn)定性試驗

取S4號樣品制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、36 h進樣測定，測得胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鳥苷、腺苷、2′-脫氧腺苷峰面積的RSD分別為0.68%、0.91%、0.87%、0.77%、0.94%、0.75%、0.67%、0.96%、0.72%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6加樣回收率試驗

取已知含量的S4號樣品共6份，每份約0.75 g，精密稱定，分別精密加入尿嘧啶對照品溶液(49.10 μg/ml)、胞苷對照品溶液(10.82 μg/ml)、次黃嘌呤對照品溶液(9.18 μg/ml)、尿苷對照品溶液(541.82 μg/ml)、腺嘌呤對照品溶液(29.18 μg/ml)、鳥苷對照品溶液(420.36 μg/ml)、胸苷對照品溶液(200.12 μg/ml)、腺苷對照品溶液(301.17 μg/ml)、2′-脫氧腺苷對照品溶液(130.18 μg/ml)各1 ml，加水至10 ml，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”色譜條件下測定，并計算回收率及RSD，結(jié)果表明回收率良好，見表4。

表4 9種核苷類成份加樣回收率結(jié)果

2.4.7含量測定

取各批次舞陽貝母樣品適量，精密稱定，按“2.1”項下制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定。結(jié)果表明，不同批次舞陽貝母樣品中核苷類成份總量差異較大，且各成份含量也相差較大。

表5 9批舞陽貝母樣品的核苷類成份含量測定結(jié)果 n=3，μg/g

2.5 指紋圖譜的建立及相似度分析

將各批次舞陽貝母樣品色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(國家藥典委員會，2012版)”，建立9批河南不同產(chǎn)地舞陽貝母指紋圖譜的共有模式。以S1號樣品色譜圖為參照圖譜，設定匹配模板，進行譜峰多點校正，時間窗寬度為1.0 min，生成對照圖譜(見圖2)，共確定15個共有色譜峰。通過與對照品比對，指認了9個成份，即峰1為尿嘧啶、峰2為胞苷、峰4為次黃嘌呤、峰5為尿苷、峰8為腺嘌呤、峰9為鳥苷、峰11為胸苷、峰13為腺苷、峰14為2′-脫氧腺苷。對各批次舞陽貝母樣品指紋圖譜與對照圖譜進行相似度計算，S1～S9的相似度分別為0.910、0.891、0.843、0.822、0.906、0.889、0.906、0.857、0.865，范圍為0.822～0.910。相似度評價結(jié)果表明，河南產(chǎn)舞陽貝母指紋圖譜基本一致，見圖3。

1：尿嘧啶；2：胞苷；4：次黃嘌呤；5：尿苷；8：腺嘌呤；9：鳥苷；11：胸苷；13：腺苷；14：2′-脫氧腺苷

圖3 9批舞陽貝母樣品HPLC疊加圖譜(S1～S9)

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

在制備供試品溶液時考察了不同提取方法(超聲、回流)和不同溶劑(純水，10%、20%、30%、40%、50%甲醇溶液)，發(fā)現(xiàn)純水超聲提取效率最高，操作簡便，且提取過程中無需加熱、無化學反應發(fā)生，對測定組份的量沒有損失。進一步考察了溶劑用量(10、20、30 ml)及提取時間(30、60、90 min)，最終確定提取方法為10 ml純水超聲提取60 min。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水為流動相，在不同的梯度洗脫條件下進樣，采用5種不同色譜柱Waters-Symmetrm C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、JADE-PAKRS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agela-Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，同時比較了不同進樣量(5、10、15 μl)，不同流速(0.5、0.8、1.0 ml/min)、不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，根據(jù)色譜圖基線、出峰數(shù)目、理論塔板數(shù)及分離度確定了本實驗的色譜條件。

3.3 檢測波長的選擇

采用DAD檢測器，在200～400 nm波長范圍內(nèi)對對照品及樣品進行掃描，綜合考慮不同波長下色譜峰的數(shù)目、紫外吸收、分離度、峰面積大小，最終確定260 nm為最佳檢測波長。

3.4 測定結(jié)果分析

本實驗首次建立了舞陽貝母藥材中水溶性成份(胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤、2′-脫氧腺苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鳥苷、腺苷)的含量測定方法。該方法可使舞陽貝母水提取物中9種核苷類成份有效分離，且精密度、重復性、穩(wěn)定性較好。9批舞陽貝母樣品中的9種核苷類成份(胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤、2′-脫氧腺苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鳥苷、腺苷)含量平均值分別為45.54、24.87、10.39、103.58、407.45、32.45、189.17、441.08、368.17 μg/g，其中次黃嘌呤含量普遍較低(≤21.77 μg/g)，鳥苷含量普遍較高(≥318.39 μg/g)，可見不同批次的舞陽貝母樣品中9種核苷類成份含量差異較大；其次，9批舞陽貝母樣品(S1～S9)中9種核苷類成份的總量分別為1014.08、1526.59、1513.57、1563.99、1578.57、2256.64、1876.04、1884.99、1389.76 μg/g，可見各批次間核苷類成份總量也相差較大。

本實驗收集的9批舞陽貝母樣品是由硫熏、傳統(tǒng)炕制和烘箱烘干3種不同的產(chǎn)地加工方法加工而成，由測定結(jié)果中的9種核苷類成份總量可知，烘箱烘干的樣品含量最高[(2005.89±217.20)μg/g]，其次是傳統(tǒng)炕制[(1514.50±74.60)μg/g]，硫熏含量最低(1014.08 μg/g)，表明不同產(chǎn)地加工方法對9種核苷類成份總量會產(chǎn)生較大影響，烘箱烘干損失較小，而硫熏損失較大。有研究表明硫黃熏蒸不僅使中藥材及飲片殘留大量二氧化硫，還伴隨有復雜的化學反應，會導致多種有效成份的化學結(jié)構(gòu)和含量發(fā)生改變[26-27]。硫黃熏蒸對中藥核苷類成份的影響及其作用機制還有待進一步研究證實。

3.5 指紋圖譜分析

中藥指紋圖譜能全面地反映中藥所包含的復雜化學成份信息，是國內(nèi)外公認的中藥質(zhì)量控制有效手段。中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫作為中藥鑒定發(fā)展的有效平臺，其研究和建立是中藥質(zhì)量控制規(guī)范化、全面化、標準化的重要途徑[28]。HPLC法以其應用范圍廣、分離效能高、使用自動化、靈敏度高等優(yōu)點成為建立中藥指紋圖譜的常用方法[29]。本研究構(gòu)建了舞陽貝母水溶性成份HPLC指紋圖譜，同時對其含量進行評定，建立9批舞陽貝母水溶性成份指紋圖譜的共有模式，確定了15個共有色譜峰，并通過對照品保留時間定位對其中9個峰進行了指認。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(國家藥典委員會，2012版)”進行相似度評價，9批舞陽貝母相似度在0.822～0.910，表明河南不同產(chǎn)地舞陽貝母水溶性成份指紋圖譜基本一致，為舞陽貝母的綜合質(zhì)量評價提供了一定依據(jù)。

4 小結(jié)

本試驗建立了河南特色藥材舞陽貝母中核苷類成份的含量測定方法并初步建立了HPLC指紋圖譜，對不同批次舞陽貝母進行了質(zhì)量綜合評價，為從整體上控制舞陽貝母藥材的質(zhì)量提供了更加簡便直觀的方法。