生物質(zhì)炭對人參連作土壤微生物組成及功能的影響

楊 莉，劉宇航，郝 佳，勾 穎，潘根興，楊利民

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學 中藥材學院/省部共建生態(tài)恢復與生態(tài)系統(tǒng)管理國家重點實驗室培育基地，吉林 長春 130118；2 南京農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境研究所，江蘇 南京 210095)

人參Panax ginsengC. A. Mey.為我國傳統(tǒng)名貴藥材，也是我國藥用植物中非常具有代表性的忌連作藥材。有研究認為栽培過人參的土壤需要10～30年的恢復期[1]，原因在于人參栽培過程中，根際土壤逐漸由“細菌型”轉(zhuǎn)化為“真菌型”，病原菌數(shù)量顯著增加，對病原菌有拮抗作用的細菌、放線菌的數(shù)量減少，土壤微生物群落組成與結(jié)構(gòu)逐漸劣變[2]。但關(guān)于栽參后土壤微生物群落具體發(fā)生了什么變化，目前還鮮見相關(guān)深入報道。

近年來，隨著道地產(chǎn)區(qū)宜藥土地資源不斷減少，有關(guān)連作障礙土壤的生態(tài)修復技術(shù)引起了科研工作者與生產(chǎn)者的共同關(guān)注。目前主要研究的修復技術(shù)包括施用化學藥劑、消毒、添加土壤有益菌以及增施生物質(zhì)炭等[3-5]。其中生物質(zhì)炭作為一種新型的原位土壤改良劑，其豐富的孔隙結(jié)構(gòu)可為土壤有益微生物提供良好的附著空間和繁殖條件，促進微生物種群增長，同時生物質(zhì)炭優(yōu)良的保水、保肥能力也有助于土壤理化性質(zhì)、供肥能力的改善[6-7]。目前的研究報道顯示生物質(zhì)炭在土壤改良方面具有廣闊的應(yīng)用前景[8]。

本研究在前期工作中發(fā)現(xiàn)生物質(zhì)炭有助于提高連作參苗產(chǎn)量與品質(zhì)，但上述變化與土壤質(zhì)量、土壤微生物群落之間的關(guān)系還沒有深入分析。本試驗由此出發(fā)，擬采用3種不同原料制備的生物質(zhì)炭對老參地土壤進行修復研究，結(jié)合Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)重點分析栽參后土壤細菌群落變化及生物質(zhì)炭對上述變化的影響，為探究栽參后土壤劣變規(guī)律與原因、開發(fā)參地土壤原位修復技術(shù)提供理論支撐。

1 試驗方法

1.1 試驗地

老參地土壤改良試驗于2017—2019年在吉林省白山市灣溝鎮(zhèn)平川村 (海拔 719 m；126°23′～127°11′E，41°48′～42°13′N)進行，該地屬溫帶大陸性季風氣候，夏季短冬季長，年平均氣溫4.6 ℃。土壤前茬作物為三年生人參，起參后，結(jié)合深翻去除雜草等殘余物。參地土壤為壤土，基本性質(zhì)如下：有機碳 38.45 mg·kg-1、堿解氮 83.20 mg·kg-1、有效磷34.80 mg·kg-1、速效鉀 160 mg·kg-1、pH 5.06、電導率 48.35 μs·cm-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)計5個處理，分別為老參地、老參地+玉米秸稈炭、老參地+稻殼炭、老參地+椰殼炭和新林土處理組。生物質(zhì)炭具體施入方法：按1.5 kg/m2施入土壤中，施入后深翻2次與土壤混勻；自然放置1個冬季，于翌年5月起壟，播種人參種子，播種后日常田間管理技術(shù)參照當?shù)厝藚⑸a(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)。生物質(zhì)炭處理小區(qū)面積為10 m2，每個處理3次重復，分別以不添加生物質(zhì)炭的老參地土壤和附近未開發(fā)利用過的森林土為老參地對照和新林土對照。2019年9月取出部分二年生人參及土壤樣品，用于高通量測序分析。

土壤取樣方法：按照五點法取樣，將土壤迅速裝入無菌離心管中，液氮處理后裝入低溫樣品保存箱，迅速送回實驗室用于相關(guān)分析。

1.3 土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性

細菌總DNA的提取。采用OMEGA的E.Z.N.A.Mag-Bind Soil DNA Kit提取細菌總 DNA，Qubit3.0 DNA檢測試劑盒精確定量DNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。

PCR擴增及DNA純化回收。引物融合了MiSeq測序平臺的V3-V4通用引物：341F引物CCCTA CACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTA CGGGNGGCWGCAG；805R引物GACTGGA GTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GACTAC HVGGGTATCTAATCC。擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性 30 s，45 ℃ 退火 20 s，65 ℃ 延伸30 s，5 個循環(huán)；94 ℃ 延伸 20 s，55 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，20 個循環(huán)。PCR 擴增結(jié)束后，將純化質(zhì)檢合格的擴增產(chǎn)物1∶1等量混合，利用MiSeq臺式測序儀進行雙端測序。

16S rRNA V3-V4區(qū)高通量測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，對于MiSeq雙端測序數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間overlap的關(guān)系，利用PEAR軟件將成對reads拼接成一條序列，采用cutadapt軟件去除原始序列3′端測序接頭后根據(jù)barcode區(qū)分樣本序列，并利用Prinseq軟件對各樣本序列進行質(zhì)控和過濾，得到各樣本數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用 Microsoft office 2016、SPSS 22.0 對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣本檢測結(jié)果與質(zhì)量控制

不同處理土壤樣品高通量測序結(jié)果與細菌群落多樣性指數(shù)變化如表1所示。5個樣本共獲得有效序列310 356條，按照優(yōu)化標準，去除不合格序列后共得高質(zhì)量序列303 851條，共占有效序列的97.90%。高質(zhì)量序列可用于樣本間微生物多樣性和豐富度的評價。

表1 不同土壤樣本序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計與細菌群落Alpha多樣性的差異Table 1 Statistics of different soil sample sequence data and differences in Alpha diversity of bacterial communities

與新林土相比，老參地土壤細菌豐度(ACE、Chao1指數(shù))、多樣性(Shannon指數(shù))均呈下降趨勢。采用生物質(zhì)炭對老參地進行改良后上述指標均有所上升，其中Chao1與ACE指數(shù)增幅最大，分別達到25.05%、19.10%；表明生物質(zhì)炭處理有助于老參地土壤中細菌物種豐度及多樣性恢復，其中玉米秸稈炭及稻殼炭對上述指標影響較大。

2.2 生物質(zhì)炭對老參地土壤細菌操作分類單元數(shù)量(OTUs)及多樣性的影響

分析不同處理人參根際土壤中細菌OTUs的變化，結(jié)果如圖1。新林土數(shù)量最高，為4 650個。老參地土壤中OTUs下降為1 854個，僅為新林土中OTUs的39.87%。增施3種生物質(zhì)炭后，玉米秸稈炭、稻殼炭、椰殼炭處理組中 OTUs分別為 2 408、2 233、2 235個，較老參地均有所上升，平均提升23.62%。

圖1 不同處理下老參地土壤OTUs的維恩圖Fig. 1 Venn diagram of soil OTUs in the continuous cropping ginseng field under different treatments

2.3 不同土壤細菌門與屬水平組成與豐度的變化

不同土壤樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)門類比例變化如圖2A所示。5個處理土壤樣品中共檢測到27個細菌門，共有門類21個。新林土中細菌門類最豐富(26個)，含優(yōu)勢門類(占比＞10%)4個，包括變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、疣微菌門Verrucomicrobia，4個門細菌OTUs占比達76%以上。老參地土壤中細菌門類總數(shù)下降為24個，優(yōu)勢門類數(shù)量下降為2個，包括變形菌門與放線菌門，二者細菌OTUs占比為65%。增施生物質(zhì)炭后，除老參地+稻殼炭處理迷蹤菌門Elusimicrobia細菌數(shù)量有所恢復外，其余處理參地土壤細菌門類總數(shù)與優(yōu)勢門類數(shù)量不變，但單優(yōu)勢門類占比較老參地中有所下降，為55%～65%；表明老參地土壤微生物群落出現(xiàn)單優(yōu)勢種群上升的特點，而生物質(zhì)炭對上述變化趨勢具有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖2 生物質(zhì)炭對連作參地土壤細菌群落門類和屬水平的影響Fig. 2 Effect of biomass charcoal on the phylum and genus level of soil bacterial community in continuous cropping ginseng field

分析圖2B中不同土壤樣品中細菌群落屬水平組成與數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)新林土、老參地、老參地+玉米秸稈炭處理、老參地+稻殼炭、老參地+椰殼炭中細菌 OTUs可分別歸屬至 291、177、203、186、180個屬(僅列出排名前50，其余屬名未列出)。老參地中細菌屬總數(shù)下降，增施生物質(zhì)炭后，土壤中細菌屬分類數(shù)有所上升，表明豐富度有所增加。

2.4 土壤細菌分類和系統(tǒng)發(fā)育的變化

采用環(huán)形樹狀圖表示5個處理土壤樣品中細菌優(yōu)勢物種分類與系統(tǒng)發(fā)育的變化，結(jié)果如圖3所示。圖3共標示出土壤優(yōu)勢門中變化顯著的前20個物種。其中，變形菌門中具有顯著變化的物種最多，為6個屬；其次為酸桿菌門，5個屬；放線菌門與厚壁菌門Firmicutes中各3個屬；疣微菌門、芽單胞菌門 Gemmatimonadetes、Candidatus saccharibacteria各1個屬。

圖3 細菌分類和系統(tǒng)發(fā)育信息可視化圖Fig. 3 Visualization diagram of classification and phylogenetic information of bacteria

結(jié)合圖2可知，上述發(fā)生顯著變化的優(yōu)勢屬中Spartobacteria_genera_incertae_sedis、Sphingomonas、Gemmatimonas、Afipia、Gp1、Gp2、Gp3、Gp6、Rummeliibacillus9個屬中細菌數(shù)量表現(xiàn)為新林土＞老參地，老參地降幅為46.44%～100%。Gaiella、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、Rhizomicrobium、Arthrobacter、Marmoricola、Pseudolabrys、Mizugakiibacter、Rhodanobacter、Terriglobus、Clostridium IV、Oscillibacter11個屬中細菌數(shù)量表現(xiàn)為新林土＜老參地，老參地增幅為33.33%～54 028.57%。施用生物質(zhì)炭后，老參地中(顯著降低的種屬數(shù)量)平均增加27.52%，顯著增加的種屬中有61%的處理細菌數(shù)量有所降低，降幅為 21.83%～133 28.57 %。

2.5 生物質(zhì)炭對土壤細菌優(yōu)勢屬的影響

分析細菌優(yōu)勢屬(占比＞1%)變化如表2所示。5種土壤僅有4個共有優(yōu)勢屬，即Gaiella、芽單胞菌屬Gemmatimonas、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas和慢生根瘤菌屬Spartobacteria_genera_incertae_sedis，四者在新林土、老參地、老參地+玉米秸稈炭、老參地+稻殼炭、老參地+椰殼炭處理中占比和分別為22.49%、8.36%、13.07%、14.15%、16.01%；表明較其他微生物而言，這4個屬的微生物種群是森林土中相對較穩(wěn)定的種群，受人參栽培的影響相對較小或者變化較慢，并且生物質(zhì)炭處理可緩解其占比下降的趨勢。

表2 不同處理土壤優(yōu)勢屬組成、占比及OTUs1)Table 2Composition, proportion andOTUs of soil dominant genera in different treatments%

共有優(yōu)勢屬中慢生根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽單胞菌屬數(shù)量表現(xiàn)為新林土＞老參地(表2)，老參地中三者OTUs分別降低了84.27%、64.41%、46.44%，以慢生根瘤菌屬數(shù)量下降最為劇烈。增施生物質(zhì)炭后，上述細菌數(shù)量均有所恢復，三者OTUs較老參地處理分別增加了240.02%、38.53%、64.02%，生物質(zhì)炭處理對慢生根瘤菌屬、芽單胞菌屬細菌數(shù)量增加影響明顯。共有優(yōu)勢屬中Gaiella細菌數(shù)量表現(xiàn)為老參地＞新林土(表2)，其OTUs增加了81.71%；增施生物質(zhì)炭后，該屬細菌數(shù)量進一步增加，老參地+玉米秸稈炭、老參地+稻殼炭、老參地+椰殼炭處理OTUs分別較新林土增加了131.94%、115.74%、151.85%。表明栽培人參與使用生物質(zhì)炭刺激了Gaiella屬細菌增殖。此外，酸桿菌門Acidobacteria優(yōu)勢屬Gp1在新林土中占比為3.59%，在老參地中占比下降至0.35%，經(jīng)生物質(zhì)炭處理后，其在老參地+玉米秸稈炭、老參地+稻殼炭、老參地+椰殼炭處理中占比分別增至1.76%、1.05%、1.05%；提示人參根系分泌物可能不利于Gp1屬微生物生長，而生物質(zhì)炭處理可削弱這種不利影響，促進Gp1屬細菌數(shù)量增加，保持其屬的優(yōu)勢地位。

綜合上述分析可見，相較于同期臨近新林土，栽培人參后的老參地細菌屬組成及優(yōu)勢屬占比大多不同程度地降低，而生物質(zhì)炭處理對上述劣變趨勢具有一定的正向調(diào)節(jié)作用，使其數(shù)量變化趨勢趨向于新林土。

2.6 生物質(zhì)炭對土壤細菌功能的影響

2.6.1 土壤細菌功能基因分類 采用 COG(Clusters of orthologous groups)預(yù)測分析不同處理土壤細菌功能差異，結(jié)果如圖4所示。通過COG數(shù)據(jù)庫對比，所有基因的功能可歸為25個功能亞類，主要包括能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換6.11%～6.23%，氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝7.46%～7.96%，碳水化合物運輸和代謝6.11%～6.40%，轉(zhuǎn)錄7.42%～7.68%，復制、重組和修復5.14%～5.29%，細胞壁/質(zhì)膜/包膜生物合成6.39%～6.78%，僅常規(guī)功能預(yù)測11.92%～12.47%，信號轉(zhuǎn)導機制5.85%～6.94%等。

圖4 不同處理土壤細菌功能變化圖Fig. 4 Changes in soil bacterial function in different treatments

2.6.2 老參地與新林土處理組細菌功能差異性分析 基于 PICRUSt 軟件的細菌基因組的基因功能構(gòu)成分析結(jié)果如圖5所示。老參地與新林土處理之間的土壤細菌功能基因除核結(jié)構(gòu)和細胞外結(jié)構(gòu)外均具有顯著性差異(P＜0.05)，與新林土處理相比，老參地處理RNA加工和修飾、細胞循環(huán)控制、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝、脂質(zhì)運輸與代謝、翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)與伴侶、無機離子轉(zhuǎn)運與代謝功能有所下降，整體下降幅度為0.06%～7.56%，其余功能顯著上升，增幅為3.25%～33.16%，上升幅度最高的為染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學。

圖5 不同處理細菌基因功能差異性對比圖Fig. 5 Comparison of gene function differences of bacteria in different treatments

相較于老參地處理，加入3種不同生物質(zhì)炭后，土壤細菌RNA加工與修飾、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化、細胞循環(huán)控制、核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝、輔酶運輸與代謝、脂質(zhì)運輸和代謝、翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)功能均下降，總體下降幅度在1.00%～6.65%之間；染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學，轉(zhuǎn)錄，復制、重組和修復，信號轉(zhuǎn)導機制，僅常規(guī)功能預(yù)測和細胞防御功能提升，上升幅度在1.48%～29.89%之間。上述功能隨著3種生物質(zhì)炭的增加，逐漸向新林土靠近。其中玉米秸稈炭和稻殼炭的加入使碳水化合物的運輸和代謝功能得到提升，而椰殼炭的加入主要強化了細胞運動、無機離子轉(zhuǎn)運代謝以及細胞防御功能。

3 討論

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)能影響到土壤健康狀況[9]。目前研究普遍認為生物質(zhì)炭能夠提升土壤細菌微生物群落多樣性，從而提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和抗逆性，如Zheng等[10]在酸性水稻田中施用小麥秸稈生物質(zhì)炭發(fā)現(xiàn)，施用生物質(zhì)炭4年后明顯提升了Alpha多樣性。本研究試驗表明施用生物質(zhì)炭2年，也能夠有效提升Alpha多樣性，這說明生物質(zhì)炭施入在短期和長期內(nèi)均能夠?qū)ν寥牢⑸锒鄻有援a(chǎn)生影響。一些短期室內(nèi)試驗表明生物質(zhì)炭改變微生物多樣性以及豐度是由自身性質(zhì)的改變引起的[11-12]，而一些長期的田間試驗表明影響微生物多樣性及豐度的主要原因是土壤理化性質(zhì)得到了改善[13]。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，在田間施用生物質(zhì)炭后能夠緩解作物與微生物兩者對營養(yǎng)元素的競爭關(guān)系，一方面原因是生物質(zhì)炭自身攜帶養(yǎng)分物質(zhì)，另一方面原因是生物質(zhì)炭促進植物生長，間接促進光合作用和營養(yǎng)由根部向土壤中輸入，從而使微生物數(shù)量增長與繁殖速度加快[14-15]，微生物群落結(jié)構(gòu)的改變直接影響土壤養(yǎng)分循環(huán)[16]。

Ye等[17]研究發(fā)現(xiàn)有機肥和生物炭基肥的施加使土壤中綠彎菌門Chloroflexi、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門細菌均發(fā)生顯著變化。本試驗研究結(jié)果表明，新林土中變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和疣微菌門為優(yōu)勢門類，栽培人參后變形菌門、放線菌門數(shù)量增加，酸桿菌門和疣微菌門數(shù)量迅速減少，分析發(fā)現(xiàn)老參地土壤微生物群落變化與人參根際分泌物的驅(qū)動密切相關(guān)[18-19]。隨著3種不同原料生物質(zhì)炭的施加，厚壁菌門、疣微菌門、芽單胞菌門、變形菌門和假絲酵母糖化菌門等門類得到調(diào)節(jié)，使其數(shù)量趨近于新林土。其中變形菌門生長緩慢，一方面可能是由于本試驗添加生物質(zhì)炭2年后才進行取樣，此時的土壤微生物群落已處于穩(wěn)定狀態(tài)，因此導致變形菌門生長較慢；另一方面可能是由于生物質(zhì)炭呈堿性，加入后使自身攜帶的難分解有機碳稀釋土壤可溶性有機碳，從而導致變形菌門細菌增加緩慢，同時刺激疣微菌門細菌的生長。

生物質(zhì)炭能夠增加土壤中的碳含量，對快速增殖細菌產(chǎn)生誘導作用，添加生物質(zhì)炭后土壤細菌的代謝功能發(fā)生顯著的變化。本研究發(fā)現(xiàn)較新林土，老參地處理細菌代謝功能下降，施入生物質(zhì)炭后能夠改善細菌核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝、輔酶運輸與代謝、脂質(zhì)運輸和代謝、翻譯后修飾及蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)與伴侶等功能；說明施入生物質(zhì)炭后，土壤細菌具有選擇性，土壤細菌功能轉(zhuǎn)向代謝方向，從而調(diào)節(jié)對土壤有機質(zhì)的保存能力，與張婷婷[20]研究結(jié)果一致。

綜合上述分析可見，加入生物質(zhì)炭能夠提升土壤細菌多樣性，調(diào)節(jié)細菌群落結(jié)構(gòu)以及細菌功能，使老參地土壤朝良好的方向發(fā)展，但具體的調(diào)節(jié)機制尚未有明確的結(jié)果，仍需更多的試驗加以證明。本研究結(jié)果能夠為連作參地土壤的修復及人參栽培提供理論參考。

4 結(jié)論

1)相較于新林土，栽培人參后的老參地土壤細菌數(shù)量、群落多樣性、細菌分類組成及優(yōu)勢屬占比均不同程度的下降，并表現(xiàn)出單優(yōu)勢種群比例上升的特點。生物質(zhì)炭處理對上述劣變趨勢具有一定的正向調(diào)節(jié)作用，使細菌數(shù)量變化趨勢趨向于新林土，細菌功能中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學，轉(zhuǎn)錄，復制、重組和修復，信號轉(zhuǎn)導機制和細胞防御得到提升。

2)老參地中Spartobacteria_genera_incertae_sedis、Sphingomonas、Gemmatimonas、 Afipia 、Gp1、Gp2、Gp3、Gp6、Rummeliibacillus9 個屬細菌數(shù)量顯著降低，提示栽培人參或人參根系分泌物可能不利于上述細菌的生長和種群數(shù)量的維持。

3)老參地中Gaiella屬細菌數(shù)量顯著增加，添加生物質(zhì)炭后該屬優(yōu)勢度進一步增加，表明表明栽培人參和施用生物質(zhì)炭均可刺激Gaiella屬細菌增殖。