腹腔注射α-GalCer對非酒精性脂肪性肝病的影響

梁蕊，高翔，滕景芳，王建國，程樹杰,4,孟明

(1.河北大學 基礎醫(yī)學院，河北 保定 071000; 2.河北省炎性自身免疫性疾病發(fā)病機制及防治重點實驗室，河北 保定 071000； 3.河北大學附屬醫(yī)院 肝膽外科，河北 保定 071000; 4.河北省普通外科數(shù)字醫(yī)學基礎研究重點實驗室，河北 保定 071000)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指非酒精攝取因素引起的以肝臟脂肪病變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[1].全球估計有17億人患NAFLD，患病率約為25%[2-4]. NAFLD的疾病譜包括：單純性脂肪變性/非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease ，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化(liver cirrhosis)及肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC).NAFL的組織學定義為≥5%的肝臟存在脂肪變性，而沒有肝細胞損傷.NASH的組織學定義為≥5%的肝臟存在脂肪變性且伴隨肝組織學可見的炎癥.患者可長期處于NAFL階段，一旦進展為 NASH 階段，發(fā)生肝纖維化、肝硬化、肝癌的風險明顯升高[5-6].

恒定自然殺傷T細胞 (invariant nature kiler T cell，iNKT)是一群兼具NK細胞受體(NK1.1)和T細胞表面受體(TCR)的特殊T細胞群[7].與傳統(tǒng)的T細胞不同，iNKT細胞是由抗原提呈細胞表面的MHC I類分子CD1d 提呈的糖脂類抗原激活，激活的iNKT細胞可以分泌抑炎和促炎型細胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α等 )，可與T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、Treg細胞相互作用，在腫瘤、感染和自身免疫性疾病等多種疾病中發(fā)揮著重要的免疫調節(jié)作用[8-11].

iNKT細胞主要由胸腺中的CD4+CD8+雙陽性細胞(DP)發(fā)育分化而來.根據(jù)轉錄因子和細胞因子分泌偏向，可分化為3個主要亞群：iNKT1亞群(表達轉錄因子T-bet，主要分泌IFN-γ)、iNKT2亞群(高表達GATA-3和PLZF，主要分泌IL-4和IL-13)、iNKT17亞群(表達PLZF和RORγt，主要分泌IL-17)[12].α-半乳糖神經(jīng)鞘胺醇(α-galactosylceramide,α-GalCer)是一種從海綿中提取的iNKT 細胞特異性激活劑[8]，可有效激活iNKT細胞，目前已廣泛應用于腫瘤、感染和自身免疫病等模型的干預研究[13-15].近來研究表明，iNKT細胞亞群的特異性激活，可有效發(fā)揮其免疫調控和免疫治療作用[16-17].

肝臟富含iNKT細胞，肝臟中iNKT細胞占T淋巴細胞的30%～40%[18].近來研究發(fā)現(xiàn)肝臟iNKT細胞在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，但對NAFLD的發(fā)生具有促進還是抑制作用仍然存在爭議[19].筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射α-GalCer可以選擇性激活主要分泌Th2型抑炎性細胞因子的肝臟iNKT2亞群[20]，同時減少了NAFL小鼠肝臟脂肪沉積[21].為驗證腹腔注射α-GalCer能否有效改善NASH小鼠肝臟脂肪沉積和炎癥反應，筆者采用高脂飲食或蛋氨酸/膽堿缺乏飲食分別喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠，構建NAFL和NASH小鼠模型[22].模型構建成功后，給予腹腔注射α-GalCer，觀察在不同疾病狀態(tài)下肝臟iNKT細胞及亞群的變化情況以及其對2種模型小鼠的治療作用，為NAFLD的免疫學防治提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性C57BL/6J小鼠，4～5周齡，體質量(21.40±0.67)g和8～9周齡，體質量(24.24±0.54)g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006.飼養(yǎng)在河北大學醫(yī)學實驗動物中心SPF級動物室.適應性飼養(yǎng)1周后，采用高脂飼料或蛋氨酸/膽堿缺乏飼料分別喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠，建立NAFL模型和NASH模型.嚴格遵守河北大學《實驗動物保護條例》，所有實驗操作都已經(jīng)過河北大學動物福利倫理委員會的批準.

1.2 試劑與儀器

高脂飼料(H10060)(許可證號：SCXK(京)2016-0008)；蛋氨酸/膽堿缺乏飼料(H10401)(許可證號：SCXK(京)2014-0008)，購自北京華阜康生物科技股份有限公司；伊紅、蘇木素、促藍液、曙紅液購自赫貝科技有限公司；PE-T-selected-CD1d tetramer購自MBL International Woburn MA公司；FITC-Anti-MouseTCR-β(553170)，PercP-Cy TM5.5 Mouseanti-T-bet(561316)，Alexa Fluor647 Mouse Anti-PLZF(563490)購自BD公司；FoxP3/TranscriPtion Factor Staining Buffer購自eBioscience;α-半乳糖神經(jīng)鞘胺醇(α-GalCer)購自ENZO Life Sciences；小鼠臟器組織淋巴細胞分離液試劑盒，購自Solarbio生物科技有限公司；OlymPusBX50光學顯微鏡(OlymPus公司)；流式細胞儀Accuri C6 (BD 公司)；COBAS6000 型全自動生化儀(德國羅氏診斷公司)；TB-718E型生物組織自動包埋機(泰維科技有限公司)；TK-218型恒溫攤片烤片機(泰維科技有限公司)；RM2255生物組織自動切片機(上海徐卡顯微系統(tǒng)有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

隨機選取20只小鼠(4～5周齡和8～9周齡各10只)作為空白對照組，喂食標準飼料.隨機選取20只4～5周齡小鼠喂食高脂飲食12周作為HFD組； 隨機選取20只8～9周齡小鼠喂食蛋氨酸/膽堿缺乏飲食6周作為MCD組.模型構建成功后，分別從高脂飲食或蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠中各自隨機選取10只腹腔注射α-GalCer (100 ng/g).3 d后，小鼠腹腔注射質量分數(shù)1% 苯巴比妥(50 mg/kg)，深度麻醉狀態(tài)下，摘眼球取血，脫頸椎處死進行后續(xù)實驗.

1.3.2 小鼠狀態(tài)評估

每周動態(tài)監(jiān)測小鼠質量，每天觀察小鼠活動情況、精神狀態(tài)及毛發(fā)光澤度.

1.3.3 血清生化指標分析

小鼠深度麻醉狀態(tài)下，摘眼球取血，離心取上層血清，全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇(TCH)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白(HDL)，低密度脂蛋白(LDL)，谷氨酸氨基轉移酶(ALT)，門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的含量.

1.3.4 肝臟外觀、肝臟指數(shù)和肝臟H&E染色

小鼠深度麻醉狀態(tài)下，脫頸椎處死，解剖分離肝臟，PBS清洗后，對小鼠肝臟進行稱重，計算肝臟指數(shù).肝臟指數(shù)=肝臟質量(mg)/體質量(g).

取肝臟相同部位組織，經(jīng)福爾馬林溶液固定及常規(guī)H&E染色后，通過光鏡進行病理學檢測.

1.3.5 流式細胞術檢測肝臟iNKT頻率

小鼠肝臟在預冷的PBS中剪碎、研磨，過74 μm細胞篩，制成單細胞懸液.細胞經(jīng)PBS洗滌離心2次(4 ℃、1 000 r/min、5 min)后，利用小鼠臟器淋巴細胞分離液分離淋巴細胞.分離得到的淋巴細胞再經(jīng)PBS洗滌離心2次(4 ℃、1 000 r/min、5 min)并計數(shù)，取1×106個細胞置于干凈的流式管中，用FITC標記的Anti-TCRβ、PE標記的負載α-GalCer的CD1d四聚體(α-GalCer/CD1d tetramers)進行染色，4 ℃避光孵育30 min后，經(jīng)流式細胞儀檢測iNKT細胞頻率.α-GalCer/CD1d tetramers為本實驗室制備：體積分數(shù)0.5%Tween-20和質量分數(shù)0.9%NaCl將1 mg/mL的α-GalCer稀釋至200 μg/mL，每100 μL CD1d Tetramer中加入5 μL稀釋后的α-GalCer，室溫孵育12 h，4 ℃儲存.

1.3.6 流式細胞術檢測肝臟iNKT1、iNKT2亞群頻率

同1.3.5小節(jié)，上述分離的淋巴細胞，經(jīng)FITC標記的Anti-TCRβ、PE標記的負載α-GalCer的CD1d四聚體(α-GalCer/CD1d tetramers)進行染色后，依據(jù)FoxP3/TranscriPtion Factor Staining Buffer的具體操作步驟對細胞進行透化固定處理，隨后加入1 μL PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet和1 μL Alexa Fluor? 647 Mouse Anti-PLZF，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2次，500 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測iNKT1和iNKT2亞群頻率.

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠外觀及體重變化

與對照組比較，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠體質量逐漸上升，體型肥胖，皮下脂肪含量增多，喂養(yǎng)12周后，達到肥胖的標準(BMI>20%)(圖1a、b)，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠體質量逐漸下降，體型消瘦，皮下脂肪含量減少(圖1c，1d).

a. 正常飲食及 HFD組小鼠外觀；b. 正常飲食及 HFD組小鼠體質量變化曲線；c. 正常飲食及 MCD組小鼠外觀；d. 正常飲食及 MCD組小鼠體質量變化曲線.圖1 2組飲食喂養(yǎng)的小鼠外觀及體質量變化Fig.1 Appearance and body weight of mice fed with high-fat diet or methionine/choline deficiency diet

2.2 血清生化指標

與對照組比較，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠血清中TCH、HDL、LDL及ALT的濃度水平均顯著升高(P<0.05)，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠血清中TCH、TG及LDL的濃度水平均顯著降低(P<0.05).而ALT和AST的濃度水平顯著升高(P<0.05).與模型組比較，腹腔注射α-GalCer后，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠血清中TCH、HDL及LDL的濃度水平均顯著降低(P<0.05)，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠血清中ALT和AST的濃度水平顯著升高(P<0.05)(圖2a、b).

a.高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠；b.蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠.圖2 腹腔注射α-GalCer對不同飲食喂養(yǎng)的小鼠血清中TCH、TG、HDL、LDL、AST、ALT水平的影響Fig.2 Effects of intraperitoneal injection of α-GalCer on serum TCH, TG, HDL, LDL，AST, ALT level of mice fed with different diets

2.3 肝臟外觀、肝臟指數(shù)和肝臟組織病理學變化

對照組小鼠肝臟顏色暗紅，表面光滑，邊緣銳利，質韌；高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟體積增大，外觀呈淡黃或奶油黃色，略白，表面有細小顆粒感，腫大易碎，邊緣較鈍，切面略帶油膩感；蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟色澤暗淡，泛黃，質地尚軟，觸之有顆粒感.腹腔注射α-GalCer后，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟色澤偏粉，而蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟邊緣發(fā)生紅腫(圖3a、d).

與對照組比較，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟指數(shù)無明顯變化(P>0.05)，而蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟指數(shù)明顯增大(P<0.05).和模型組比較，腹腔注射α-GalCer后，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟指數(shù)仍無明顯變化(P>0.05)，而蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟指數(shù)進一步增大，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05) (圖3b、e).

H&E染色結果表明，對照組小鼠肝細胞大小和形態(tài)正常，肝索排列整齊，肝小葉結構正常，高脂或蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟中出現(xiàn)大量脂肪空泡，肝細胞胞質中脂質累積，出現(xiàn)肝臟脂肪變性，且蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟中除存在脂肪變性外，還有明顯的炎細胞浸潤.腹腔注射α-GalCer后，2種飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟脂肪變性均有所改善，而蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟中炎細胞浸潤進一步加重(圖3c，f).

a. HFD組小鼠肝臟外觀；b. HFD組小鼠肝臟指數(shù)變化；c. HFD組小鼠肝臟病理變化；d.MCD組小鼠肝臟外觀；e. MCD組小鼠肝臟指數(shù)變化；f. MCD組小鼠肝臟病理變化.(100×∶100倍視野，400×∶400倍視野；紅色箭頭所示炎細胞浸潤).圖3 腹腔注射α-GalCer 對不同飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟外觀、肝臟指數(shù)及病理學改變Fig.3 Effects of intraperitoneal injection of α-GalCer on liver appearance liver index and pathological changes in mice fed with different diets

2.4 腹腔注射α-GalCer對2種飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT頻率的影響

與對照組比較，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT頻率明顯降低(P<0.05)，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT頻率明顯升高(P<0.05).與模型組比較，腹腔注射α-GalCer后，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT頻率明顯升高(P<0.05)，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT頻率明顯下降(P<0.05)(圖4a-c).

a.HFD和MCD組小鼠肝臟iNKT頻率的散點圖；b和c.HFD和MCD組小鼠肝臟iNKT頻率的統(tǒng)計圖.圖4 腹腔注射α-GalCer明顯影響HFD組或MCD組小鼠肝臟iNKT細胞的頻率Fig.4 Frequency of iNKT cells in the liver of mice fed with HFD or MCD diet was significantly affected by intraperitoneal injection of α-GalCer

2.5 腹腔注射α-GalCer對2種飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT亞群的影響

與對照組比較，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT1亞群比例明顯升高(P<0.05)，iNKT2亞群比例升高，但沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖5a-c)，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT1亞群比例明顯升高(P<0.05)，iNKT2亞群比例明顯下降(P<0.05)(圖5a，d，e).和模型組比較，腹腔注射α-GalCer后，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT1亞群比例明顯下降，iNKT2亞群比例明顯升高(P<0.05)(圖5a-c)，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT1亞群比例升高，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，iNKT2亞群比例也明顯升高(P<0.05)，但是以iNKT1亞群為主(圖5a，d，e).

a.HFD和MCD組小鼠肝臟iNKT亞群頻率的散點圖；b、c、d、e.HFD和MCD組小鼠肝臟iNKT亞群頻率的統(tǒng)計圖.圖5 腹腔注射α-GalCer明顯影響HFD組或MCD組小鼠肝臟iNKT細胞亞群的分布Fig.5 Frequency of subsets of iNKT cells in the liver of mice fed with HFD or MCD diet was significantly affected by intraperitoneal injection of α-GalCer

2.6 腹腔注射α-GalCer對2種飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT1/iNKT2比值的影響

與對照組比較，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT1/iNKT2比值有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT1/iNKT2比值也有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05).和模型組比較，腹腔注射α-GalCer后，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT1/iNKT2比值進一步降低，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟iNKT1/iNKT2比值有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖6a-b).

圖6 腹腔注射α-GalCer對HFD(a)或MCD(b)組小鼠肝臟iNKT1/iNKT2比值的影響Fig.6 Effect of intraperitoneal injection of α-GalCer on the ratio of liver iNKT1/iNKT2 in HFD(a) or MCD(b) group

3 討論

利用高脂飲食或蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)小鼠是構建NAFLD動物模型常用的方法.蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)的小鼠造模周期短，肝臟炎癥反應明顯，但不太符合人類NAFLD發(fā)生的特點.而高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠造模周期長，與人類NAFLD的自然發(fā)生相似[23-24].本研究分別采用高脂飲食或蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)小鼠建立NAFL和NASH 2種動物模型，結果發(fā)現(xiàn)，NAFL小鼠體質量明顯增加，體脂含量也增加，而NASH小鼠體質量明顯下降，體脂含量也降低.肝臟指數(shù)的比較結果表明，NAFL小鼠肝臟指數(shù)有上升趨勢，但是沒有統(tǒng)計學意義，而NASH小鼠肝臟指數(shù)明顯增大，與Sung-Bae K和Ikawa-Yoshida A等[25-26]的報道一致，這可能由于NASH小鼠體質量明顯下降，NAFL小鼠體質量明顯上升所致.病理結果顯示，NAFL小鼠肝細胞中有大量的脂肪空泡和肝臟大面積脂肪變性，而未出現(xiàn)炎細胞浸潤；NASH小鼠肝細胞中也出現(xiàn)脂肪空泡和肝臟脂肪變性，并伴有大量炎細胞浸潤.血生化指標顯示，NAFL小鼠血清中TCH、HDL及LDL水平升高，ALT也升高，而NASH小鼠血清中TCH、TG、LDL水平降低，AST和ALT水平升高.這些結果表明，NAFL顯示出單純的肝臟脂肪變性，而NASH在肝臟脂肪變性的基礎上出現(xiàn)了炎癥反應.

隨后筆者觀察腹腔注射α-GalCer對模型組肝臟iNKT頻率和亞群的作用以及對其他監(jiān)測指標的影響.流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，腹腔注射α-GalCer提高了NAFL小鼠肝臟iNKT頻率，明顯增加了iNKT2亞群比例.此外，腹腔注射α-GalCer后，可明顯改善NAFL小鼠肝臟脂肪變性，降低NAFL小鼠血清中TCH、HDL、LDL和ALT水平.這些結果表明，腹腔注射α-GalCer，激活了肝臟iNKT2亞群，有效改善了肝臟脂肪沉積.而同樣是腹腔注射α-GalCer卻明顯增加了NASH小鼠肝臟iNKT1亞群比例，iNKT2亞群比例升高的并不明顯；NASH小鼠肝臟的病理染色結果在腹腔注射α-GalCer后同樣顯示了肝臟脂肪沉積減少，但卻出現(xiàn)了炎細胞浸潤的加?。谎Y果也出現(xiàn)了轉氨酶水平的升高.據(jù)此筆者推測：腹腔注射α-GalCer通過激活肝臟iNKT2亞群改善了NAFL和NASH小鼠肝臟脂肪沉積，通過激活肝臟iNKT1亞群加重了NASH小鼠肝臟炎癥反應.

同樣腹腔注射α-GalCer，NAFL小鼠主要激活肝臟iNKT2亞群，而NASH小鼠激活的主要是iNKT1亞群，這可能是NAFL和NASH小鼠肝臟局部微環(huán)境的不同影響了iNKT亞群的差異性激活，其機制有待深入研究.該結果提示，腹腔注射α-GalCer激活的iNKT細胞在NAFLD發(fā)病不同階段可能發(fā)揮著截然不同的作用.有研究顯示，在可逆的NAFL階段，NKT細胞可以改善NAFLD病情，當炎癥出現(xiàn)，即NASH階段時，iNKT細胞加劇NAFLD的發(fā)展[27].這與NAFLD不同階段肝臟iNKT細胞不同亞群的激活密切相關.肝臟iNKT1亞群的激活，通過釋放致炎性細胞因子直接或間接促進了肝臟的炎癥反應；而肝臟iNKT2亞群的激活，有利于改善肝臟脂代謝，從而減輕肝細胞的脂質堆積.Szczepankiewicz等[28]的研究結果表明，成熟大鼠脂肪細胞中IL-4可以刺激脂肪生成并抑制脂肪分解.相關研究還指出，暴露于Th2型細胞因子(如IL-4)的脂肪組織可以誘導M2型巨噬細胞的增殖，而暴露于Th1型細胞因子(如TNF-α)則抑制了它們的增殖[29]. iNKT2亞群激活如何改善肝臟脂代謝，筆者推測可能是iNKT2細胞通過釋放IL-4直接影響脂代謝相關通路或通過使M2型巨噬細胞極化間接調控脂代謝，詳細的作用機制需要進一步研究.

肝臟作為機體重要的免疫和代謝器官，其免疫微環(huán)境是維持正常功能的重要因素.充分考慮肝臟組織微環(huán)境在免疫調控中的作用，利用肝臟免疫微環(huán)境的協(xié)同作用是未來治療NAFLD的一種新策略.