具有潛在補(bǔ)血活性的阿膠肽鐵螯合物的結(jié)構(gòu)表征

曹叢叢，管玲娟，屠飄涵，蔡平梨，成向榮*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(徐州市銅山區(qū)家禽技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 徐州，221168)

鐵元素是人體含量最高且必需的微量元素，是紅細(xì)胞合成血紅素必不可少的物質(zhì)，在機(jī)體代謝中有著重要作用[1]。然而，據(jù)報(bào)道全球有20億人因缺鐵出現(xiàn)營養(yǎng)問題，缺鐵性貧血可引起認(rèn)知能力、成長發(fā)育和腸道免疫機(jī)制的功能障礙[2]，已成為發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家的主要公共衛(wèi)生問題[3]。阿膠作為一種歷史悠久的滋補(bǔ)良藥和功能食品，兩千多年來被廣泛應(yīng)用于早期造血和抗貧血治療[4]。然而，因其成分的多樣化和加工工藝的影響，對阿膠的補(bǔ)血活性物質(zhì)及其化學(xué)成分與生物活性之間關(guān)系的研究比較有限。

近些年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)運(yùn)用人工消化模型從阿膠的水解產(chǎn)物中獲得分子質(zhì)量小于5 000 Da的肽組分能夠增加5-氟尿嘧啶引起的貧血小鼠的骨髓造血干/祖細(xì)胞集落數(shù)量，且補(bǔ)血效果明顯，推斷阿膠產(chǎn)生藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是分子質(zhì)量較小的組分[5-6]。體外消化模型的建立提供了一條研究阿膠活性成分的新途徑。值得關(guān)注的是，阿膠通常會與一些富含鐵的輔料(如核桃、芝麻、大棗等)加工為方便食用的阿膠糕。此外，阿膠的主要成分是蛋白質(zhì)，進(jìn)入消化道后被水解為肽。與氨基酸和蛋白質(zhì)相比，肽具有許多優(yōu)勢，可以依賴于腸上皮細(xì)胞兩側(cè)的物質(zhì)濃度和電化學(xué)勢的差別通過細(xì)胞旁路途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到腸上皮細(xì)胞中且不需要消耗能量[7]。許多研究也表明，從食物蛋白水解物中獲得的多肽可與金屬離子結(jié)合形成多肽金屬螯合物，這種螯合物的形式比游離金屬離子更容易被機(jī)體吸收利用[8-10]。

因此，本研究假設(shè)在消化過程中形成的阿膠肽鐵螯合物是阿膠的潛在補(bǔ)血活性成分，并研究了阿膠在體外對亞鐵的螯合能力和促進(jìn)鐵吸收的作用，且進(jìn)一步證明了阿膠肽與肽鐵螯合的物理特性和結(jié)構(gòu)特征。本研究可為對阿膠補(bǔ)血活性成分的理解提供實(shí)質(zhì)性的補(bǔ)充，為促進(jìn)傳統(tǒng)阿膠產(chǎn)品的多樣化及品質(zhì)提升提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿膠粉，市場購置；胃蛋白酶(≥ 2 500 U/mg)，阿拉丁生物科技有限公司；胰蛋白酶(≥ 50 000 U/g)、鄰菲羅啉、七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、濃硝酸、無水乙醇、乙酸鈉、乙酸銨、磷酸二氫鉀、碳酸銨等試劑均為分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖凝膠6B，索萊寶生物科技有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、環(huán)氧氯丙烷(epichlorohydrin，ECH)、亞氨基二乙酸，麥克林生化科技有限公司；Krebs-Ringer緩沖液，飛凈生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nexlon 350D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國Perkin Elmer公司；微波消解系統(tǒng)，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；THZ-C-L臺式冷凍恒溫振蕩器，太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ST3100 pH計(jì)，常州奧豪斯儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物股份有限公司；Ussing chamber系統(tǒng)，美國 Physiologic Instruments公司；F98熒光分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；傅立葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本株式會社日立高新技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鐵元素含量測定

分別稱取0.20 g阿膠粉，用于阿膠中總鐵含量和螯合鐵含量的測定。用來測定總鐵含量的樣品不做前處理，測定螯合鐵含量的樣品需用無水乙醇溶液多次洗滌，并在6 000 r/min下離心15 min，取1 mL的上清液加入20 mg/mL的抗壞血酸溶液80 μL，5 mg/mL 的鄰菲羅啉溶液160 μL顯色，直至無明顯橙紅色出現(xiàn)，將乙醇洗滌后的阿膠樣品置于40 ℃水浴鍋中蒸干。做3組平行樣品，得到待測樣品。

將上述待測樣品置于干燥的聚四氟乙烯消解罐中，加入10 mL濃硝酸，并做樣品空白對照。設(shè)定消解程序?yàn)椋?～120 ℃升溫12 min，恒溫5 min；120～160 ℃升溫6 min，恒溫10 min；160～180 ℃升溫6 min，恒溫15 min，微波消解儀功率為1 600 W。待消解完成后冷卻至室溫，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用超純水反復(fù)沖洗3次，合并消解液，用1%(體積分?jǐn)?shù))的稀硝酸定容至刻度，得供試樣品溶液。各組微波消解后得到的溶液用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定鐵元素的含量。

1.3.2 模擬消化液的配制

根據(jù)MINEKUS等[11]建立的食品通用標(biāo)準(zhǔn)化體外消化方法，稍作修改?？谇荒M消化液(simulated oral fluid，SOF)、胃液模擬消化液(simulated gastric fluid，SGF)和腸液模擬消化液(simulated intestinal fluid，SIF)由相應(yīng)的電解質(zhì)儲備液配制而成。據(jù)中國居民膳食微量元素鐵的參考攝入量，將FeSO4·7H2O溶解在SOF儲備液中，制備成質(zhì)量濃度為1.50 mg/mL的膳食Fe2+溶液。分別用SGF儲備液溶解胃蛋白酶，配制酶活力為2 500 U/mg，質(zhì)量濃度為10 mg/mL的胃蛋白酶溶液；用SIF儲備液溶解胰蛋白酶，配制酶活為50 U/mg，質(zhì)量濃度為16 mg/mL的胰蛋白酶溶液。模擬消化電解質(zhì)儲備液的配制見表1，并將配制好的電解質(zhì)儲備液定容至100 mL，于-20 ℃下保存。

表1 模擬消化電解質(zhì)儲備液的配制Table 1 Preparation of electrolyte stock solutions of simulated digestion fluids

1.3.3 阿膠的體外模擬消化

(1)模擬口腔消化：稱取5.00 g 阿膠與4 mL膳食Fe2+溶液混合，加入25 μL CaCl2溶液，超純水定容至10 mL，37 ℃振蕩消化2 min，得口腔消化產(chǎn)物。

(2)模擬胃液消化：將口腔消化產(chǎn)物與7.5 mL SGF儲備液混合，加入5 μL CaCl2溶液，調(diào)節(jié)pH至3.0后加入1.6 mL胃蛋白酶液，超純水定容至10 mL，37 ℃振蕩消化120 min，得胃消化產(chǎn)物。

(3)模擬腸液消化：將胃液消化產(chǎn)物與11 mL SIF儲備液混合，加入40 μL CaCl2溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0后加入5.0 mL胰蛋白酶液，超純水定容至20 mL，37 ℃振蕩消化120 min，得腸消化產(chǎn)物。消化液在95 ℃水浴鍋中加熱10 min滅酶。

1.3.4 Ussing chamber吸收實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 吸收樣品制備

將上述1.2.3所得的不同消化產(chǎn)物用無水乙醇多次洗滌，去除游離鐵。以腸消化樣品為標(biāo)準(zhǔn)，用Krebs-Ringer緩沖液稀釋至Fe2+質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL，且3組消化樣品稀釋同等倍數(shù)。FeSO4·7H2O溶液作為對照組，F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL。

1.3.4.2 吸收實(shí)驗(yàn)

健康的SD大鼠被禁食12 h后乙醚麻醉，立即分離出十二指腸，并將其剪成2.0 cm的小段，用鑷子除去漿膜和部分肌肉層。將制備好的腸黏膜安裝在灌流小室中，有效透過面積為0.5 cm2。向小室的兩側(cè)加入5 mL 37 ℃預(yù)熱的緩沖液，持續(xù)通入體積分?jǐn)?shù)95% O2和5% CO2混合氣體，系統(tǒng)溫度保持37 ℃，并平衡30 min，使腸黏膜達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。將5.0 mL樣品溶液加入黏膜側(cè)，等體積的緩沖液加入漿膜側(cè)。吸收實(shí)驗(yàn)開始后，分別在0、15、30、60、90、120 min收集1.0 mL漿膜樣品以測定鐵透過率，同時(shí)在每個取樣點(diǎn)的漿膜側(cè)加入等量的緩沖液。吸收結(jié)束后，收集粘膜側(cè)的溶液，按上述1.2.1的方法測定累積鐵吸收率[12]。根據(jù)SJ?GREN等[13]的方法計(jì)算鐵向漿膜側(cè)的累積透過率和表觀滲透系數(shù)。

1.3.5 固定化金屬親和層析(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)分離鐵螯合肽

參考GUO等[14]的方法制備層析填料，并稍作修改。將除去乙醇的瓊脂糖凝膠6B與60%(體積分?jǐn)?shù))的DMSO和40%(體積分?jǐn)?shù))的ECH混合，40 ℃活化3.5 h后與亞氨基二乙酸溶液(3∶10，g∶mL) 60 ℃下偶聯(lián)10 h，結(jié)束后裝于玻璃層析柱(30 mm×400 mm)中。用超純水流洗3個柱體積后用0.2 mol/L的 Fe2+溶液流洗5個柱體積，使填料充分結(jié)合Fe2+，再用超純水清洗至流出物中檢測不到Fe2+，繼續(xù)流洗平衡緩沖液A(0.05 mol/L的乙酸鈉和0.10 mol/L的氯化鈉，pH 5.5)去除非特異性結(jié)合的Fe2+，并平衡IMAC柱。將凍干的阿膠腸消化產(chǎn)物用緩沖液A溶解為20 mg/mL的溶液，裝載到IMAC柱上。上樣量為10 mL，流速1.0 mL/min，在220 nm處監(jiān)測洗脫液的吸光度。用緩沖液A洗脫未結(jié)合的肽，直到基線穩(wěn)定。然后用緩沖液B(0.02 mol/L磷酸氫二鈉，0.10 mol/L氯化鈉和0.01%乙酸銨，pH 8.4)洗脫出鐵螯合肽。收集洗脫組分，于150 Da納濾脫鹽后冷凍干燥。

1.3.6 阿膠肽鐵螯合物的制備

參照唐順博[15]的方法，將鐵螯合肽配制成質(zhì)量濃度為40 g/L的溶液，調(diào)節(jié)pH至5.5，肽與Fe2+的質(zhì)量比為4∶1，并在37 ℃下振蕩螯合60 min。結(jié)束后冷卻至室溫，混合物在6 500 r/min下離心15 min，上清液冷凍干燥后獲得阿膠肽鐵螯合物。

1.3.7 分子質(zhì)量分布及氨基酸組成分析

分子質(zhì)量分布由HPLC測定，將鐵螯合肽溶解在超純水中配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，通過0.45 μm過濾器，上樣量10 μL，流速0.5 mL/min加載到HPLC上。另稱取0.12 g鐵螯合肽經(jīng)酸水解22 h后通過氨基酸分析儀測定，流速為1.0 mL/min。

1.3.8 質(zhì)譜分析

鐵螯合肽的氨基酸序列通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析[16]，樣品流速為5 μL/min。質(zhì)譜參數(shù)為：正電荷噴霧電壓為2.0 kV，毛細(xì)管溫度300 ℃，最大駐留時(shí)間為50 ms前驅(qū)體離子掃描范圍350～1 550m/z。

1.3.9 鐵螯合肽和肽鐵螯合物的結(jié)構(gòu)表征

1.3.9.1 熒光光譜分析

鐵螯合肽粉末溶解在超純水中配制成0.1 mg/mL的溶液，加入不同濃度的FeSO4·7H2O(0、0.05、0.10、0.20、0.50和1.00 mmol/L)，在335 nm的激發(fā)波長下進(jìn)行熒光掃描，發(fā)射波長為365～500 nm。

1.3.9.2 傅里葉紅外光譜分析

將鐵螯合肽及其肽鐵螯合物各2.0 mg放入瑪瑙研缽中，加入200.0 mg干燥溴化鉀混合并研磨均勻。將混合物壓成透明的薄片，放入紅外測定室，使用傅立葉變換光譜儀在4 000～400 cm-1處掃描[17]。

1.3.9.3 掃描電子顯微鏡分析(scanning electron microscope，SEM)

參考CHEN等[18]的方法，將適量的鐵螯合肽和肽鐵螯合物粉末均勻涂布在樣品板的雙面膠帶上，經(jīng)噴金后，在3.0 kV的加速電壓下，用SEM觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Graphpad Prism 7.0軟件作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采用Duncan多重比較檢驗(yàn)，以P<0.05表示為差異顯著，P>0.05表示為無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿膠在消化過程中鐵螯合量的變化

經(jīng)體外消化阿膠的鐵螯合量發(fā)生了變化，如圖1所示，經(jīng)口腔消化后阿膠螯合鐵量是未消化阿膠的12倍，這可能因?yàn)樯攀矲e2+溶液的添加，增加了阿膠與Fe2+螯合的機(jī)會。與口腔消化相比，胃液消化后鐵螯合量無明顯變化(P>0.05)，這可能與胃液中較低的pH值有關(guān)。在酸性條件下，溶液中的H+會與Fe2+競爭螯合基團(tuán)，并抑制鐵的螯合[19]。阿膠經(jīng)腸消化后鐵螯合能力顯著提高(P<0.05)是未消化阿膠的16倍。通過消化，阿膠被胃蛋白酶和胰蛋白酶水解產(chǎn)生肽或氨基酸，暴露出更多的具有螯合能力的功能團(tuán)和氨基酸殘基，提高了其鐵螯合能力。

圖1 模擬消化對阿膠鐵螯合量的影響Fig.1 The effects of simulated digestion on iron chelating capacity of Ejiao注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)(下同)

2.2 模擬消化對阿膠的促鐵吸收能力的影響

采用Ussing chamber系統(tǒng)評價(jià)阿膠不同消化產(chǎn)物的促鐵吸收能力。隨著時(shí)間的延長，鐵離子的透過率和吸收率均升高。如圖2所示，腸消化后的累積鐵離子透過率和吸收率均最高，然而，口腔和胃消化產(chǎn)物的鐵離子透過率和吸收率低于FeSO4·7H2O組，這可能是因?yàn)樵诳谇缓臀赶^程中，由于一些大分子蛋白質(zhì)或肽的不完全消化以及溶液酸堿度的變化，導(dǎo)致鐵離子不容易通過腸黏膜，降低了鐵離子的吸收能力。表觀滲透系數(shù)是表征化合物透過組織黏膜能力的重要指標(biāo)[20]。經(jīng)腸液消化后，鐵離子的表觀滲透系數(shù)顯著高于其他組(P<0.05)。表明阿膠經(jīng)腸液充分消化后能夠螯合更多的鐵，螯合物的形式能夠增強(qiáng)鐵離子的透膜能力，從而促進(jìn)鐵離子在腸道的吸收。許多研究也表明，蛋白水解物螯合亞鐵離子的能力被認(rèn)為是促進(jìn)鐵吸收的關(guān)鍵因素。鐵螯合蛋白水解物是鐵吸收的潛在促進(jìn)劑，因?yàn)殡幕虬被峥梢酝ㄟ^金屬螯合增加金屬的溶解度和生物利用度[21]。阿膠經(jīng)口服后在胃腸道被消化成不同分子質(zhì)量的肽段，一些具有螯合能力的肽與亞鐵離子螯合，從而保持亞鐵離子的溶解性并促進(jìn)鐵的吸收。

a-隨時(shí)間變化的累計(jì)鐵透過率；b-黏膜側(cè)累積鐵吸收量；c-表觀滲透系數(shù)圖2 阿膠不同消化產(chǎn)物的鐵吸收能力Fig.2 Iron absorption capacity of different digested products of Ejiao

2.3 鐵螯合肽的分離純化

如圖3所示，阿膠消化產(chǎn)物被IMAC-Fe2+分成F1和F2兩個組分。組分F1是用pH為5.5的緩沖液A洗脫，在該pH下肽一般具有較高的鐵螯合活性，所以被洗脫下來的為不能螯合或弱螯合能力的肽。組分F2是用pH為8.4的緩沖液B洗脫下來的鐵螯合肽，其鐵螯合能力為(23.58±0.7) μg/mg，較分離前提升了27.15倍。這是因?yàn)殡呐c固定化金屬吸附劑的結(jié)合受溶液酸堿度的影響[22]，洗脫pH接近Fe2+沉淀的pH，隨著pH的升高，更多的OH-競爭結(jié)合Fe2+，鐵螯合肽則易從固定配體上解離下來。

圖3 固定金屬親和層析分離鐵螯合肽的分離圖譜Fig.3 Separation of iron chelating peptides by IMAC-Fe2+

2.4 鐵螯合肽的分子質(zhì)量分布和氨基酸組成

阿膠鐵螯合肽的分子質(zhì)量分布如表2所示，分子質(zhì)量5 000～180 Da的多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為89.21%，其中180～2 000 Da 和180～1 000 Da的多肽分別占70.51%和50.56%，說明分離得到的鐵螯合肽主要是< 5 000 Da的肽段，且集中分布在180～2 000 Da。分子質(zhì)量大小在肽的螯合能力中起關(guān)鍵作用，而且研究表明小肽更容易被人體吸收，具有多種生物活性，低分子質(zhì)量肽的金屬元素螯合能力更強(qiáng)[23]，這也提示分離獲得的阿膠肽是具備較高鐵螯合能力的鐵螯合肽。

表2 鐵螯合肽的分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of iron chelating peptides

肽對金屬離子的螯合能力不僅與肽的分子質(zhì)量有關(guān)，還與肽的氨基酸組成有關(guān)。如表3所示，對鐵螯合肽的氨基酸組成進(jìn)行分析，其中含量最高是甘氨酸(Gly)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(25.14±0.19)%，其次是谷氨酸(Glu)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(13.25±0.13)%。此外，脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)和天冬氨酸(Asp)的含量也較高。研究表明，酸性氨基酸、堿性氨基酸和一些特殊氨基酸對金屬離子有很強(qiáng)的螯合能力[24]。鐵螯合肽中酸性氨基酸和堿性氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(20.08±0.18)%和(14.51±0.09)%。谷氨酸作為一種二羧酸，能夠提供更多的鐵結(jié)合位點(diǎn)，這決定了它具有較強(qiáng)的鐵螯合能力。作為一種堿性氨基酸，精氨酸側(cè)鏈上的氨基和亞胺也可以與亞鐵離子結(jié)合。WU等[17]利用酶水解太平洋鱈魚皮分離純化了3種亞鐵螯合肽，并證實(shí)賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、Asp和Arg是具有亞鐵螯合位點(diǎn)的氨基酸。SUN等[23]發(fā)現(xiàn)親水性氨基酸Asp、Arg含量與鐵螯合活性呈正相關(guān)。因此，鐵螯合肽中亞鐵的螯合活性可歸因于羧基和氨基的增加。

表3 鐵螯合肽的氨基酸組成Table 3 Amino acid compositions of iron chelating peptides

2.5 氨基酸序列鑒定

對質(zhì)譜鑒定結(jié)果采用Denovo氨基酸序列分析法進(jìn)行分析并篩選出相對強(qiáng)度較高的4條肽的氨基酸序列,如表4所示。通過與Uniprot數(shù)據(jù)庫中的驢源蛋白序列進(jìn)行匹配，確定肽段分別來源于膠原蛋白α-1(I)鏈和膠原蛋白α-2(I)鏈。鑒定出的肽序列中富含Gly、Pro、Ala、Glu和Asp，且4條肽的分子質(zhì)量均小于2 000 Da，這與鐵螯合肽的分子質(zhì)量分布和氨基酸組成結(jié)果相符，可以解釋肽的高鐵螯合能力。此外，LEE等[25]的研究證明從豬血中純化的鐵螯合肽的Glu、Asp和Lys殘基與鐵的螯合活性密切相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。本研究分離得到的鐵螯合肽為多種肽段的混合物，后期可對獲得的肽段進(jìn)行化學(xué)合成，分別驗(yàn)證其鐵螯合能力和促鐵吸收能力。

表4 鐵螯合肽的氨基酸序列鑒定Table 4 Amino acid sequences of peptides with high intensity from iron chelating peptides

2.6 肽鐵螯合物的結(jié)構(gòu)表征

2.6.1 熒光光譜分析

熒光光譜的激發(fā)和發(fā)射波長與分子結(jié)構(gòu)和分子軌道能量有關(guān)，有機(jī)配體和金屬離子之間的相互作用可以通過熒光光譜中波長和熒光強(qiáng)度的變化來反映[26]。在335 nm激發(fā)波長下記錄了含有不同濃度Fe2+的鐵螯合肽在365～500 nm的熒光光譜(圖4)。鐵離子的含量會影響內(nèi)源熒光的強(qiáng)度和發(fā)射波長，隨著Fe2+濃度的增加，肽在380和410 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸下降，吸收峰也從384 nm、411 nm移動到380 nm、416 nm。在相關(guān)β-乳球蛋白水解物-鐵復(fù)合物的研究中也出現(xiàn)了類似現(xiàn)象[27]。隨著混合物中Fe2+的增加，熒光強(qiáng)度顯著降低，發(fā)射光譜紅移，肽與Fe2+發(fā)生螯合導(dǎo)致肽的內(nèi)在熒光猝滅，BEYER等[28]的研究也證明，添加金屬離子會使肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊，改變肽的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致熒光殘基較少暴露于溶劑中，熒光強(qiáng)度減弱。這說明，肽與Fe2+確實(shí)發(fā)生了相互作用。

圖4 不同F(xiàn)e2+濃度下鐵螯合肽的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of iron chelating peptides with different concentrations of Fe2+

2.6.2 紅外光譜分析

圖5 鐵螯合肽和肽鐵螯合物的紅外光譜Fig.5 FT-IR of iron chelating peptides and peptide-iron chelates

2.6.3 SEM分析

用SEM觀察肽和肽鐵螯合物的微觀結(jié)構(gòu)，如圖6所示。鐵螯合肽呈現(xiàn)光滑均勻的平面，表面顆粒小且分散，存在一些裂紋，這是因?yàn)槊附夂螽a(chǎn)生了結(jié)構(gòu)均勻、分子質(zhì)量較低的組分，裂紋應(yīng)該是冷凍干燥后留下的。肽鐵螯合物呈現(xiàn)折疊聚集的結(jié)構(gòu)，表面粗糙并形成了一些不均勻的團(tuán)狀顆粒。鐵螯合肽和肽鐵螯合物微觀結(jié)構(gòu)的差異表明，肽與鐵發(fā)生作用破壞了肽的原有結(jié)構(gòu)，肽和鐵離子之間的交聯(lián)形成更大的顆粒，并發(fā)生聚集。

a-阿膠鐵螯合肽；b-阿膠肽鐵螯合物圖6 阿膠鐵螯合肽和阿膠肽鐵螯合物的SEM(×1 000)圖Fig.6 The SEM (×1 000) photograph of iron chelating peptides and peptide-iron chelates of Ejiao

3 結(jié)論

本文采用體外模擬消化和吸收模型，證實(shí)了阿膠經(jīng)胃腸消化后其鐵螯合能力增強(qiáng)，并可促進(jìn)鐵的吸收，通過IMAC分離得到阿膠鐵螯合肽，對其物理性質(zhì)及與鐵螯合后的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。結(jié)果表明，具有鐵螯合能力的肽的分子質(zhì)量主要集中分布在180～2 000 Da，且富含酸性和堿性氨基酸，羧基和氨基為主要螯合位點(diǎn)。初步證明了阿膠在消化過程中能與鐵離子發(fā)生結(jié)合，形成的肽鐵螯合物可有效促進(jìn)鐵的吸收，具備潛在的機(jī)體補(bǔ)血活性，這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探究阿膠的補(bǔ)血活性成分提供了新的思路。