GPSM1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

陳陽,冉雯雯,王璐,宋瑤琳,李廣起,邢曉明

(青島大學(xué),山東 青島 266071 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系；2 附屬醫(yī)院病理科)

結(jié)直腸癌(CRC)是胃腸道常見的惡性腫瘤之一，是全球范圍內(nèi)的第四大惡性腫瘤[1]。CRC起病隱匿，侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，晚期轉(zhuǎn)移是多數(shù)病人死亡的主要原因，但其轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制目前尚不明確[2]。G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白1(GPSM1)為G蛋白信號激活蛋白家族Ⅱ(AGSⅡ)的成員，是1999年由英國科學(xué)家在對酵母進(jìn)行遺傳學(xué)篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，該蛋白由N末端的7個(gè)四肽重復(fù)序列(TPR)和C末端的4個(gè)G蛋白調(diào)節(jié)模體(GPR)組成[3-4]。GPSM1在神經(jīng)組織、睪丸組織中廣泛分布，作為鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑參與G蛋白信號通路的調(diào)節(jié)，以及神經(jīng)元分化和紡錘體形成等多種生物學(xué)進(jìn)程[3-8]。近年來研究顯示，GPSM1在人食管鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌組織中異常表達(dá)并影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡[9-10]。GPSM1也參與CRC細(xì)胞系HT29巨自噬的早期調(diào)控[11]，但GPSM1在CRC中的表達(dá)及作用尚不明確。大鼠肉瘤病毒(RAS)基因突變是癌癥最易發(fā)生的突變之一，約42%的CRC病人伴RAS基因突變[12]。RAS基因?qū)儆谠┗蚣易?，編碼KRAS、NRAS和HRAS，其中KRAS突變率最高(約占85%)[13]。RAS基因突變可使細(xì)胞信號傳導(dǎo)異常激活，持續(xù)傳遞有絲分裂信號，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[14]。美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)第8版癌癥分期系統(tǒng)明確指出，KRAS和NRAS是影響CRC預(yù)后的關(guān)鍵因素[15]。本研究旨在通過檢測GPSM1在CRC組織中的表達(dá)，探討GPSM1表達(dá)與KRAS、NRAS突變及病人臨床病理特征的相關(guān)性，以期為CRC防治提供新的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年4月—2016年4月青島大學(xué)附屬醫(yī)院收治的150例CRC病人的石蠟組織樣本及臨床病理資料，臨床病理資料包括病人性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KRAS和NRAS突變情況等。所有病人均為原發(fā)性CRC，術(shù)前未行放化療和靶向治療。對150例CRC病人定期進(jìn)行電話和門診隨訪，隨訪截止日期為2020年3月。150例病人均有完整的隨訪資料，其中52例病人死亡，9例病人發(fā)生了術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組織芯片制備 由兩名病理醫(yī)師對所有蠟塊進(jìn)行復(fù)片，光學(xué)顯微鏡下選取典型區(qū)域并標(biāo)記，使用Pathology Devices TMAjrTM組織芯片點(diǎn)樣儀制作孔徑為2.0 mm的組織芯片，4 μm切片。

1.2.2GPSM1免疫組織化學(xué)檢測 采用PV-6000法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。組織芯片經(jīng)脫蠟、水化后，使用體積分?jǐn)?shù)0.03的過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，高壓修復(fù)2 min(枸櫞酸鹽pH值6.0)；滴加GPSM1一抗(1∶200，NBP1-91968，NOVUS，美國)，以PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜；滴加通用型二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37 ℃孵育30 min；DAB顯色3 min，使用蘇木精復(fù)染，脫水、封片。

每張切片由兩名資深病理醫(yī)師隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，判讀GPSM1染色結(jié)果。GPSM1陽性染色定位于細(xì)胞漿。根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率進(jìn)行半定量評分。染色強(qiáng)度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞率評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)評分相乘，≥4分為高表達(dá)，<4分為低表達(dá)[16]。

1.2.3KRAS及NRAS基因突變的檢測 使用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(TIANGEN公司，DP331-02，中國)提取150例CRC石蠟組織切片中的DNA，然后應(yīng)用KRAS、NRAS突變檢測試劑盒(上海源奇生物制藥有限公司)檢測其突變情況。使用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific Inc，美國)進(jìn)行擴(kuò)增。KRAS基因突變擴(kuò)增程序?yàn)椋?2 ℃、5 min；94 ℃、3 min；94 ℃、15 s，60 ℃、60 s；共40個(gè)循環(huán)；于60 ℃下采集熒光信號。NRAS基因突變擴(kuò)增程序?yàn)椋?2 ℃、5 min；94 ℃、3 min；94 ℃、45 s，60 ℃、80 s；共40個(gè)循環(huán)；于60 ℃下采集熒光信號。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。GPSM1表達(dá)與KRAS、NRAS突變及臨床病理特征的關(guān)系分析采用Pearsonχ2檢驗(yàn)；GPSM1表達(dá)與病人術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系分析采用Kaplan-Meier生存分析和Log rank檢驗(yàn)，生存曲線的繪制采用GraphPad Prism 7軟件。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GPSM1在CRC組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，GPSM1在CRC組織細(xì)胞漿中呈高表達(dá)，在癌旁組織細(xì)胞漿呈低表達(dá)或不表達(dá)(圖1)。在CRC組織中，108例呈高表達(dá)，42例呈低表達(dá)；在癌旁組織中，21例呈高表達(dá)，129例呈低表達(dá)。GPSM1在CRC組織與癌旁組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=102.938,P<0.001)。

A：GPSM1在癌旁組織中呈陰性表達(dá)；B：GPSM1在CRC組織中呈高表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色。

2.2 KRAS及NRAS基因突變情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，CRC組織KRAS及NRAS突變率分別為44.00%(66/150)和3.33%(5/150)。

2.3 GPSM1表達(dá)水平與CRC病人臨床病理特征的關(guān)系

GPSM1在CRC組織中的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=5.429，P=0.020)以及KRAS突變(χ2=4.030，P=0.045)相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、NRAS突變等均無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 GPSM1表達(dá)與CRC病人臨床病理特征的關(guān)系(例(χ/%)

2.4 GPSM1表達(dá)與CRC病人預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)GPSM1在CRC組織中的表達(dá)水平將CRC病人分為GPSM1高表達(dá)和低表達(dá)組，Kaplan Meier生存分析顯示，GPSM1高表達(dá)組(n=108)CRC病人的無病和總體生存期較GPSM1低表達(dá)組(n=42)明顯縮短(P=0.046、0.036)。見圖2。

A：不同GPSM1表達(dá)水平病人無病生存曲線；B：不同GPSM1表達(dá)水平病人總體生存曲線。

3 討 論

GPSM1是調(diào)節(jié)G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要蛋白之一，生理狀態(tài)下其主要作用是介導(dǎo)G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，參與神經(jīng)元分化以及紡錘體形成[3-5]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，GPSM1在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，包括人食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、前列腺癌等，并且與腫瘤惡性程度及細(xì)胞增殖和侵襲性相關(guān)[9-10,17]。但GPSM1在CRC組織中的表達(dá)及意義尚缺乏相關(guān)研究。本研究通過免疫組織化學(xué)染色檢測顯示，GPSM1在CRC組織中的表達(dá)水平較其在癌旁組織明顯升高，且是CRC病人預(yù)后不良的指標(biāo)，提示GPSM1可能參與了CRC的發(fā)生發(fā)展。

目前研究表明，GPSM1與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。SHI等[9]研究顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中GPSM1的低表達(dá)狀態(tài)與腫瘤的分級呈正相關(guān)，GPSM1高表達(dá)的病人生存時(shí)間更長，GPSM1是食管鱗狀細(xì)胞癌病人獨(dú)立的預(yù)后因素；并且過表達(dá)GPSM1能夠明顯抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖。ZHANG等[17]研究證實(shí)，GPSM1的DNA甲基化可能參與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且與癌癥病人的預(yù)后顯著相關(guān)。ADEKOYA等[10]的研究結(jié)果表明，GPSM1在前列腺癌中表達(dá)水平明顯增高，前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)GPSM1可促進(jìn)體內(nèi)、體外腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究對CRC組織中GPSM1表達(dá)與病人臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CRC組織高表達(dá)GPSM1的病人更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而GPSM1表達(dá)與病人年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度等均無關(guān)。進(jìn)一步分析GPSM1表達(dá)與CRC病人預(yù)后關(guān)系顯示，GPSM1高表達(dá)病人預(yù)后較差，提示GPSM1可能參與了CRC的侵襲轉(zhuǎn)移，是CRC預(yù)后不良的預(yù)測指標(biāo)。

目前，GPSM1在CRC中作用的分子機(jī)制及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未闡明。研究表明，Notch信號通路參與了CRC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程并調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的形成，可促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移以及腫瘤形成[18]。Wnt/β-catenin信號通路在腸隱窩底部激活、結(jié)直腸穩(wěn)態(tài)維持及腫瘤形成過程中均發(fā)揮至關(guān)重要的作用[19]。另外，核因子κB(NF-κB)、表皮生長因子受體(EGFR)、RAS等信號通路在調(diào)控CRC細(xì)胞凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移方面均發(fā)揮重要作用[20-22]。

KRAS突變是常見的致癌性突變，以12、13位密碼子突變最為多見。突變型KRAS能夠擺脫上游信號分子EGFR的調(diào)控，促進(jìn)RAS-RAF-MEF-ERK信號通路的激活，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對機(jī)體的適應(yīng)性，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[23-24]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，KRAS突變與CRC轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，是CRC轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物[25-26]。本研究結(jié)果顯示，CRC組織中GPSM1表達(dá)水平與KRAS突變顯著相關(guān)。表明GPSM1可能與KRAS協(xié)同作用，促進(jìn)CRC的發(fā)生與演進(jìn)，或可作為臨床檢測CRC轉(zhuǎn)移的補(bǔ)充指標(biāo)。KRAS突變可影響下游信號通路傳導(dǎo)，使腫瘤細(xì)胞對西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥，且KRAS與GPSM1均可調(diào)控鳥嘌呤核苷酸的水解與結(jié)合，二者在功能上具有相似性[27-29]。這提示GPSM1可能與KRAS一同在西妥昔單抗的耐藥機(jī)制中發(fā)揮作用，或可成為西妥昔單抗耐藥的潛在指標(biāo)。

綜上所述，GPSM1在CRC中呈高表達(dá)狀態(tài)，與CRC病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及KRAS突變存在相關(guān)性，并與不良預(yù)后相關(guān)，可作為CRC診斷、治療及預(yù)后判斷的潛在指標(biāo)。