卷丹的顯微及組織化學觀察

劉孟奇 王小巧 徐璐 郭濤 陳隨清

摘要：采用冰凍切片法、徒手切片法，利用亮視野顯微鏡、熒光顯微鏡、偏振光和掃描電子顯微鏡，對卷丹進行顯微結構研究;利用熒光和組織化學染色的手段對卷丹進行組織化學研究。結果表明：（1）卷丹鱗葉內表皮和外表皮都由1層緊密排列的長方形細胞構成，外表皮細胞較長，大小為（230±60） μm×（50±10） μm，垂周壁略微彎曲，內表皮細胞大小為（120±30） μm×（70±10） μm，垂周壁微彎曲或淺波狀;內表皮和外表皮都分布有少量氣孔，無副衛(wèi)細胞。（2）卷丹鱗葉有12～16個維管束，導管為螺紋導管。（3）薄壁細胞所含淀粉粒較多，都為單粒，卵圓形和長橢圓形，臍點偏心，層紋清晰可見。（4）熒光顯微及組織化學染色表明，生物堿、多酚類和脂類物質主要分布在內表皮和外表皮細胞中，而多糖和皂苷類物質在內表皮、外表皮以及葉肉細胞中都有分布。卷丹不同部位的表皮、淀粉粒特征較為一致，維管束數(shù)目一定，大小差別較大。組織化學研究結果為百合的加工、評價、鑒定及進一步研究提供了基礎。

關鍵詞：百合;卷丹;顯微;組織化學;鱗葉

中圖分類號：S567.901?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0153-05

收稿日期：2021-04-27

基金項目：第62批中國博士后項目基金（一等）（編號：2017M623342）。

作者簡介：劉孟奇（1971—），男，河南洛陽人，博士，副教授，主要從事中藥資源與鑒定研究。 E-mail：2009liumq@163.com。

通信作者：郭 濤，博士，教授，主要從事中藥資源與中藥新藥開發(fā)研究。E-mail：gt010010@163.com。

2020版《中國藥典》百合項下收載卷丹（Lilium lancifolium Thunb.）、百合（Lilium brownii F. E. Brown var. viridulum Baker）和細葉百合（Lilium tenuifolium DC.）。中藥百合有養(yǎng)陰潤肺、清心安神之功效[1]。中藥百合的主流品種為卷丹和百合，細葉百合僅見于野生。目前，對于中藥百合及其主要混淆品種的顯微研究仍停留在普通光學顯微鏡下對淀粉粒、導管和表皮細胞的簡單描述[2-6]。對于不同生長年限的及其鱗葉不同部位的表皮、淀粉粒和維管束的顯微特征，缺少利用熒光顯微鏡和掃描電鏡進行深入的研究?，F(xiàn)行藥典僅有中藥百合的性狀鑒定和薄層鑒定，而無顯微鑒定特征的描述，缺少指標成分和量化指標[1]。研究表明中藥百合含有皂苷類、酚類、生物堿類、多糖類、磷脂類等活性成分[7-9]。當前有關中藥活性化學成分的研究大多集中于皂苷類和多糖等方面[10]，而對其他成分的了解非常有限，而且百合的組織化學定位研究還沒有展開。因此，本研究以卷丹為對象，擬選取一年生栽培卷丹為研究材料進行顯微和組織化學研究，旨在為中藥百合在鑒定、質量控制和加工等方面的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

卷丹，一年生植物，于2020年9月采集于湖南省邵陽市隆回縣北山鄉(xiāng)北山村（110°5′24.86″E、27°4′46.25″ N，海拔304 m），經河南中醫(yī)藥大學郭濤教授鑒定為卷丹的鱗葉。新鮮材料一部分直接用于制片，一部分用標準固定液（FAA固定液）固定保存。

FAA固定液自制：（甲醛、70%乙醇、乙酸體積比為5 ∶90 ∶5）、改良碘化鉍鉀（Dragendorffs試劑）、固藍B、0.02%的釕紅、耐爾藍、香草醛-冰乙酸-高氯酸。

OlympusBX53正置熒光顯微鏡，由日本奧林巴斯株式會社生產;Quorum K850臨界點干燥儀、Quorum SC7620離子濺射鍍膜儀、Zeiss EVO10鎢燈絲掃描電鏡，均由德國卡爾蔡司公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 性狀鑒別

對采集的新鮮百合鱗莖的外觀進行觀察和描述，用刻度尺測量其直徑，對不同位置不同大小的鱗葉的長、寬和厚度進行測量，精確到1 mm。用放大鏡在光線明亮處觀察干燥的鱗葉，對邊緣及內、外表面和斷面的特征進行觀察。

1.2.2 光學顯微鏡觀察

采用撕表皮的方法，在不同位置（外、中、內層）鱗葉的不同部位（上、中、下）分別撕取外表皮和內表皮，一部分樣品用水合氯醛處理后，用OlympusBX53正置熒光顯微鏡，在亮視野下觀察并照相;一部分在紫外光（UV）下觀察并照相。采用徒手切片法將不同位置鱗葉橫切或縱切，一部分樣品用水合氯醛透化處理后，用OlympusBX53正置熒光顯微鏡，在亮視野下觀察內表皮、外表皮和維管束的顯微特征并照相;另一部分在紫外光下觀察并照相。選取不同位置鱗葉，切成小塊，采用擠壓法擠出淀粉粒，用OlympusBX53正置熒光顯微鏡，分別在亮視野和偏振光下觀察并照相。

1.2.3 掃描電鏡觀察

取不同位置的新鮮卷丹鱗葉，切成小塊后在FAA固定液中固定10 h，乙醇梯度脫水（分別為 50%、70%、85%、90%乙醇各脫水1次，無水乙醇2次，15 min/次），而后用乙酸異戊酯置換乙醇2次（20 min/次），在Quorum K850臨界點干燥儀中干燥，在Quorum SC7620離子濺射鍍膜儀中噴金，用Zeiss EVO10鎢燈絲掃描電鏡觀察拍照內表皮、外表皮和橫切面。

1.2.4 組織化學觀察

取不同位置的新鮮鱗葉，采用徒手切片法將鱗葉橫切，用OlympusBX53正置熒光顯微鏡分別在亮視野和紫外光下觀察并照相。

用徒手切片法對不同位置的新鮮鱗葉橫切制片，或撕取外表皮和內表皮，用組織化學試劑染色：（1）檢測生物堿用改良碘化鉍鉀（Dragendorffs試劑）;（2）檢測酚類用固藍B;（3）檢測多糖用0.02%的釕紅[11];（4）檢測脂類用耐爾藍[12];（5）檢測皂苷類用香草醛-冰乙酸-高氯酸。染色后用OlympusBX53正置熒顯微鏡觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 性狀特征

鱗莖扁球形，直徑4～7 cm，鱗葉白色，呈闊卵形，長2～4 cm，寬1.5～2.5 cm，厚度為1.0～2.5 mm，表面較光滑，表面淡黃白色，有5～8條較為清晰的白色維管束平行排列。頂端稍尖，邊緣平整;質地較脆，易折斷，斷面較平坦;味微苦。

2.2 鱗葉的顯微特征

2.2.1 外表皮、內表皮及葉肉細胞

卷丹不同位置鱗葉的不同位置的外表皮和內表皮特征都由1層排列緊密的長方形細胞構成。外表皮細胞長方形大小為（230±60） μm×（50±10） μm，垂周壁較為平直或略微彎曲（圖1-A），用熒光顯微鏡在紫外光下觀察到橫向的垂周壁熒光微弱，而縱向的垂周壁熒光較為強烈，呈平行排列式樣（圖1-B）。外表皮上稀疏分布有氣孔，氣孔器為近圓形，大小為（48±2） μm×（50±2） μm，氣孔長軸方向與外表皮細胞排列方向一致（圖1-A）。掃描電鏡觀察外表皮的外表面較為平滑，垂周壁略微突出，氣孔與表皮細胞在同一水平（圖1-C）。內表皮細胞也為長方形，大小為（120±30） μm×（70±10） μm，明顯比上表皮細胞短寬，垂周壁微彎或呈淺波狀，內表皮上氣孔少于外表皮，氣孔的大小、方向和形狀與外表皮相似（圖1-D），外表皮和內表皮氣孔的長軸方向與鱗葉的長軸方向一致，氣孔周圍都有4個表皮細胞（圖1-A、圖1-D）。內表皮細胞也為縱行排列，熒光顯微下觀察到垂周壁熒光比上表皮的強烈（圖1-E）。掃描電鏡下觀察到的內表皮有些褶皺（圖1-F）。

卷丹鱗葉橫切制片后觀察到外表皮只有1層細胞，無淀粉粒，無色透明，而葉肉細胞中充滿淀粉粒（圖2-A）。水合氯醛處理后可以清晰看到外表皮細胞的寬度和厚度顯著小于相鄰的葉肉細胞。外表皮細胞外切向壁較厚，有明顯的角質層，外表皮細胞與相鄰的一層葉肉細胞結合緊密（圖2-B）。內表皮細胞也只有1層細胞，細胞的寬度和厚度也顯著小于相鄰的葉肉細胞，橫切觀察到葉肉細胞為等徑形（圖2-C）。從鱗葉的縱切面觀察，葉肉細胞為長方形，呈現(xiàn)整齊的縱行排列，因而容易絲狀剝離出來（圖2-D）。

2.2.2 維管束、淀粉粒

橫切制片后觀察，維管束的導管直徑較小，為外韌維管束（圖2-E），熒光顯微鏡下對鱗葉橫切面進行觀察，可以看到維管束有2層，總數(shù)在12～16條之間變化，維管束的直徑大小不等，相差較大（圖2-F），大的肉眼可見，小的在顯微鏡下才能觀察到?？v切觀察維管束中的導管類型為螺紋導管（圖2-G）。葉肉細胞中淀粉粒都為單粒，大多呈長卵形，臍點可見多為點狀，少數(shù)為短縫狀，層紋可見而不顯著（圖2-H），偏振光下觀察臍點位于狹窄一端的靠近邊緣處，偏光十字較為暗淡（圖2-I）。淀粉粒的大小多數(shù)在（20±5） μm× （40±5） μm，最長可達70μm，其大小變化范圍較大。

2.3 組織化學

對鱗葉橫切制片觀察發(fā)現(xiàn)， 內表皮和外表皮都只有1層細胞，無色透明，外切向壁較厚，外表皮的外切向壁比內表皮的厚些，且明顯可以看到外面的1層角質層（圖3-A），在熒光顯微鏡下有明顯的青色的自發(fā)熒光（圖3-B），而葉肉細胞則無此特征。外表皮和內表皮都很容易剝離，用改良后的碘化鉍鉀試劑染色后，表皮細胞和氣孔的保衛(wèi)細胞中都產生橘紅色沉淀，內表皮中產生的橘紅色沉淀多于外表皮（圖3-C、圖3-D），葉肉細胞中未發(fā)現(xiàn)橘紅色沉淀（圖3-E），表明內表皮的生物堿含量多于外表皮，葉肉組織中不含生物堿。用固藍B染色，內、外表皮細胞甚至氣孔的保衛(wèi)細胞中都產生橘紅色沉淀，表明酚類物質存在，并且內表皮中產生的橘紅色沉淀多于外表皮（圖3-F、圖3-G），在葉肉細胞中未發(fā)現(xiàn)橘紅色沉淀（圖3-H）。用釕紅染色發(fā)現(xiàn)，內表皮和外表皮都顯示紅色（圖3-I、圖3-J），表明內表皮和外表皮細胞內都存在多糖，在葉肉細胞中也存在有淀粉粒以外的多糖（圖3-K）;用尼羅藍染色發(fā)現(xiàn)，外表皮和內表皮細胞都顯示藍色（圖3-L、圖3-M），表明內、外表皮細胞中存在脂類物質，在葉肉細胞中未產生藍色物質（圖3-N）。用香草醛-冰乙酸-高氯酸染色發(fā)現(xiàn)，外表皮和內表皮細胞都顯示紅色（圖3-O、圖3-P），表明其中存在皂苷類物質，在葉肉細胞中也存在皂苷類物質。組織化學觀測結果具體見表1。

3 討論與結論

2020版《中國藥典》[1]僅有關于中藥百合性狀的描述，劉暢宇等對中藥百合各個品種及主要混淆品種的性狀進行了描述，其中提到卷丹“鱗葉長 2.0～3.5 cm，寬1～3 cm，厚1～3 mm”[3]，本研究卷丹鱗葉的大小與劉暢宇等的描述[3]基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)卷丹鱗葉的表面淡黃白色，與劉暢宇等的描述“表面乳白色或淡黃棕色”[3]略有不同。劉暢宇等描述“維管束數(shù)量在3～8條”[3]，本研究對卷丹不同位置的鱗葉進行觀察，用放大鏡能夠清晰看到的維管束數(shù)量在5～8條之間。用熒光顯微鏡對百合斷面觀察可以看到的維管束數(shù)量在 12～16條之間，這是由于部分維管束直徑小，而且被包埋在葉肉細胞中，使用放大鏡難以觀察到。2020版《中國藥典》[1]對中藥百合描述只提到“有數(shù)條縱直平行的白色維管束”，建議對中藥百合各品種維管束數(shù)量進行統(tǒng)計時，選用熒光顯微鏡進行觀察更為精準。所有維管束的類型都為外韌維管束，導管類型為螺紋導管，劉暢宇等所述的網紋導管[3]在本研究中并未發(fā)現(xiàn)。鱗葉的外表皮和內表皮都由1層排列緊密的長方形細胞構成，外表皮和內表皮細胞的長度分別在（230±60） μm和（120±30） μm范圍內，有顯著的區(qū)別，這一顯著區(qū)別需要在中藥百合及易混淆品種的研究中深入展開。寬度上分別在（50±2） μm 和（70±10） μm范圍內，區(qū)別并不顯著。在外表皮和內表皮上都稀疏分布有近圓形的氣孔器，大小相近，周圍一般有4個表皮細胞。鱗葉的葉肉細胞在橫切面上觀察為近圓形，縱切面上觀察為長方形，排列成行。

顯微鏡下觀察結果表明，卷丹不同位置鱗葉的不同部位，外表皮和內表皮顯微大小顯著不同，各自都有一定的尺寸范圍，維管束的類型都為外韌型，數(shù)量都在12～16條之間，且導管類型為螺紋導管，都為單粒淀粉粒、臍點靠近狹窄一端，層紋可見而不清晰，偏振光觀察較為暗淡，這些特征都是比較穩(wěn)定的顯微特征，可以作為顯微鑒定的科學依據(jù)。另一方面，卷丹鱗葉薄壁細胞中均勻分布有大量的淀粉粒，維管束纖細且無機械組織，其顯微特征決定了其飲片具有一些性狀特點：質硬而脆，斷面平坦，角質樣。

卷丹鱗葉的內、外表皮在亮視野下觀察為無色透明，在紫外光下發(fā)出青色的自發(fā)熒光，鱗葉的葉肉細胞則無此特征。組織化學染色表明，生物堿、酚類和脂類物質都分布在外表皮和內表皮中，而多糖和皂苷類在外表皮、內表皮和葉肉細胞中都有分布。卷丹中的活性成分包括多糖、皂苷類、脂類、生物堿和酚類等物質，其中活性成分含量最高的是多糖和皂苷類物質[13-15]，這與本研究所證明的多糖和皂苷類物質在葉肉細胞和表皮細胞中廣泛分布的結論一致。

在卷丹鱗葉的內表皮和外表皮中分布有酚類和生物堿物質，在新鮮的卷丹鱗葉中這些物質以溶解狀態(tài)存在于細胞液中，亮視野下為無色透明，而在紫外光下會產生青色的自發(fā)熒光。酚類是天然化合物中的一大類物質，多具抗氧化能力[16-17]，同時也是構成植物化學防御系統(tǒng)的重要組成部分[18]。新鮮的卷丹鱗葉常為白色，在加工和存放過程中由于酚類物質氧化變色，因此表面為黃白色至淡棕黃色，有的微帶紫色[1]。生物堿在防御微生物感染和抵御食草動物攝食方面有重要的作用[19-20];卷丹味微苦，其苦味來源主要與內表皮和外表皮中分布有少量的生物堿有關。

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