新疆貝母屬8種藥用植物地上部位葉的組織化學(xué)研究

張鵬葛　盛萍　任慧梅等

摘要[目的]研究新疆貝母屬藥用貝母主要藥用成分在葉片中的分布及含量差異。[方法]采用植物解剖學(xué)和組織化學(xué)方法對新疆貝母屬8種藥用貝母葉片中生物堿及皂苷成分的分布進(jìn)行觀察研究。[結(jié)果]生物堿主要存在于新疆貝母屬8種藥用貝母葉片的葉肉細(xì)胞上，其總生物堿含量從高到低的順序?yàn)橐晾缲惸?新疆貝母≈裕民貝母≥托里貝母>黃花貝母≈大白花貝母≈灘貝母>小花貝母；皂苷主要存在于新疆貝母屬8種藥用貝母葉片的葉肉細(xì)胞上，其總皂苷含量從高到低的順序?yàn)榇蟀谆ㄘ惸?托里貝母≈黃花貝母≥新疆貝母>灘貝母≥伊犁貝母>裕民貝母≥小花貝母，且在種間隨著總生物堿含量的增加而總皂苷含量相應(yīng)減小。[結(jié)論]活性成分含量與葉肉細(xì)胞占葉片橫切面的百分比有一定聯(lián)系，在選擇藥用品種時要充分考慮這一因素，同時研究結(jié)果也可為合理采收及擴(kuò)大新藥源提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞貝母屬；葉；生物堿；皂苷；組織化學(xué)

中圖分類號S567；R932文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）07-028-04

貝母是一種常用中藥，具有十分悠久的藥用歷史，百合科（Liliaceae）貝母屬（Fritillaria L.）多種植物的鱗莖是中藥貝母的主要藥材來源，通常具有清熱潤肺、化痰止咳之功效[1]。貝母屬全世界約有130種，主要分布于北溫帶地區(qū)，尤以地中海地區(qū)、亞洲東部至中部和北美洲的種類為多。我國貝母屬植物有61種，50個變種，5變型，其中具藥用價值的植物有20余種，主要分布于四川、新疆、甘肅、湖北、安徽、浙江等省[2-3]?！吨袊幍洹?010年版收載的貝母藥材有川貝母、浙貝母、伊貝母、平貝母及湖北貝母，其中伊貝母包括貝母屬新疆貝母F.walujewii Rege、伊犁貝母F.Pallidiflora Schrenk 2種植物[4]，因其野生品種僅分布在新疆境內(nèi)，故新疆當(dāng)?shù)厝艘渤⑿陆惸窮.walujewii Regel或伊犁貝母F.pallidiflora Schrenk 的干燥鱗莖統(tǒng)稱為新疆貝母。

隨著野生伊貝母藥材資源破壞嚴(yán)重，在新疆民間，同時入藥使用的貝母尚有托里貝母 F.tortifolia、黃花貝母F.verticillata、大白花貝母F.verticillata var.albidoflora、裕民貝母F.yuminensis、灘貝母F.karelinii和小花貝母F.meleagroides 6種分布量較豐富的藥用貝母[5]，幾十年來不僅供應(yīng)本區(qū)，還大量支援兄弟各省區(qū)，以彌補(bǔ)市場緊缺和供需矛盾。除了在同屬植物中尋找擴(kuò)大新藥源外，謝運(yùn)飛等對川貝母地上部位的開發(fā)利用也做了積極地探索，研究表明川貝母的地上部位含有與地下部位相同的有效成分，且含量可觀，這對貝母地上部位變廢為寶及資源的合理開發(fā)利用提供了一條新思路[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，貝母主要活性成分為生物堿類和皂苷類成分[7]，但有關(guān)其活性成分在地上部位葉中的組織化學(xué)分布以及含量差異研究尚未見報道，因此，筆者將通過對新疆貝母屬分布量較豐富的藥用貝母地上葉片中生物堿和皂苷的組織化學(xué)定位研究，探討有效成分在貝母地上葉片中的分布規(guī)律及含量差異，以期為深入開發(fā)新疆貝母屬藥用貝母資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

Mikroskop Primo Star X2005型數(shù)碼顯微鏡， YD-202A輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)。該試驗(yàn)所用新疆貝母屬材料均于2013年5月采自新疆省各產(chǎn)地，生長年限均為3年生，經(jīng)鑒定為百合科植物新疆貝母 Fritillaria walujewii Regel、伊犁貝母F.pallidiflora Schrenk、托里貝母 F.tortifolia X.Z.Duan et X.J.Zheng、黃花貝母F.verticillata Willd.、大白花貝母F.verticillata var.albidoflora、裕民貝母F.yuminensis X.Z.Duan、灘貝母 F.karelinii （Fisch.） Baker.、小花貝母F.meleagroides Patrin ex Schult.的新鮮葉。憑證標(biāo)本存放于新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室。藥材樣品信息如表1所示。

1.2方法

1.2.1

生物堿組織化學(xué)方法。選擇正常植株上的完整成熟葉片，剪取1.5 cm×1.5 cm的小塊，F(xiàn)AA固定，常規(guī)石蠟切片法切片，切片厚度15 μm。以改良碘化鉍鉀試劑對切片染色60 ～150 s[8]（0.85 g堿式硝酸秘溶于10 ml冰醋酸和40 ml蒸餾水后，再與20 ml 40%的碘化鉀溶液混合而成），臨時裝片，在Mikroskop Primo Star X2005型數(shù)碼顯微鏡下觀察并拍照，將新鮮材料用酒石酸酒精預(yù)處理24 h后，用同樣方法處理和觀察的切片為對照組。對新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉中總生物堿的粗略定性量化測定，即各取6張不連續(xù)的切片進(jìn)行比較觀察，每張切片觀察4個視野，根據(jù)生物堿沉淀顆粒的分布密度及大小，劃分為5個等級：+++++級，顆粒的分布密度密、顆粒大；++++級，顆粒的分布密度中等、顆粒大或顆粒的分布密度密、顆粒中等；+++級，顆粒的分布密度中等、顆粒中或顆粒的分布密度密、顆粒小或顆粒的分布密度稀、顆粒大；++級，顆粒的分布密度稀、顆粒中等；+級，顆粒的分布密度稀、顆粒小或無。

1.2.2皂苷組織化學(xué)方法。

選擇正常植株上的完整成熟葉片，剪取1.5 cm×1.5 cm的小塊，F(xiàn)AA固定，常規(guī)石蠟切片法切片，切片厚度15 μm。以等量的5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合試劑對切片染色2 min[9]（1 g香草醛溶于20 ml冰醋酸，再與等量的高氯酸混合而成），臨時裝片，在Mikroskop Primo Star X2005型數(shù)碼顯微鏡下觀察并拍照，將新鮮材料用FAA固定液處理24 d后，用同樣方法處理和觀察的切片為對照組。對新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉中總皂苷的粗略定性量化測定，即各取6張不連續(xù)的切片進(jìn)行比較觀察，每張切片觀察4個視野，根據(jù)總皂苷與皂苷顯色劑反應(yīng)顏色的深淺，劃分為5個等級：+++++級，紫色；++++級，深紅色；+++級，紅色；++級，淡紅色；+級，顏色淺或無。

2結(jié)果與分析

2.1生物堿組織化學(xué)分布情況

對新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片的組織切片進(jìn)行碘化鉍鉀沉淀反應(yīng)后，結(jié)果表明其黃色—深黃色生物堿沉淀主要存在于葉肉細(xì)胞中，韌皮部中的薄壁細(xì)胞也有較少分布，而表皮細(xì)胞上沒有分布（圖1）。其中新疆貝母葉的葉肉細(xì)胞中含有大量的黃色結(jié)晶沉淀，沉淀顆粒中等，分布較密（圖1b1）；伊犁貝母葉的葉肉細(xì)胞中含有大量的深黃色結(jié)晶沉淀，沉淀顆粒大，分布密集（圖1b2）；托里貝母葉的葉肉細(xì)胞中含有大量的深黃色結(jié)晶沉淀，沉淀顆粒大，分布一般（圖1b3）；黃花貝母葉的葉肉細(xì)胞中含有很多的黃色結(jié)晶沉淀，沉淀顆粒較小，分布較疏（圖1b4）；大白花貝母葉的葉肉細(xì)胞中含有很多的深黃色結(jié)晶沉淀，沉淀顆粒一般，分布較疏（圖b5）；裕民貝母葉的葉肉細(xì)胞中含有大量的深黃色結(jié)晶沉淀，沉淀顆粒中等，分布較密（圖1b6）；灘貝母葉的葉肉細(xì)胞中含有很多的深黃色結(jié)晶沉淀，沉淀顆粒一般，分布較疏（圖1b7）；小花貝母葉的葉肉細(xì)胞中含有少量的深黃色結(jié)晶沉淀，沉淀顆粒小，分布疏（圖1b8）。對新疆貝母屬8種藥用貝母地上葉片中生物堿沉淀進(jìn)行量化表明，生物堿沉淀在不同組織結(jié)構(gòu)部位及不同種間存在量上的變化（表2）。

楊楊等對生物堿顯色劑進(jìn)行了比較和確立，發(fā)現(xiàn)碘化鉍鉀試劑處理觀察生物堿較為理想[10]，因此該試驗(yàn)中直接采用碘化鉍鉀試劑作為生物堿顯色劑，生物堿同碘化鉍鉀試劑能生成黃色到深黃色的不定型沉淀（低倍鏡下呈小黑點(diǎn)）。新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片中的生物堿主要分布于葉肉細(xì)胞中，韌皮部中的薄壁細(xì)胞也有較少分布，而表皮細(xì)胞上沒有分布。因此，在選擇入藥品種時，選擇葉肉細(xì)胞占葉片橫切面百分比大的藥材，且在栽培時，可以采取一些增加生物堿含量的栽培措施，從而提高藥材質(zhì)量。從圖1和表2可知，新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片中生物堿含量由高到低的順序?yàn)橐晾缲惸?新疆貝母≈裕民貝母≥托里貝母>黃花貝母≈大白花貝母≈灘貝母>小花貝母。

表2新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片總生物堿的分布及含量比較

組織結(jié)構(gòu)S2S1，S6，S3S4，S5，S7S8

表皮++++

韌皮部中的薄壁細(xì)胞+++++

葉肉細(xì)胞++++++++++++++

注：“+” 表示生物堿的存在及含量，其等級見“1.2.1”中具體描述。

2.2皂苷組織化學(xué)分布情況

對新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片的組織切片進(jìn)行5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合試劑處理后，可觀察到在貝母葉片的葉肉細(xì)胞中按皂苷含量由少至多，呈現(xiàn)出淡紅—紅—深紅—紫的顏色變化，而表皮細(xì)胞及維管束內(nèi)皂苷含量缺乏（圖2）。其中新疆貝母葉的葉肉細(xì)胞中呈現(xiàn)深紅色（圖2b1）；伊犁貝母葉的葉肉細(xì)胞中呈現(xiàn)紅色（圖2b2）；托里貝母葉的葉肉細(xì)胞中呈現(xiàn)深紅色（圖2b3）；黃花貝母葉的葉肉細(xì)胞中呈現(xiàn)深紅色（圖2b4）；大白花貝母葉的葉肉細(xì)胞中呈現(xiàn)紫色（圖2b5）；裕民貝母葉的葉肉細(xì)胞中呈現(xiàn)淡紅色（圖2b6）；灘貝母葉的葉肉細(xì)胞中呈現(xiàn)紅色（圖2b7）；小花貝母葉的葉肉細(xì)胞中呈現(xiàn)淡紅色（圖2b8）。對新疆貝母屬8種藥用貝母地上葉片中皂苷顯色進(jìn)行量化表明，皂苷在不同組織結(jié)構(gòu)部位及不同種間存在量上的變化（表3）。

注：圖中E為表皮；Mt為葉肉組織； SG為淀粉粒；P為生物堿沉淀；Va為維管束。圖a為貝母葉片對照組的橫切面；圖b1～b8為10倍顯微鏡下新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片的橫切面；圖c為40倍顯微鏡下總生物堿組成化學(xué)定位圖。

圖1新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片總生物堿組織化學(xué)定位

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

對新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片總皂苷的組織化學(xué)定位研究表明，供試材料中總皂苷與皂苷顯色劑發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)出淡紅—紅—深紅—紫的顏色變化。葉肉細(xì)胞中皂苷含量比表皮細(xì)胞及維管束中皂苷含量多，因此，在選擇入藥品種時，選擇葉肉細(xì)胞占葉片橫切面百分比較大的藥材。從表3可知，新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片中皂苷含量由高到低的順序?yàn)榇蟀谆ㄘ惸?>托里貝母≈黃花貝母≥新疆貝母>灘貝母≥伊犁貝母>裕民貝母≥小花貝母。

表3新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片總皂苷的分布及含量比較

組織結(jié)構(gòu)S5S3，S4，S1S7，S2S6，S8

表皮++++

維管束++++

葉肉細(xì)胞++++++++++++++

注：“+” 表示皂苷的存在及含量，其等級見“1.2.2”中具體描述。

3討論

在該試驗(yàn)中，新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片中有效成分含量在種間的動態(tài)變化結(jié)果與課題組前期進(jìn)行的新疆貝母屬8種藥用貝母鱗莖的組織化學(xué)研究結(jié)果完全吻合，且可觀察到與伊貝母有效成分含量相近的是裕民貝母和托里貝母，在不同種間中隨著總生物堿含量的增加而總皂苷含量相應(yīng)減小，但總生物堿與總皂苷均為貝母中的活性成分，因此，合理評價貝母屬藥用貝母的品質(zhì)，尚需要進(jìn)一步從多組分比較研究。

注：圖中E為表皮；Mt為葉肉組織； SG為淀粉粒；GI為皂苷；Va為維管束。圖a為貝母葉片對照組的橫切面；圖b1～b8為10倍顯微鏡下新疆貝母屬8種藥用貝母葉片的橫切面。

圖2新疆貝母屬8種藥用貝母地上部位葉片總皂苷組織化學(xué)定位

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