2020 年云南省邊境地區(qū)牛藍舌病血清學(xué)調(diào)查

寇美玲，楊佳萍，謝佳芮，苗海生

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224；2.施甸縣畜牧獸醫(yī)中心，云南施甸 678200）

藍舌病（bluetongue，BT）是由藍舌病病毒（bluetongue virus，BTV）引起的一種通過吸血庫蠓傳播的蟲媒病毒病，牛、羊等反芻動物對其易感，目前尚無有效的治療方法[1]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報動物疫病，我國將其歸為一類動物疫病。該病可以引起感染動物發(fā)熱，鼻腔和胃腸道黏膜卡他性炎癥，以及妊娠母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等，致死率為20%～30%，對養(yǎng)殖業(yè)影響較大[2-3]。目前全球已報道發(fā)現(xiàn)27 種BTV 血清型。我國近年來已分離到13 種血清型BTV 毒株[4-9]。BTV 不同血清型間缺乏有效的交叉免疫保護，因而會產(chǎn)生不同血清型毒株在同一區(qū)域混合流行的情況，這給BT 防控帶來了極大挑戰(zhàn)[10-11]。

云南省位于我國西南邊陲，有多個縣市與老撾、越南和緬甸接壤，是通往東南亞、南亞的關(guān)口，每年有大量牛、羊等家畜通過邊境縣市進入我國境內(nèi)。這些邊境縣市及其相鄰的南亞、東南亞國家基本屬于亞熱帶氣候，年溫差較小，降雨充沛，適于庫蠓等媒介昆蟲的生長繁殖，因而易于BTV 傳播，導(dǎo)致云南省邊境地區(qū)BT 防控形勢較為嚴峻。

本研究利用BTV C-ELISA 抗體試劑盒，對2020 年從云南省邊境12 個縣市采集的3 800 份牛血清樣品進行抗體檢測，以期了解云南省邊境地區(qū)牛群中的BT 流行情況，從而為其防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

牛血清樣品由云南省12 個縣市（瑞麗、芒市、隴川、盈江、景洪、勐臘、勐海、瀾滄、江城、孟連、西盟、富寧）的動物疫病控制機構(gòu)采集，共3 800 份。每個縣市先按采樣點所屬地理位置劃定采樣區(qū)域，再將區(qū)域內(nèi)的養(yǎng)殖場、活畜交易市場和散養(yǎng)戶分別編號，根據(jù)所在地區(qū)的實際養(yǎng)殖場戶數(shù)量，按比例隨機抽取養(yǎng)殖場3～9 個、活畜交易市場個1～2 個、散養(yǎng)戶1～19 個；場戶內(nèi)，同樣根據(jù)存欄量按比例通過頸靜脈隨機采集牛血清樣品。各縣市具體采樣信息見表1。采樣地點選擇熱帶、亞熱帶氣候，年平均降雨量較多，年均日照時間較長，相對濕度大，適于媒介昆蟲庫蠓的生長和繁殖的地區(qū)。

表1 云南省12 個縣市采樣信息統(tǒng)計結(jié)果 單位：個/份

1.2 主要儀器和試劑

Multiskan FC 酶標儀，購自Thermo 公司；脫脂奶粉，購自BD difco 公司；BTV C-ELISA 檢測試劑盒、PBSTM（磷酸鹽緩沖液+Tween 20+脫脂奶粉），為云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室制備；PBS 干粉、Tween 20，均購自云南豐科生物科技有限公司。

1.3 血清抗體檢測

按照BTV C-ELISA 試劑盒說明書進行檢測。取試劑盒提供的ELISA 板，分別取10 μL 被檢血清樣品、陽性對照、弱陽性對照和陰性對照血清加入到相應(yīng)檢測孔和對照孔中，每孔加入50 μL 100倍稀釋的競爭抗體，振蕩器震蕩或輕拍微量反應(yīng)板，將反應(yīng)板中的液體充分混勻，在37 ℃溫箱里溫育30 min；取出板，倒掉孔中的液體，在吸水紙上拍干，每孔加入50 μL 1 000 倍稀釋的羊抗豚鼠HPR 酶標二抗，充分混勻，在37 ℃溫箱里溫育40 min；取出板，洗板5～6 次拍干，加入TMB顯色液50 μL/孔，37 ℃避光溫育10 min；加入終止液50 μL/孔，ELISA 讀板儀450 nm 波長測定樣本和對照的吸光值A(chǔ)450[12]。試劑盒質(zhì)控標準：兩個陽性對照孔A450≤0.2，兩孔間A450差距＜0.05，兩個陰性對照孔1.0 ≤A450＜1.6，兩孔間A450差距＜0.2。判定標準：按照抑制率（PI）=（陰性對照A450平均值-樣品血清A450）/陰性對照A450平均值×100%計算，抑制率≥50%時判為抗體陽性，否則為陰性。

1.4 檢測結(jié)果分析

比較各地BTV 抗體陽性率，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地區(qū)分布

地區(qū)統(tǒng)計結(jié)果（表2）顯示：在12 個縣市均檢測到BTV 抗體陽性血清，共檢出血清陽性2 960份，總樣品抗體陽性率為77.9%（2 960/3 800），推斷牛BTV 感染在云南省邊境地區(qū)普遍存在，感染率較高[11]。各縣市樣品抗體陽性率有所差異，其中隴川縣最高（92.0%），孟連縣最低（48.0%），差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；瑞麗市相較于瀾滄、西盟、孟連等縣市，陽性率較高，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；勐臘縣相較于盈江、富寧、隴川、江城等縣市，陽性率較低，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；孟連縣與其他縣市比較，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。西盟、孟連和勐臘等縣市的采樣場戶中，有部分場戶未檢測到BTV 血清陽性樣品，其余縣市全部檢測到BTV 血清抗體陽性樣品。

表2 云南邊境地區(qū)12 縣市牛BTV 血清抗體檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.2 群間分布

2.2.1 不同來源 不同來源牛統(tǒng)計結(jié)果（表3）顯示：本地牛和入境牛BTV 血清抗體陽性率分別為67.9%和84.8%，差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同來源牛BTV 血清抗體檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.2.2 不同場戶類型 不同場戶類型統(tǒng)計結(jié)果（表4）顯示：養(yǎng)殖場、活畜交易市場和散養(yǎng)戶BTV 血清抗體樣品陽性率分別為78.4%、77.3%和76.8%，養(yǎng)殖場和活畜交易市場的場戶陽性率均為100%，散養(yǎng)戶為89.8%，差異不明顯（P＞0.05）。

表4 不同場戶的BTV 抗體檢測結(jié)果

2.2.3 不同飼養(yǎng)方式 對不同飼養(yǎng)方式的統(tǒng)計結(jié)果（表5）顯示：舍飼的BTV 抗體血清陽性率最高（81.4%），系牧飼養(yǎng)（72.2%）次之，半放牧半舍飼（62.5%）最低；舍飼與半放牧半舍飼飼養(yǎng)方式比較，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但與系牧方式比較，差異不明顯（P＞0.05）；半放牧半舍飼與系牧方式比較，差異不明顯（P＞ 0.05）。未采集放牧牛樣品。

表5 不同飼養(yǎng)方式的BTV 抗體檢測結(jié)果

2.2.4 不同品種 不同品種牛BTV 血清抗體統(tǒng)計結(jié)果（表6）顯示：黃牛和水牛BTV 抗體陽性率分別為80.0%和61.4%，存在顯著差異（P＜0.05）。

表6 不同品種牛的BTV 抗體檢測結(jié)果

3 討論

BT 是通過媒介昆蟲傳播的蟲媒病毒病。1979 年我國在云南省師宗縣首次分離到BTV，隨后湖北（1983）、山西（1993）等地也報道發(fā)現(xiàn)BTV[13]。截至2017 年，我國已有11 個省份的63個市（區(qū)）檢測到BTV 抗體陽性[14-15]。到目前為止，該病無有效治療措施。近年來BTV 新血清型不斷出現(xiàn)，這將會對我國牛羊產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展與畜產(chǎn)品國際貿(mào)易造成極大影響，因此開展BTV 血清學(xué)流行調(diào)查極為重要。

蟲媒病毒病的流行主要取決于媒介昆蟲的活動情況，易受溫度、濕度等因素影響，具有明顯地域性和季節(jié)性。本次調(diào)查的12 個邊境縣市與老撾、越南、緬甸接壤，處于亞熱帶、熱帶地區(qū)，年平均氣溫較高，降雨量較多，適于各類蠓蚊等媒介昆蟲的生長繁殖，易于BTV 傳播，具有地域代表性。此次檢測在12 個邊境縣市均檢測到BTV 抗體陽性血清，且樣品抗體總陽性率達77.9%，場戶陽性率為93.3%，說明云南邊境地區(qū)存在一定的BTV 流行風(fēng)險。12 個縣市BTV 抗體陽性率存在差異，可能與采集血液樣品的時間、樣本數(shù)量及場戶等差異有關(guān)。12 個縣市的采樣場戶中，僅有西盟、孟連和勐臘縣的部分場戶未檢測到BTV血清陽性樣品，其余9 個縣市采樣場戶中全部檢測到BTV 血清抗體陽性樣品，推斷BTV 已在該地區(qū)定殖，因此需要持續(xù)開展BTV 流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，入境牛血清樣品抗體陽性率顯著高于本地牛（P＜0.05），說明境外地區(qū)的BTV 流行可能更為嚴重，對我國本地牛群威脅較大。本次調(diào)查的結(jié)果雖然與2019 年的檢測結(jié)果[11]存在差異，但本次樣品檢測數(shù)量較多，可能更能反映來源地的流行情況。針對境外牛感染較為嚴重的情況，應(yīng)該加強海關(guān)檢疫及運輸檢疫，并在鄰近地帶，避免在媒介昆蟲活躍的時間內(nèi)放牧，加強防蟲、殺蟲措施的實施，減少媒介昆蟲對易感動物的侵襲。本次調(diào)查中，本地牛采樣數(shù)量相對較少，后續(xù)需要加大樣本數(shù)量，進一步驗證本地牛的BTV流行情況。

在散養(yǎng)戶牛血清樣品中檢測到BTV 陽性抗體的戶數(shù)相對較少，這可能與牛的飼養(yǎng)方式有關(guān)，大部分散養(yǎng)戶采取半放牧半舍飼方式。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，舍飼方式下BTV 血清抗體陽性率較高，而半放牧半舍飼方式下BTV 抗體陽性率則較低，可能是由于半放牧半舍飼方式可以保證牛群運動充足，體質(zhì)更為健壯，對病毒抵抗力較強，感染相對較低。

本研究對不同品種牛的BTV 血清進行抗體檢測發(fā)現(xiàn)，黃牛較水牛BTV 抗體陽性率高。由于水牛的樣本量相對較少，僅能反應(yīng)出本次檢測的情況，牛品種與BTV 血清學(xué)陽性情況之間的相關(guān)性需要進一步加大樣本量來驗證。本次采樣根據(jù)所在地區(qū)的實際養(yǎng)殖場戶及場戶的存欄量按比例隨機采集，并未進行科學(xué)的采樣設(shè)計，檢測結(jié)果具有一定的局限性。后續(xù)在進一步開展BTV 流行病學(xué)調(diào)查時，應(yīng)科學(xué)設(shè)計樣本采集的標準。

4 結(jié)論

通過對云南省12 個邊境地區(qū)進行牛BT 血清學(xué)調(diào)查，推斷BT 在云南邊境地區(qū)可能廣泛流行，需要引起動物防疫部門和養(yǎng)殖戶的重視，應(yīng)持續(xù)開展血清學(xué)調(diào)查和監(jiān)測，加強對該病的防控。