1 株圓環(huán)病毒3 型美國毒株全基因組克隆與遺傳演化分析

鄭 晶，郝桂英，謝 禮，安 微，楊 苗，陳瑛琪，張 婧，鄭 巧，陳 溪，陳孝宇，林 華

（1.成都海關(guān)技術(shù)中心，四川省食品安全檢測重點實驗室，四川成都 610041；2.西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615013；3.大連海關(guān)技術(shù)中心，遼寧大連 116014；4.武漢海關(guān)技術(shù)中心，湖北武漢 430010）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）是一種小型、無囊膜、單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA 病毒[1]，屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬[2]，是已知最小的病毒之一。該病毒能在豬和其他動物中引起廣泛疾病[3-4]。目前在已有報道中，根據(jù)抗原性和基因型的不同，其可分為PCV1[5]、PCV2[6]、PCV3[7]和PCV4[8]3 個血清型。PCV3 可引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙以及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。PCV3 感染后，患病母豬受孕率降低，流產(chǎn)率增加，可出現(xiàn)產(chǎn)死胎或木乃伊胎現(xiàn)象；患病仔豬出現(xiàn)多器官系統(tǒng)功能紊亂[9]。2016 年美國首次報道發(fā)現(xiàn)PCV3，隨后波蘭[10]、韓國[11]、中國[12]及意大利[13]等國家也相繼報道。PCV3 在世界范圍內(nèi)迅速擴散，引起了各國高度重視和密切關(guān)注。

PCV3 全基因組長度約2 000 bp，包含11 個可能的開放閱讀框（ORF1—ORF11）。其中有3 個主要的開放閱讀框：ORF1 編碼由297 個氨基酸（aa）組成的復(fù)制酶蛋白Rep，ORF2 編碼由214 個aa 組成的衣殼蛋白Cap，ORF3 編碼由231 個aa 組成的功能未知蛋白質(zhì)[7]。目前，國際上尚無普遍公認(rèn)的PCV3 亞型分類規(guī)則。大部分學(xué)者根據(jù)基因組DNA全長序列差異，將PCV3分為兩個亞型（PCV3a和PCV3b）[14]；也有學(xué)者根據(jù)Cap 蛋白存在的兩個氨基酸突變（A24V 和R27K）不同，將PCV3分為3 個亞型（PCV3a、PCV3b 和PCV3c）[15-16]。根據(jù)現(xiàn)有流行病學(xué)報道，中國[17]、印度[18]、越南[19]、泰國[20]及美國[14]等主要流行PCV3a、PCV3b 兩個亞型，其他國家或地區(qū)對PCV3 不同亞型的流行情況鮮有報道。本研究通過對染病的美國種豬采集組織樣品進行多種病原核酸擴增，確認(rèn)病料組織PCV3 陽性，然后擴增PCV3 全基因組，并將其與GenBank 上不同地區(qū)PCV3 參考毒株全基因組序列進行遺傳進化比對分析，根據(jù)基因組差異進行分型，以期了解該序列與不同地區(qū)PCV3 毒株的遺傳進化關(guān)系，為PCV3 分子流行病學(xué)研究及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 2021 年4 月，四川省某企業(yè)進口美國種豬中發(fā)現(xiàn)疑似染疫豬，臨床表現(xiàn)為進行性消瘦、呼吸困難、皮膚蒼白。對死亡豬采集肺臟、脾臟、淋巴結(jié)及小腸等組織樣品，放置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 MagMAXTMCORE NucleicAcid Purification Kit 核酸提取試劑盒，購自賽默飛世爾科技公司；2×HotStartTaqplus Master Mix（Quick Load）、ddH2O，購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；大腸桿菌DH5α、pMD18-T 載體、DL5 000 DNA Marker、DNA 膠回收試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；氨芐青霉素（ampicillin）、Trans2K DNA Marker、6×loading buffer，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨（tryptone）和酵母提取物（Yeast Extract），購自英國Oxoid公司；氯化鈉、氫氧化鈉、瓊脂糖（agarose），購自西班牙BIOWEST 公司。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 參考GenBank 中收錄的PCV3 美國株（GenBank 登錄號：MK496297.1）全基因組序列，分別設(shè)計合成用于擴增PCV3 全基因組的2 對引物（表1）。引物由擎科生物（成都）科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 樣品處理及RNA/DNA 提取

無菌條件下將采集的病死豬肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織研磨攪碎，按照MagMAXTMCORE NucleicAcid Purification Kit 核酸提取試劑盒說明書，從病料組織中提取基因組。

1.3 病原檢測

按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[21-30]對病死豬組織分別進行豬細(xì)小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬Delta 冠狀病毒（PDCoV）、塞內(nèi)卡病毒（SVV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬勞森氏胞內(nèi)菌（PPE）、豬支原體肺炎（M.HYO）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、PCV2及PCV3檢測。

1.4 PCV3 基因組擴增

以檢出PCV3 陽性的組織DNA 為模板，用已設(shè)計的2 對引物分別進行PCV3 基因組序列擴增。反應(yīng)體系為25.0 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、模板DNA 2.0 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，28 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取5.0 μL 擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

使用DNA 回收試劑盒對與預(yù)期大小相符的2條片段進行膠回收，并分別與pMD18-T 載體4 ℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，取100 μL 均勻涂布至含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～16 h；挑選單個陽性克隆菌落接種于含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，進行菌液PCR 鑒定。

1.5 PCV3 全基因組核苷酸序列比對與遺傳進化分析

使用質(zhì)粒提取試劑盒對陽性克隆菌液提取質(zhì)粒，將酶切（EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ）正確的重組質(zhì)粒送擎科生物（成都）科技有限公司測序；對擴增產(chǎn)物大小約1 200 和1 100 bp 的核苷酸序列進行拼接，獲得PCV3 全基因組序列，并與國內(nèi)外38 個PCV3 參考毒株（表2）通過BLAST 在線進行核苷酸同源性比對；同時，用生物信息學(xué)軟件進行遺傳進化分析，采用Neighbor-Joining（NJ）法（1 000 次重復(fù)bootstrap 分析）生成系統(tǒng)進化樹。

表2 PCV3 參考毒株全基因組序列信息

1.6 PCV3 毒株ORF1、ORF2 核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

用生物信息學(xué)軟件分別將獲得的美國毒株P(guān)CV3 ORF1 和ORF2 基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)外38 個毒株進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原檢測

對病死豬組織分別進行PPV等9種病原檢測，結(jié)果顯示，僅檢出PCV3 陽性。

2.2 PCV3 全基因組擴增

將PCV3 全基因組擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分別在約1 200 和1 100 bp 處出現(xiàn)擴增條帶，其大小與預(yù)期基本相符（圖1）。通過測序拼接后，獲得全長約為2 000 bp 的PCV3 全基因組序列。

2.3 PCV3 毒株全基因組核苷酸序列比對與遺傳進化分析

將獲得的PCV3 美國毒株命名為PCV3_USA2021（Genbank 登錄號：OL799306）。其與國內(nèi)外38 個毒株核苷酸同源性和遺傳進化分析結(jié)果顯示，PCV3_USA2021 全基因組核苷酸序列與38 個參考毒株序列同源性為98.7%～99.8%，其中，PCV3_USA2021 與美國毒株（PCV3-US_SD2016）、巴西毒株（255_18_42）、中國重慶毒株（PCV3_CN_Chongqing-147_2016）、中國吉林毒株（PCV3-China_JL17-42）、中國山東毒株（PCV3_Shandong-03_2016）、中國廣西毒株（PCV3/Guangxi-GL/04）等6 個毒株全基因組序列同源性最高，與俄羅斯毒株（PCV3-RU/SM17）和中國安徽毒株（PCV3/CN/Anhui-14/201611）同源性最低。

遺傳進化關(guān)系分析結(jié)果（圖2）顯示，PCV3_USA2021 毒株與美國毒株（PCV3-US_SD2016）形成一個小的分支，與中國云南毒株（YN1-2017）、中國吉林毒株（PCV3-China_JL17-42）、中國山東毒株（PCV3_Shandong-03_2016）、中國重慶毒株（PCV3_CN_Chongqing-147_2016）、中國江西毒株（PCV3_CN_Jiangxi-62_2016）、中國廣西毒株（PCV3/Guangxi-GL/04）、哥倫比亞毒株（PCV3_COL_Risaralda1_2018）、巴西毒株（255_18_42）、智利毒株（Type 3）、美國毒株（99）、日本毒株（KGS2098-1_2016 DNA）、韓國毒株（PCV3_KU-1605）等均處于一個大分支上，屬于PCV3a亞群。

2.4 PCV3 毒株ORF1 基因核苷酸序列比對及推導(dǎo)氨基酸序列分析

將獲得的美國毒株P(guān)CV3_USA2021 ORF1 基因序列（長度891 bp）與國內(nèi)外38 個毒株進行核苷酸同源性和遺傳進化分析。結(jié)果顯示，PCV3_USA2021 與38 個參考毒株ORF1 基因核苷酸序列同源性為99.1%～99.9%。其中PCV3_USA2021 與美國毒株（PCV3-US_SD2016）、智利毒株（Type 3）、巴西毒株（255_18_42）、西班牙毒株（35）、中國吉林毒株（PCV3-China_JL17-42）、中國山東毒株（PCV3_Shandong-03_2016）、中國山西毒株（PCV3_Pig_CN_ShanXi170709）等7 條毒株ORF1 基因序列同源性最高，與俄羅斯毒株（PCV3-RU/SM17）及墨西哥毒株（PCV3/MEX/GTO/01/2017）同源性最低。

PCV3_USA2021 ORF1 基因序列推導(dǎo)的Rep 蛋白氨基酸序列（長度297 aa）與國內(nèi)外38 個毒株同源性為95.3%～100%。其中，PCV3_USA2021 與美國毒株（PCV3-US_SD2016）、德國毒株（DE7.3）、智利毒株（Type 3）、巴西毒株（255_18_42）、越南毒株（NNH/DN7/2018）、西班牙毒株（35）、中國江西毒株（PCV3_CN_Jiangxi-62_2016）、中國重慶毒株（PCV3_CN_Chongqing-147_2016）、中國湖北毒株（CN/Hubei-618/2016）、中國山西毒 株（PCV3_Pig_CN_ShanXi170709）、中 國 吉林毒株（PCV3-China_JL17-42）、中國山東毒株（PCV3_Shandong-03_2016）、中國廣西毒株（PCV3/Guangxi-GL/04）、中國福建毒株（FJ37）等14 條毒株推導(dǎo)的Rep 蛋白氨基酸序列同源性最高，與中國廣東毒株（PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016）同源性最低。

2.5 PCV3 毒株ORF2 基因核苷酸序列比對及推導(dǎo)氨基酸序列分析

將獲得的美國毒株P(guān)CV3_USA2021 ORF2基因序列（長度645 bp）與國內(nèi)外38 個毒株進行核苷酸同源性和遺傳進化分析。結(jié)果顯示，PCV3_USA2021 與國內(nèi)外38 個毒株ORF2 基因核苷酸序列同源性為98.0%～100%。其中PCV3_USA2021 與美國毒株（PCV3-US_SD2016）ORF2基因同源性最高，與中國安徽毒株（PCV3/CN/Anhui-14/201611）同源性最低。

PCV3_USA2021 ORF2 基因序列推導(dǎo)的Cap蛋白氨基酸序列（長度214 aa）與國內(nèi)外38 個毒株同源性為97.7%～100%。其中，PCV3_USA2021與美國毒株（PCV3-US_SD2016、99 和2164）、塞爾維亞毒株（NIVS）、西班牙毒株（35）、巴西毒株（255_18_42）、哥倫比亞毒株（PCV3_COL_Risaralda1_2018）、匈牙利毒株（PCV3/HU/Szerencs/2017）、韓國毒株（PCV3_KU-1605）、墨西哥毒株（PCV3/MEX/GTO/01/2017）、意大利毒株（PCV3-IT_CO2017）、日本毒株（KGS2098-1_2016 DNA）、智利毒株（Type 3）、中國山西毒株（PCV3_Pig_CN_ShanXi170709）、中國廣東毒株（PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016）、中國福建毒株（FJ37）、中國南京毒株（PCV3 CN Nanjing 2017）、中國重慶毒株（PCV3_CN_Chongqing-147_2016）、中國江西毒株（PCV3_CN_Jiangxi-62_2016）、中國廣西毒株（PCV3/Guangxi-GL/04）、中國吉林毒株（PCV3-China_JL17-42）等21 條毒株推導(dǎo)的氨基酸序列同源性最高，與俄羅斯毒株（PCV3-RU/SM17）同源性最低。

采用生物信息學(xué)軟件對所得的美國毒株P(guān)CV3_USA2021 與國內(nèi)外38 個毒株Cap 蛋白進行氨基酸位點突變分析。結(jié)果（表3）顯示，39 條氨基酸序列之間存在16 個突變位點，分別位于5、7、24、27、56、75、77、88、104、124、132、139、150、156、169、211 aa 位置，而本次擴增毒株P(guān)CV3_USA2021 以上位點沒有突變。

表3 PCV3 Cap 蛋白氨基酸突變位點比對分析

3 討論

本研究通過采集死亡的進口美國種豬組織，設(shè)計引物擴增、拼接后，獲取1 條全基因組長度約為2 000 bp 的PCV3 全基因序列，將對應(yīng)毒株命名為PCV3_USA2021。然后將其與GenBank 收錄的38 個國內(nèi)外不同地區(qū)PCV3 參考毒株進行全基因組序列、ORF1 和ORF2 序列比對。分析結(jié)果顯示，該毒株全基因組序列與參考毒株全基因組具有較高的同源性（98.7%～99.8%），表明不同地區(qū)PCV3 的分布沒有明顯的地域性，PCV3 基因遺傳進化特性相對穩(wěn)定。同時，獲得的PCV3 毒株全基因組序列與國內(nèi)外38 條PCV3 毒株之間的ORF1 及ORF2 的同源性（分別為99.1%～99.9%和98.0%～100%）均高于全基因組序列之間的同源性，且ORF2 基因推導(dǎo)的Cap 蛋白氨基酸之間同源性為97.7%～100%，其中與21 條毒株Cap 蛋白氨基酸序列完全一致。分析結(jié)果表明，PCV3 進化相對比較保守。其中，毒株P(guān)CV3_USA2021 與美國毒株（PCV3-US_SD2016）同源性最高（99.8%），且通過構(gòu)建進化樹分析發(fā)現(xiàn)，該毒株與美國毒株（PCV3-US_SD2016）親緣關(guān)系最近。

根據(jù)全基因組序列比對獲得的進化樹分析結(jié)果，推定毒株P(guān)CV3_USA2021 為PCV3a 亞型。2016—2018 年美國中西部地區(qū)PCV3 流行情況研究報道[14]顯示，PCV3a 和PCV3b 兩種亞型在美國中西部廣泛流行。本研究獲取的毒株來自美國中西部地區(qū)（內(nèi)布拉斯加州）進口種豬，與該報道的PCV3a 亞型在美國中西部流行情況一致。

PCV3 Cap 蛋白為主要結(jié)構(gòu)蛋白，可誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。Cap 蛋白氨基酸位點24 位于PCV3 抗體識別表位[19]。Cap 蛋白序列氨基酸位點比對結(jié)果顯示，PCV3a 和PCV3b ORF2基因編碼蛋白的氨基酸位點分別為纈氨酸（V）和丙氨酸（A），說明不同亞種PCV3 毒株可能在抗原性方面存在差異，需進一步研究。因此在種豬引種時，除做好病原檢測外，還應(yīng)結(jié)合產(chǎn)地疫病流行情況，選擇針對流行毒株的疫苗，提高疫苗免疫保護率，減少經(jīng)濟損失。