雞傳染性支氣管炎診斷技術(shù)研究進(jìn)展

張先東，蔣郁明，費奕強，薛曉陽，侯月娥

（1.珠海科藝普檢測科技有限公司，廣東珠海 519000；2.珠海市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東珠海 519000）

雞傳染性支氣管炎（avian infectious bronchitis，IB）是目前影響家禽養(yǎng)殖的重要疾病之一，能造成雞死亡，蛋雞產(chǎn)蛋量下降，肉雞飼料轉(zhuǎn)化率降低，具有極強的傳染性，為我國二類動物疫病。IB 是由冠狀病毒科γ 冠狀病毒屬傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的，以呼吸道、生殖道以及腎臟發(fā)生病變?yōu)橹鞯募毙愿叨冉佑|性傳染病。IBV 除了能感染不同日齡的雞外，也能感染火雞、鴨、孔雀、鴿子、鵪鶉等[1]。20 世紀(jì)80 年代以來，IB 已經(jīng)在我國廣泛流行，特別是在雞養(yǎng)殖密集型地區(qū)，且流行的病毒基因型呈現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性。本文綜述了IB 的流行病學(xué)、臨床癥狀和剖檢特征，以及近年來在診斷技術(shù)方面的研究進(jìn)展，以期為IB 的診斷提供一定的參考。

1 流行病學(xué)

IBV 自1931 年被首次報道至今，已經(jīng)在全球流行傳播。對全球176 個國家的禽病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，IBV 造成的禽類死亡數(shù)僅次于高致病性禽流感[2]。IBV 主要通過空氣傳播，也可通過接觸病禽及其排泄物以及受污染的物品傳播流行[3]。當(dāng)外界環(huán)境溫度較低時，圈舍較封閉，空氣流通慢，此時易造成IBV 大范圍傳播。因此，每年10 月到次年4 月是IB 的高發(fā)期[4]。

IBV 復(fù)制所需的RNA 聚合酶無校對功能，因而在其復(fù)制過程中容易發(fā)生基因突變、缺失、重組或外源基因插入，導(dǎo)致IBV 不斷變異并出現(xiàn)了眾多的基因型和血清型。目前我國流行的主要毒株為QX（GI-19）、4/91（GI-13）、TW（GI-7）、MASS（GI-1），其中QX 是優(yōu)勢毒株[5-6]。我國的IBV 流行具有明顯的地域性特征，主要流行于禽類養(yǎng)殖較為密集的中東部和南方地區(qū)。流行病學(xué)調(diào)查[6-8]發(fā)現(xiàn)，我國南方和華中地區(qū)商品雞養(yǎng)殖場普遍存在多個基因型IBV 毒株，包括重組毒株，其中QX、TW、4/91 是最常見的基因型，而TW 流行呈上升趨勢。

2 臨床癥狀及剖檢特征

所有日齡的雞均能感染IBV，潛伏期一般為18～36 h，其中30 日齡以內(nèi)的雞發(fā)病率高，隨著日齡的增加發(fā)病率隨之降低。IBV 還會誘發(fā)其他疾病進(jìn)而導(dǎo)致死亡率增加[9]。感染IBV 的病雞表現(xiàn)為精神萎靡、流淚、羽毛蓬亂、采食量減少、大量飲水、腹瀉，根據(jù)癥狀的差異，被分為腎型、呼吸道型、生殖型。該病主要影響呼吸道和生殖系統(tǒng)。近年來，我國腎型病例發(fā)病率有所上升，且病毒毒力和傳播能力更強[4]。

呼吸型主要表現(xiàn)為呼吸道炎癥，包括氣管啰音、流鼻涕、咳嗽、喘息、打噴嚏，剖檢見氣管黏膜和支氣管黏膜充血并伴有大量的黏液和氣泡；生殖型主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量下降、蛋品質(zhì)下降（畸形、軟殼、蛋黃水狀），剖檢見輸卵管損傷、腹腔內(nèi)卵黃液聚集；腎型剖檢常見腎臟蒼白腫大、腎炎、尿酸沉積、壞死[7，10-11]。此外，法氏囊、哈德氏腺、肺臟、脾臟、腺胃、腸道、睪丸也是IBV復(fù)制的場所，因此會表現(xiàn)出不同程度的病變，如法氏囊腫大、脾臟充血、腺胃出血性潰瘍、附睪結(jié)石等，往往表現(xiàn)出復(fù)雜的混合癥狀[9，12]。IB 的臨床癥狀與禽流感（avian influenza，AI）、新城疫（Newcastle disease，ND）、傳染性喉氣管炎（infectious laryngotracheitis，ILT）的癥狀有一定的相似性，因此需借助實驗室手段進(jìn)行確診。

3 診斷方法

3.1 病毒分離鑒定

病毒分離是診斷IB 的重要手段。由于支氣管是IBV 感染的主要部位，且1 周內(nèi)會達(dá)到病毒滴度的峰值，因此對疑似患病雞要及時采集氣管拭子或新鮮氣管組織進(jìn)行病毒分離。腎臟、腺胃、輸卵管、泄殖腔、盲腸扁桃體也是重要的采樣部位[1，13]。雞胚接種是分離IBV 的首選方法，其缺點是只有連續(xù)傳3 代以上才會出現(xiàn)特征性病變——胚胎卷曲和萎縮，但這并不能作為確診的依據(jù)，還需進(jìn)一步依靠血清學(xué)方法或分子生物學(xué)方法確診。盡管雞胚腎成纖維細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞和Vero 細(xì)胞已經(jīng)被應(yīng)用于分離IBV，但是并不是所有的IBV 毒株都能通過細(xì)胞培養(yǎng)被分離[11]。器官培養(yǎng)也是一種重要的分離手段，氣管環(huán)樣品是優(yōu)先選擇。隨著IBV的復(fù)制，纖毛運動逐漸減弱，因此顯微鏡下觀察到纖毛運動停止是判定IBV 為陽性的重要依據(jù)，但是也可能會出現(xiàn)假陰性[14]。病毒分離耗時且對操作環(huán)境有一定的要求，因此該方法并不適用于常規(guī)診斷，主要用于減毒疫苗研發(fā)、測序前病毒濃度提高、致病力測試、疫苗保護(hù)力研究等[13]。

3.2 血清學(xué)診斷

3.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） ELISA 是目前應(yīng)用最廣泛的IBV 抗體血清學(xué)檢測方法，常用完整的IBV 病毒粒子和重組蛋白作為抗原。哈爾濱獸醫(yī)研究所已經(jīng)開發(fā)出檢測結(jié)果可靠、成本低的ELISA 抗體檢測試劑盒，能在短時間內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模篩查[15]。一般建議在疑似感染時和1 周后各檢測1 次。ELISA 檢測成本低、簡便易操作，能應(yīng)用于早期和長期感染時的抗體檢測[16]。苗立中等[17]依靠截短表達(dá)的S1 蛋白開發(fā)的間接ELISA抗體檢測方法，可應(yīng)用于IBV 免疫抗體檢測和感染快速診斷。將基于IBV S 蛋白保守序列的合成肽與ELISA 結(jié)合，能特異性檢測不同基因型的IBV抗體[18]。Finger 等[19]將ELISA 與蛋白質(zhì)印跡法（western blot，WB）相結(jié)合檢測IBV N 蛋白抗體，發(fā)現(xiàn)該方法的敏感性和特異性均大于90%，還能檢測到商品試劑盒檢測不到的抗體，將ELISA 與WB 結(jié)合起來能有效提高診斷的靈敏度，降低假陰性出現(xiàn)的概率。

3.2.2 血凝抑制試驗（heamagglutination inhibition test，HI） IBV 無血凝素，不能凝集動物紅細(xì)胞，因此需要進(jìn)行特殊處理使其具有血凝活性。Hussian 等[20]對比胰蛋白酶、神經(jīng)氨酸酶、磷脂酶C 處理制備的抗原，發(fā)現(xiàn)經(jīng)磷脂酶C 處理制備的抗原更適合用于HI 快速診斷IBV。莊金秋等[21]將雞胚培養(yǎng)增殖的IBV M41 株尿囊液上清，經(jīng)聚乙二醇處理后與魏氏梭菌（含α 毒素）按一定比例混合處理后制成HI 抗原，發(fā)現(xiàn)該抗原效價好、穩(wěn)定性可靠，可以應(yīng)用于雞群IBV 疫苗免疫后血清抗體及卵黃抗體的檢測。HI 成本低、所需設(shè)備簡單、耗時較短，不僅能應(yīng)用于大規(guī)模雞群的IBV 篩查，還能用于疫苗免疫后抗體效果評價。

3.2.3 病毒中和試驗（virus neutralization test，VNT） VNT 具有高度的特異性，能夠區(qū)分基因型和測定血清中抗體效價，因此常被應(yīng)用于IBV的變異鑒定以及疫苗免疫效果評價。常用的操作方法有兩種：用已知濃度血清與不同稀釋度病毒反應(yīng)（α 法）和用已知病毒量與不同稀釋度血清反應(yīng)（β 法），其中α 法更準(zhǔn)確可靠[22]。Zhou 等[23]從H120 和4/91 免疫雞群中分離出一株IBV 毒株（CK/CH/2010/JT-1），利用VNT 發(fā)現(xiàn)兩種疫苗不能形成有效保護(hù)，經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)這是一種新的基因型。VNT 比HI 更靈敏，但是耗時且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，建議選用更成熟的ELISA。

3.3 免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）

IHC 是基于抗原抗體反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)記物的性質(zhì)差異進(jìn)行檢測的技術(shù)。應(yīng)用于IBV 檢測的主要分為兩種：免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)和免疫酶組織化學(xué)技術(shù)。這兩種是從組織（細(xì)胞）樣品中檢測IBV抗原的重要方法[11]。親和素-生物素復(fù)合物（ABC），已被成功用于組織樣本中定位IBV 抗原。IHC 可以在IBV 感染的各個階段觀察到組織的病理變化情況，但是不能有效區(qū)分血清型和毒株[24]。通過IHC 對兩株IBV 毒株進(jìn)行致病力研究，發(fā)現(xiàn)IBV S 蛋白首先在氣囊內(nèi)側(cè)纖毛細(xì)胞中被檢測到[25]。Abdel-moneim 等[26]應(yīng) 用IHC 在接種IBV M41 的雞胚多個組織中檢測到IBV 抗原，說明IBV 具有廣泛的組織嗜性。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，IHC 更多的應(yīng)用于IBV 的組織病理學(xué)研究，而較少應(yīng)用于IBV 現(xiàn)場診斷和篩查。

3.4 分子生物學(xué)診斷

3.4.1 反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） RT-PCR 是分子生物學(xué)常規(guī)的檢測方法，通過快速擴(kuò)增目的片段，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳實現(xiàn)對病毒的快速診斷。Fellahi 等[27]建立了一種SYBR green I RT-PCR 檢測IBV 的方法，與常規(guī)RT-PCR 相比具有較高的特異性，且靈敏度高10 倍，適用于IBV 的常規(guī)檢測。Xiu 等[28]建立了能檢測包括IBV 在內(nèi)的目前已知的14 種冠狀病毒的半巢式RT-PCR，檢測限為4×（100～102）copies/μL，與測序結(jié)果相比具有良好的一致性，但是操作復(fù)雜，不適用于大規(guī)模篩查。該方法在擴(kuò)增后還需進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，操作繁瑣、耗時長，因此大規(guī)模篩查時建議使用易操作省時的多重PCR 或常規(guī)RT-PCR。

3.4.2 多重PCR（multiplex polymerase chain reaction）多重PCR 是通過在一個反應(yīng)體系中加入兩對以上引物，實現(xiàn)對多個病原檢測的方法。高文倩等[29]將免疫磁珠富集應(yīng)用于IBV 檢測，建立了檢測IBV強毒株與弱毒疫苗株的多重PCR，經(jīng)富集后的方法靈敏度提高了100 倍，特異性良好，在臨床上有較高的應(yīng)用價值。Laamiri 等[30]建立了能同時檢測AIV、IBV、NDV 和ILTV 的多重實時RTPCR，檢測結(jié)果與獨立檢測結(jié)果一致。該方法能同時檢測4 種病原，并且具有耗時短、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點，適用于禽類養(yǎng)殖場常規(guī)疫病篩查。Cong等[31]首次結(jié)合x-TAG 磁珠開發(fā)了鑒別AIV、NDV、IBV 和ILTV的多重PCR，檢測限為6.75×102～3.52×103copies/μL，具有通量高、耗時短、靈敏度高的優(yōu)點。多重PCR 更適用于在疑似混合感染群體中進(jìn)行篩查，能有效降低篩查成本。

3.4.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP 針對靶基因的6 個區(qū)域設(shè)計多條特異性引物，能在恒溫條件下實現(xiàn)對目的基因的快速擴(kuò)增。該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒檢測。由于IBV-S2 基因高度保守，因此Chandrasekar 等[32]以IBV-S2 基因建立了RTLAMP。該方法僅需在60 ℃條件運行45 min 即可完成檢測，且敏感度比RT-PCR 高100 倍；將產(chǎn)物使用碘化丙啶染色即可用肉眼判斷結(jié)果，陽性為粉紅色，陰性為橙紅色。該方法靈敏度高、耗時短，可作為基層實驗室診斷IBV 的方法。El-tholoth 等[33]建立了在封閉條件下反應(yīng)的半定量RT-LAMP，消除了檢測過程中的污染問題，檢測限為1 EID50/mL，能應(yīng)用于臨床樣品的IBV 篩查。普通LAMP 對染料要求較高，而且操作過程出現(xiàn)污染、引物較多使設(shè)計復(fù)雜、引物之間雜交等因素都可能造成假陽性。

3.4.4 實時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） RT-qPCR是一種結(jié)合熒光基團(tuán)實現(xiàn)實時定量的PCR 方法。王楷宬等[34]基于IBV 核衣殼蛋白基因建立的RTqPCR 的靈敏度可達(dá)到10-4ng/μL，與國家標(biāo)準(zhǔn)方法具有同等的可靠性。金娟等[35]針對IBV-S1 基因設(shè)計引物和探針，將拷貝數(shù)與EID50聯(lián)系起來，實現(xiàn)對QX 型IBV 的準(zhǔn)確定量。廖凱[36]設(shè)計了兩套特異性引物和探針，建立了針對TW Ⅰ型的RTqPCR。該方法對101～109copies/μL 范圍內(nèi)的底物能取得優(yōu)良的檢測效果，且與其他IBV 血清型無交叉反應(yīng)。Karimi[37]等利用RT-qPCR 結(jié)合4 種不同的酶擴(kuò)增S1 基因部分片段，建立了同時檢測Mass、793/B、QX 和 IS-14194 的PCR-RFLP 方法。該方法具有與測序相同的特異性，能作為一種簡單、快速的方法應(yīng)用于IBV 分型。由于RT-qPCR 靈敏度極高，每一個步驟都有可能因為操作不規(guī)范造成樣品污染或環(huán)境污染（特別是當(dāng)樣品中存在強陽性時），因此對操作人員及處理環(huán)境有著較高要求。

3.4.5 重組聚合酶等溫擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA） RPA 技術(shù)是一種依賴DNA 聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白的恒溫高效快速擴(kuò)增技術(shù)。El-tholoth 等[38]將RT-RPA 與核酸層析（nucleic acid lateral flow，NALF）結(jié)合，建立了同時檢測NDV 和IBV 的RT-RPA-NALF 法。該方法在38 ℃僅需40 min 就可以檢出兩種病毒，并且依靠肉眼就可判斷結(jié)果，檢測限為10 copies/μL。且該方法經(jīng)過改進(jìn)后或許可以區(qū)分疫苗株和野毒株，與RT-qPCR 相比，對條件要求更低且耗時更短，適用于現(xiàn)場快速篩查。Wang 等[39]將RT-RPA 與橫向流動試紙條（lateral flow dipstick，LFD）結(jié)合，建立了檢測IBV 的RT-RPA-LFD。該方法擴(kuò)增目的基因僅需24 min，并通過LFD 可以在3 min 內(nèi)肉眼觀察得到結(jié)果，檢測限為102copies/μL，靈敏度為104copies/μL。RPA 特異性好，對試驗條件要求不高，且靈敏度高、耗時短，適用于養(yǎng)殖場IBV大規(guī)模篩查。

3.5 蛋白芯片技術(shù)

蛋白芯片技術(shù)針對蛋白質(zhì)而開發(fā)，主要包括蛋白質(zhì)微陣列、微孔板蛋白質(zhì)芯片、三維凝膠塊芯片。Li 等[40]建立了一種同時檢測AIV、NDV 和IBV 抗體的三重蛋白芯片技術(shù)。與商品試劑盒相比，該方法的敏感性、特異性、準(zhǔn)確度均大于99%，能應(yīng)用于現(xiàn)場快速篩查，但是該方法不能區(qū)別自然感染和疫苗接種抗體，因此篩查前要調(diào)查疫苗接種史。Yan 等[41]結(jié)合改性聚二甲基硅氧烷（iPDMS）開發(fā)了兩種間接微陣列芯片技術(shù)：化學(xué)發(fā)光免疫分析試驗和快速診斷試驗。除判定方法不同外，反應(yīng)過程與ELISA 類似，與商品試劑盒相比，敏感性和特異性均大于90%，其中快速診斷試驗?zāi)芡ㄟ^肉眼判定且能在15 min 得到結(jié)果。但是基于蛋白芯片技術(shù)研發(fā)的產(chǎn)品在靈敏度和特異性上與RTqPCR、RPA 等仍存在一定差距，仍需進(jìn)一步優(yōu)化升級。

3.6 其他診斷技術(shù)

除了上述應(yīng)用較多的診斷方法，近年來還有Liu 等[42]以IBV N 蛋白和S 蛋白單克隆抗體為示蹤劑和捕獲抗體，建立了能快速、簡便檢測IBV 的免疫層析試紙條，能在10 min 內(nèi)完成檢測。該方法與RT-PCR 檢測結(jié)果具有一致性，結(jié)合使用單克隆抗體和膠體金單抗示蹤劑是鑒別各種IBV 基因型的理想選擇。Banakar 等[43]依靠數(shù)據(jù)挖掘方法和Dempster-Shafer 理論建立了一種禽病診斷裝置，利用快速傅立葉變換（fast fourier transform，F(xiàn)FT）和離散小波變換（discrete wavelet transform，DWT）對雞聲信號進(jìn)行處理，通過聲音數(shù)據(jù)分析，能夠快速診斷出NDV、IBV和AIV。該裝置的研發(fā)為禽病診斷提供了一種新的思路，但其實用性仍需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)語

IB 診斷方法主要有病毒分離、血清學(xué)診斷、免疫組織化學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)診斷、蛋白芯片技術(shù)。病毒分離耗時長且對操作有一定的要求，因此近年來將病毒分離與基因測序分析相結(jié)合已經(jīng)成為診斷IBV 及鑒別其基因型的重要手段。在常規(guī)血清學(xué)方法中，ELISA 和HI 是推薦用于雞群大規(guī)模篩查及免疫效果評價的方法，已經(jīng)有商品化的ELISA 試劑盒。IHC 已經(jīng)較少應(yīng)用于IBV 的診斷及篩查。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR 技術(shù)因其更高的準(zhǔn)確性，且能實現(xiàn)實時定量分析，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于實驗室檢測；RPA 技術(shù)作為有著極大發(fā)展?jié)摿Φ男录夹g(shù)，將其與NALF或LFD相結(jié)合，不僅耗時短，對條件要求低，而且能肉眼判斷結(jié)果。另外，蛋白芯片技術(shù)、免疫層析試紙條、雞聲信號分析裝置也為IB 診斷提供了全新的思路。