釀酒酵母TPS2基因敲除菌的構建及其對細胞抗逆性的影響

焦宏亮，王夢飛，朱 紅，張婷婷，周 華，蔡 恒

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800)

海藻糖是一種由兩個葡萄糖分子以1，1-糖苷鍵所構成的非還原性二糖，因其糖苷鍵的結合方式不同而形成3種異構體，即海藻糖(α，α)、異海藻糖(β，β)和新海藻糖(α，β)[1-2]。其中，α，α-海藻糖廣泛存在于藻類、細菌、昆蟲、無脊椎動物及酵母等多種生物體內(nèi)，但不存在于哺乳動物中。海藻糖不含還原端羥基，是一種不能參與糖基化反應的穩(wěn)定分子[3-4]。在惡劣環(huán)境下，海藻糖能夠在細胞表面形成獨特的保護膜，從而有效地保護蛋白不因變性而失活，對生物體具有保護作用[5-6]。此外，海藻糖還具有分子伴侶特性，可防止蛋白質(zhì)錯誤折疊或聚集，并通過促進自噬，有助于去除聚集的蛋白質(zhì)，在治療神經(jīng)性疾病方面也有著一定的作用[7-9]。在胞外添加的雷帕霉素和海藻糖可以治療小鼠的帕金森病(PD)模型的自噬激活和行為缺陷，這成了治療PD的一種潛在方向[10]。胞外添加α-突觸核蛋白(α-syn)聚集體則主要損害溶酶體活性，會導致受體細胞內(nèi)的α-syn積累，而海藻糖作為一種重要的自噬誘導劑，能阻止溶酶體活性的改變并減少胞內(nèi)的α-syn積累[11]。

海藻糖在釀酒酵母中是通過兩步途徑合成。第一步，在海藻糖-6-磷酸合成酶(由TPS1基因編碼)作用下，由尿苷-5-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)和葡萄糖-6-磷酸形成海藻糖-6-磷酸；第二步，海藻糖-6-磷酸在海藻糖-6-磷酸磷酸酶(由TPS2基因編碼)的去磷酸化作用下形成海藻糖[12]。TPS1除了能編碼合成海藻糖之外，還具有調(diào)節(jié)糖代謝的功能；酵母TPS1Δ突變株在葡萄糖存在的情況下引起生長缺陷[13-14]。迄今為止，大多數(shù)的高等植物基因組中都含有TPS基因家族，海藻糖在高等植物中有著重要的調(diào)節(jié)作用[15-16]。Tps1作為TPS復合物的關鍵亞基，未磷酸化的Tps3(海藻糖6-磷酸合酶/磷酸酶的調(diào)節(jié)亞基)可能作為Tps2的激活劑發(fā)揮作用，恢復海藻糖的合成[17]。Tps2和Pfk2(6-磷酸果糖激酶β亞基)的合成是釀酒酵母正常生長和熱脅迫調(diào)節(jié)所必需的[18]。另外，TPS2基因的缺失對Tps1的活性無影響，但會導致海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性完全喪失，并且在熱應激時會積累過量的海藻糖-6-磷酸[19]。海藻糖并不能完全恢復因TPS1Δ或TPS2Δ突變菌所引起的生長缺陷[20]。然而有研究人員認為釀酒酵母對各種外界脅迫條件(氧化、滲透壓、溫度等)的耐受性依賴于海藻糖代謝途徑而非海藻糖自己本身[21-22]。雖然海藻糖作為一種滲透性保護劑，與其在體內(nèi)抗逆作用的相關性仍不完全明晰，但是TPS2基因的研究有助于解析細胞抗逆性系統(tǒng)的影響，為海藻糖用于治療相關疾病奠定理論基礎[23]。

酵母細胞與人體細胞有著類似的衰老代謝機制，因其具有多種優(yōu)勢；已作為真核生物模式菌被應用多年[24-25]。1996年酵母基因組測序完成后，發(fā)現(xiàn)其基因表達調(diào)控和信號轉導機制與高等動植物具有高度同源性[26]。目前已有許多研究者以釀酒酵母為模式生物進行基礎性研究，成為當今生物學研究的熱點之一[27]。本研究采用 Cre-LoxP 系統(tǒng)、Kanr抗性標記和同源重組技術敲除TPS2基因，構建釀酒酵母TPS2基因缺失菌株，分析在外界脅迫條件下TPS2基因敲除對酵母菌海藻糖合成和細胞抗逆性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

釀酒酵母模式菌BY4741(S.cerevisiaeBY4741，MATahis3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)為筆者所在實驗室保藏菌株；質(zhì)粒pUG6(含抗遺傳霉素G418的Kanr篩選標記和LoxP位點)由廣西大學杜麗琴教授惠贈；質(zhì)粒pYX212(含有尿嘧啶篩選標記)由南京工業(yè)大學陳勇老師惠贈；以上2種質(zhì)粒在大腸桿菌中均具有氨芐青霉素(Amp)抗性。

1.1.2 酶、試劑和儀器

rTaq酶、PrimeSTAR@Max DNA Polymerase、5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase Buffer、DNA Marker DL10000、DNA Marker DL5000、DNA Marker DL2000、dNTP Mixture、Agarose Gel DNA Purification、酵母基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及相關的常規(guī)限制酶,TaKaRa公司；G418、Amp，生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR 儀，Biometra公司；凝膠成像系統(tǒng)、電轉儀，美國 Bio-Rad 公司；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；熒光顯微鏡，德國萊卡公司；超低溫冰箱，日本Sanyo公司；培養(yǎng)箱、水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；其余試劑均為進口或國產(chǎn)市售分析純。引物均由南京金斯瑞公司合成。

1.1.3 引物

根據(jù)SGD(Saccharomycesgenome database)數(shù)據(jù)庫的TPS2基因(S000002481)和GenBank 的pUG6 序列(登錄號:AF298793.1)設計引物，敲除引物命名為QC-F、QC-R，基因TPS2驗證引物為A、B、C、D。根據(jù)Hind Ⅲ、SacⅠ酶切位點設計TPS2回補引物HB-F、HB-R。所涉及的引物及其序列見表1。

表1 PCR引物及序列

1.1.4 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母膏0.5 g、蛋白胨1 g、葡萄糖2 g，去離子水定容至100 mL，自然pH；若需配制平板則加入瓊脂 2 g，用于酵母細胞的培養(yǎng)。

YPD+G418培養(yǎng)基：每50 mL培養(yǎng)基加入500 μL 10 mg/mL的G418母液，終質(zhì)量濃度100 μg/mL；若需配制平板則加入瓊脂 2 g，用于酵母轉化子的篩選。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨 1 g、NaCl 1 g、去離子水定容至100 mL；若需配制平板則加入瓊脂 2 g，用于大腸桿菌的培養(yǎng)和保藏。

LB+Amp培養(yǎng)基：在100 mL培養(yǎng)基中加入100 μL 50 mg/mL的Amp母液，終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，用于含質(zhì)粒大腸桿菌的培養(yǎng)與提取。

PBS緩沖液：KCl 0.2 g/L、KH2PO40.24 g/L、NaCl 8.0 g/L、Na2HPO41.44 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.4。

以上培養(yǎng)基均須在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，葡萄糖單獨滅菌；G418與Amp須過濾除菌，在培養(yǎng)基降至合適溫度后再加入。

1.2 方法

1.2.1 含G418抗性基因(kanr)及TPS2同源臂的PCR擴增

實驗所用的質(zhì)粒電轉化至大腸感受態(tài)細胞中，參照分子克隆中的電擊轉化法操作。利用堿裂解法從大腸桿菌中提取質(zhì)粒pUG6，以該質(zhì)粒為模板，以 QC-F、QC-R 為引物進行 PCR 擴增獲得同源臂TPS2基因敲除組件。擴增條件：退火溫度54 ℃，延伸時間3 min，總體系為100 μL，30個循環(huán)；待PCR結束后取 2 μL PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 釀酒酵母電轉化感受態(tài)細胞的制備

將釀酒酵母BY4741單菌落接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min條件下?lián)u床過夜培養(yǎng)；按體積比2%接種量將種子液接種至100 mL YPD培養(yǎng)基中，接種4瓶，再于30 ℃、250 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3～5 h；將培養(yǎng)的菌液轉移至冰預冷的離心管中，并于冰上冰浴30 min，并將離心機預冷至4 ℃，4 000 r/min 離心15 min，棄上清液；用200 mL冰預冷的超純水洗滌重懸菌體，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，重復洗滌2次；用100 mL冰預冷的1 mol/L山梨醇溶液洗滌并重懸菌體，4 000 r/min離心15 min，棄上清液；再用100 mL冰預冷的山梨醇溶液洗滌并重懸菌體，4 ℃、4 000 r/min離心15 min后棄上清液，用殘留的山梨醇溶液將菌體溶解，不需加入新的山梨醇溶液溶解；溶解后的菌體，每管分裝100 μL至冰預冷的1.5 mL EP離心管中，于-80 ℃保存。

1.2.3TPS2基因敲除菌的構建

將含G418抗性(kanr)及TPS2同源臂 PCR產(chǎn)物(約400 ng)加入 100 μL感受態(tài)細胞中，混勻后轉移至2 mm電轉杯預冷5 min，并使用Eppendorf公司的電轉化儀進行電轉化(參數(shù)：電壓1.5 kV、電容25 μF、電阻400 Ω、電擊間距2 mm)。電轉后立即加入 1 mL預冷山梨醇溶液在30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2～3 h進行復蘇，結束后5 000 r/min 離心1 min，棄去部分上清液，留下100 μL濃縮液涂布于含 100 μg/mL G418 的 YPD篩選平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d以觀察是否有轉化子。

1.2.4 釀酒酵母轉化子的篩選與鑒定

將平板上出現(xiàn)的單菌落挑選至含 100 μg/mL G418 的YPD 液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)過夜后，12 000 r/min離心2 min收集菌體，使用試劑盒提取重組菌DNA，并以獲得的基因組為模板，用 Taq DNA 聚合酶和引物對 A/B、C/D 進行PCR驗證TPS2基因的敲除菌，驗證成功的敲除菌命名為TPS2Δ。酵母基因提取步驟參照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5TPS2基因回補菌的構建及驗證

將釀酒酵母BY4741與TPS2敲除菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過夜后，離心2 min收集菌體，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的試劑盒提取BY4741的總DNA，并以總DNA為模板，用高保真酶、引物對HB-F/HB-R進行PCR擴增，擴增好的序列先與質(zhì)粒pUC18進行連接，再進行測序；測序成功后的序列再與pYX212質(zhì)粒連接，進行電擊轉化，將轉化子涂布于具有Amp抗性的LB平板上，篩選出連接成功的轉化子，再提取質(zhì)粒后電轉化至TPS2敲除菌感受態(tài)中，涂布在尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基中進行重組子的篩選，然后用pYX212上多克隆位點(MSC)區(qū)域兩端的驗證引物YZ-F/YZ-R進行PCR驗證，從而得到TPS2回補菌(記作TPS2Δ-tps2)。

1.2.6 不同應激條件下的表型實驗分析

將BY4741、TPS2Δ-tps2和TPS2Δ菌培養(yǎng)過夜制備種子液，再將菌液稀釋至相同OD600后分別接種后在以下條件下培養(yǎng)：在30 ℃和42 ℃ YPD液體中、含1 mol/L NaCl的YPD液體及含4 mmol/L H2O2的YPD液體中，180 r/min進行培養(yǎng)，每隔2 h取菌液測定OD600，一直持續(xù)到菌液OD600趨于平穩(wěn)。

1.2.7 活性氧的測定

用活性氧(ROS)檢測試劑盒(南京建成公司)測定酵母胞內(nèi)ROS水平。將BY4741、TPS2Δ-tps2和TPS2Δ單菌落分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床過夜培養(yǎng)，隔夜培養(yǎng)物稀釋于新鮮YPD中，調(diào)整OD600為0.1，在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 h后，分別加入4 mmol/L H2O2進行氧化處理0.5 h，離心后加入PBS洗滌緩沖液2次，再用磷酸緩沖液(PBS)重懸，加入適量2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針，30 ℃孵育40 min，PBS洗滌重懸2～3次，取10 μL于熒光顯微鏡中觀察。

1.2.8 海藻糖含量的測定

海藻糖的提取操作如下：將BY4741、TPS2Δ-tps2和TPS2Δ單菌落分別接種于25mL普通YPD液體培養(yǎng)基中，180r/min、30 ℃搖床過夜培養(yǎng)。將BY4741、TPS2Δ-tps2和TPS2Δ菌液各取l0 mL菌液分別于30和42 ℃進行處理2 h，結束后10 000 r/min離心10 min，棄上清液并用預冷的雙蒸水洗滌菌體3次。向每個試管中加入4 mL 0.5 mol/L的三氯乙酸(TCA)溶液，將菌體懸浮后置于冰水浴中，30 min后提取海藻糖，重復3次后合并上清液。取1 mL上清液，加入4 mL的蒽酮試劑，搖勻后置于冰水中冷卻，然后沸水浴中煮沸10 min，迅速取出放入冰水中冷卻，室溫靜置10 min，在620 nm處測吸光值，每組設置2個平行[ 28]。

2 結果與討論

2.1 TPS2Δ敲除菌的構建與驗證結果

PCR擴增得到的G418抗性基因同時引入TPS2基因同源臂用于后續(xù)基因同源重組。以 QC-F、QC-R 為引物，利用 PCR 獲得帶有 2 個 LoxP位點和kanr篩選標記基因片段，進行電泳驗證，結果如圖1所示。由圖1可知：擴增得到片段大小與理論預計(1 880 bp)一致，說明該PCR 產(chǎn)物即為TPS2基因敲除組件。

M—DL5000；1—TPS2Δ PCR產(chǎn)物圖1 TPS2敲除組件的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of TPS2 gene disruption cassettes

采用電擊轉化法將TPS2基因敲除序列組件轉入釀酒酵母中。由于TPS2基因敲除序列組件中包含異源顯性的kanr標記，將構建好的序列組件轉入酵母細胞后，其兩端與酵母基因組同源的序列將引發(fā)同源重組替換，最終以loxp-kanr-loxp取代基因組中的TPS2從而賦予轉化子G418(遺傳霉素)抗性。2～3 d后可在含G418的平板上獲得轉化子。

提取轉化子基因組，以A/B、C/D為引物，進行PCR擴增，進行電泳驗證，結果見圖2。由圖2可知：使用引物A與B配對得到261 bp左右的產(chǎn)物，使用引物C與D得到了840 bp左右的產(chǎn)物，由此說明TPS2基因敲除成功。

M—DL2000；1—A/B PCR產(chǎn)物；2— C/D PCR產(chǎn)物圖2 TPS2基因A/B及C/D PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of TPS2 gene A/B and C/D products

為了進一步驗證TPS2基因敲除成功，將擴增出的A/D PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞公司測序，測序結果表明TPS2基因敲除成功。

2.2 TPS2回補菌的構建以及驗證結果

通過將TPS2與pYX212質(zhì)粒連接后，轉化至大腸桿菌細胞中，隨后提取質(zhì)粒用Hind Ⅲ和SacⅠ進行雙酶切，再進行瓊脂糖凝膠電泳驗證分析，結果見圖3。由圖3可知：質(zhì)粒進行雙酶切后產(chǎn)物大小分別約為8 300與2 700 bp。由此可見，TPS2基因已成功與pYX212質(zhì)粒連接。

M—DL10000；1—重組子酶切產(chǎn)物圖3 TPS2回補菌重組子酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of TPS2 replenishing bacteria recombinant digestion products

酶切驗證成功后，通過將質(zhì)粒pYX212-TPS2轉入TPS2Δ中，并使用驗證引物進行PCR后，然后進行凝膠電泳檢測，結果見圖4。由圖4可知：PCR產(chǎn)物大小約為2 700 bp，由此可見，質(zhì)粒pYX212-TPS2已成功轉入TPS2Δ中，TPS2回補菌構建成功。

M—DL5000；1—轉化子菌落PCR產(chǎn)物圖4 TPS2回補菌PCR驗證的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.4 Verification of TPS2 replenishing bacteria PCR by agarose gel electrophoresis

2.3 不同應激條件下重組菌株生長曲線分析

將BY4741、TPS2Δ和TPS2Δ-tps2菌株進行過夜培養(yǎng)制備種子液，稀釋至OD600相同后分別接種于25 mL 的普通YPD液體培養(yǎng)基中，通過在不同溫度(30 或42 ℃)、不同鹽濃度(0或1 mol/L NaCl)、不同H2O2濃度(0或4 mmol/L H2O2)進行培養(yǎng)，每過2 h取200 μL于96孔板上測定OD600，一直持續(xù)到菌液OD600平緩，結果見圖5。

圖5 BY4741/TPS2Δ/TPS2Δ-tps2在不同應激條件下的生長曲線Fig.5 Growth curves of BY4741/TPS2Δ/TPS2Δ-tps2 at different stress conditions

由圖5可知：在30 ℃條件下，BY4741生長趨勢高于回補菌TPS2Δ-tps2，而TPS2Δ-tps2生長情況略好于敲除菌TPS2Δ；在42 ℃高溫脅迫條件下，BY4741、TPS2Δ、TPS2Δ-tps2均受到抑制，BY4741生長情況仍然是遠好于TPS2Δ和TPS2Δ-tps2，而TPS2Δ-tps2生長情況略好于TPS2Δ；在1 mol/L NaCl鹽脅迫條件下，BY4741、TPS2Δ、TPS2Δ-tps2的生長均受到嚴重抑制，但BY4741的生長情況略好于TPS2Δ-tps2，而TPS2Δ-tps2的略好于TPS2Δ；在4 mmol/L H2O2氧化脅迫條件下，BY4741、TPS2Δ、TPS2Δ-tps2的生長也受到嚴重抑制，BY4741的生長情況略好于TPS2Δ-tps2，而TPS2Δ-tps2的略好于TPS2Δ。由于TPS2基因的缺失導致TPS2Δ胞內(nèi)海藻糖無法正常合成，而BY4741能夠正常合成海藻糖，TPS2Δ-tps2只能合成少量的海藻糖，因此出現(xiàn)BY4741的生長情況好于TPS2Δ-tps2，TPS2Δ-tps2的生長情況好于TPS2Δ的現(xiàn)象。由圖5還可知，在高溫脅迫條件下，BY4741與TPS2Δ、TPS2Δ-tps2的生長情況差異最為明顯，因而后續(xù)實驗將在高溫脅迫條件下進行。由此可推斷TPS2基因的嚴重缺失會影響海藻糖的合成，導致細胞抗逆性減弱，進而影響到細胞生長。

2.4 ROS含量分析

將BY4741、TPS2Δ和TPS2Δ-tps2菌株接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，加入PBS洗滌2次并用PBS懸浮菌液至OD600為0.1，加入1 μL DCFH-DA熒光探針，混勻后置于30 ℃搖床共孵育1 h，再次用PBS洗滌2～3次，吸取5～10 μL于載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察，結果如圖6所示。

圖6 胞內(nèi)ROS水平Fig.6 Intracelular ROS level

由圖6可知：與對照菌BY4741相比，TPS2Δ有較多的細胞被染成綠色熒光，由此可推斷TPS2的缺失增強了細胞的氧敏感性，導致胞內(nèi)ROS增多，這可能是因為無法正常合成海藻糖而導致細胞面對氧化脅迫無法做出應激反應；而TPS2Δ-tps2被染色的細胞比TPS2Δ的明顯減少，由此可見TPS2基因的確會影響細胞抗氧化能力。

2.5 在不同溫度下海藻糖含量的測定

通過不同質(zhì)量濃度的海藻糖溶液(0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g/L)與蒽酮試劑進行反應，在620 nm的波長下測定吸光值，以吸光值為縱坐標，海藻糖濃度為橫坐標，制作標準曲線，得到標準曲線y=7.206 2x-0.011 7。

將過夜培養(yǎng)的BY4741、TPS2Δ-tps2和TPS2Δ菌液(濕質(zhì)量約0.02 g)進行30 ℃和42 ℃處理后，10 000 r/min離心10 min后棄上清液并用預冷的雙蒸水洗滌菌體3次。向每個試管中加入4 mL 0.50 mol/L的TCA溶液，將菌體懸浮后置于冰水浴中，30 min后提取海藻糖，重復3次后合并上清液。取1 mL上清液，加入4 mL的蒽酮試劑，搖勻后置于冰水中冷卻，然后沸水浴中準確煮沸10 min，迅速取出放入冰水中冷卻，室溫靜置10 min，在620 nm處比色。根據(jù)海藻糖標準曲線，計算得到的結果如圖7所示。

圖7 BY4741/ TPS2Δ-tps2/ TPS2Δ在不同溫度條件下的海藻糖含量Fig.7 Trehalose content in BY4741/TPS2Δ-tps2/ TPS2Δ at different temperatures

由圖7可知：在30 ℃時，BY4741和TPS2Δ菌株中的海藻糖含量基本一致，然而生長表型卻有差異，這可能由于30 ℃屬于酵母細胞正常生長溫度，并沒有受到外界應激(高溫)，所以胞內(nèi)海藻糖含量并不高，差異也不明顯；在經(jīng)過42 ℃處理后，BY4741的海藻糖含量明顯高于TPS2Δ-tps2和TPS2Δ的，由此可見，TPS2基因的缺失確實影響了細胞海藻糖的合成，而TPS2Δ-tps2的海藻糖含量略高于TPS2Δ的，由此可見，在正常條件下，釀酒酵母胞內(nèi)海藻糖含量較少，海藻糖合成的相關基因也處于低表達水平；而在高溫、氧化等刺激條件下，胞內(nèi)海藻糖迅速積累，回補菌中TPS2基因確實已表達并在一定程度上彌補了海藻糖的缺失。

3 結論

以釀酒酵母模式菌株 BY4741 為出發(fā)菌株，通過同源重組對酵母TPS2基因敲除，命名為TPS2Δ；在敲除菌的基礎上重新構建TPS2基因回補菌，命名為TPS2Δ-tps2。在此基礎上研究TPS2基因對酵母細胞抗逆性的影響，并得到以下結論：1)通過生長曲線表型實驗結果說明，與對照菌BY4741相比，敲除菌TPS2Δ對高溫比氧化脅迫和高鹽條件更為敏感性，在高溫條件下，BY4741與TPS2Δ、TPS2Δ-tps2的生長情況差異表現(xiàn)最為明顯；2)胞內(nèi)ROS水平檢測結果說明，TPS2基因敲除增加了細胞胞內(nèi)ROS水平，而BY4741-TPS2中TPS2基因少量表達降低了胞內(nèi)ROS水平；3)不同溫度下胞內(nèi)海藻糖含量實驗結果表明，不同溫度下胞內(nèi)海藻糖含量出現(xiàn)明顯差異，這可能是由于TPS2基因敲除不能夠正常合成海藻糖，而BY4741能夠正常合成，TPS2Δ-tps2只能少量合成海藻糖；TPS2Δ-tps2因TPS2基因少量表達而在一定程度上彌補胞內(nèi)海藻糖的不足，在多種脅迫條件下，TPS2Δ-tps2可以改善細胞抗逆性能?？傊?，TPS2基因的缺失降低了海藻糖的合成，導致細胞對于抗逆環(huán)境的適應調(diào)節(jié)能力減弱。