丁三醇合成關(guān)鍵酶的篩選、酶學(xué)性質(zhì)及體外催化

李 惑，曹雪飛，儲建林，吳 斌

(1. 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800; 2. 南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京211800)

1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol,BT)是一種無色、無味、無毒的水溶性C4平臺化合物，其為黏稠糖漿狀，化學(xué)式為C4H10O3，分子量為106.12[1]；其2號碳原子為手性碳原子，具有旋光性，在醇類和水中有較高的溶解度，具有一定的吸濕性[2]。

1,2,4-丁三醇在合適的硝化體系中被完全硝化的產(chǎn)物是丁三醇三硝酸酯(BTTN)[3]，BTTN是一種含能增塑劑，與硝化甘油(NG)相比，它具有沖擊感小、熱穩(wěn)定性高、毒性小、揮發(fā)性低及吸濕性低等優(yōu)點(diǎn)，在炸藥、推進(jìn)劑等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[4-5]。1,2,4-丁三醇也是很多手性化合物的合成前體，以它為原料合成的緩釋劑可用來控制藥物的釋放速度[6-8]。光學(xué)純的1,2,4-丁三醇可以作為抗腫瘤、抗病毒、抗癌藥物、血小板活性因子、降膽固醇藥物及治療皮膚病藥物等藥物制備的關(guān)鍵中間體[9-15]，如(S)-1,2,4-丁三醇的環(huán)化產(chǎn)物(S)-3-羥基-四氫呋喃是合成治療艾滋病的藥物Agenerase(一種HIV蛋白酶抑制劑)的重要中間體[16]。1,2,4-丁三醇用作煙草降焦油助劑，可以減弱硝基化合物對人體的毒害，從而降低焦油對人體的危害；作為防腐劑的添加劑，能夠抑制微生物生長，增強(qiáng)防腐效果；作為彩色顯影液的組分，可增加色彩度和黏著力；作為交聯(lián)劑，可以提高聚合物的強(qiáng)度和硬度[17]。另外，1,2,4-丁三醇還可用作高級服裝的表面處理劑、高級墨水防干劑、陶瓷加工助劑以及特殊用途的包裝與儲運(yùn)等[18-20]。

迄今為止，在生物法合成1,2,4-丁三醇的途徑中，α-酮酸脫羧反應(yīng)中的關(guān)鍵酶仍然沿用Forst團(tuán)隊的Niu等[21]報道的來源于惡臭假單胞菌的苯甲酰甲酸脫羧酶MDLC。

本研究利用分子模擬技術(shù)，從京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)、酶數(shù)據(jù)庫BRENDA等數(shù)據(jù)庫中篩選可能催化3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸脫羧形成3,4-二羥基丁醛的酮酸脫羧酶，將其克隆至pEGX-6p-1后于E.coliDH5α中表達(dá)，比較目標(biāo)酶的酶活力大小，對酶活力最高的脫羧酶進(jìn)行純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析及體外催化研究，為提高BT生物合成效率提供優(yōu)異的新酶源。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株E.coliBL21、E.coliDH5α、質(zhì)粒pGEX-6p-1、質(zhì)粒pET-22b(+)，何冰芳教授實(shí)驗室保存；E.coliBL21/pET22b-xylD，何冰芳教授實(shí)驗室構(gòu)建保存。質(zhì)粒pUC57-mdlC、pUC57-kivD、pUC57-kdcA、pUC57-aro10和pUC57-pdc5，蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

各種限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)DNA、標(biāo)準(zhǔn)蛋白，TaKaRa公司。DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，Axygen公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖，Oxoid公司；木糖酸，珍瑭生物科技有限公司；NaCl、Tris-base，進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基[22](g/L)：蛋白胨10.0、NaCl 10.0、酵母粉5.0；固體培養(yǎng)基另加瓊脂20.0。

LB+氨芐青霉素(Amp)培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基滅菌后冷卻至60 ℃以下，再加入過濾除菌的Amp，使其終質(zhì)量濃度分別為100 mg/L。

1.2 大腸桿菌的DNA操作

質(zhì)粒提取、DNA酶切、連接、電泳、轉(zhuǎn)化等DNA操作參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行。

1.3 3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸-二磷酸硫胺(ThDP)反應(yīng)中間體的結(jié)構(gòu)構(gòu)建

利用MOE軟件(Chemical Computing Group)構(gòu)建3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸的加H結(jié)構(gòu)(圖1(a))，采用MMFF94力場，優(yōu)化幾何三維結(jié)構(gòu)，獲得底物的三維結(jié)構(gòu)；按照反應(yīng)催化機(jī)制，將3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸接到輔基二磷酸硫胺素(ThDP)上——ThDP結(jié)構(gòu)從酶的晶體結(jié)構(gòu)中提取，構(gòu)建反應(yīng)中間體結(jié)構(gòu)(圖1(b))，并優(yōu)化幾何三維結(jié)構(gòu)。

圖1 底物3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸與中間體3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸-二磷酸硫胺的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of the substrate (3-deoxy-D-glyceropentanoglycan acid) and the intermediate (3-deoxy-D-glyceropentanoglycan acid-thiamine diphosphate)

1.4 同源建模

來源于Pseudomonasaeruginosa的5-胍基-α-含氧戊酸脫羧酶(ARUI)[23]、來源于Neurosporacrassa的丙酮酸脫羧酶(N-PDC)[24]、來源于Saccharomycescerevisiae的支鏈-α-含氧酸脫羧酶(S-PDC)[25]和來源于Lactococcuslactis的α-酮異戊酸脫羧酶(KIVD)[26]的晶體結(jié)構(gòu)沒有被解析出來，利用同源建模方法構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)。上述4個脫羧酶的模板結(jié)構(gòu)來自PDB數(shù)據(jù)庫，ID依次分別為6BD3、5EUJ、2VK4和2VBF。利用Discovery studio 2.55軟件構(gòu)建同源模型，并進(jìn)行全局能量最小化計算。

1.5 分子對接

對接使用MOE軟件。分子對接前，所有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)均去除水分子和原有配體；用MOE軟件為蛋白質(zhì)分配電荷和氫原子，并優(yōu)化結(jié)構(gòu)，力場采用Amber10：EHT。將小分子對接進(jìn)入脫羧酶的活性中心，配體構(gòu)象由鍵旋轉(zhuǎn)生成，分子對接采用Triangle Matcher法，并用LondondG評分函數(shù)進(jìn)行排名，輸出100個構(gòu)象(pose)，再用gbvi/wsadg評分功能進(jìn)一步優(yōu)化排序，使酶活性口袋中的能量最小化。

1.6 α-酮酸脫羧酶基因的克隆

根據(jù)篩選所得序列設(shè)計PCR引物及序列(表1)進(jìn)行基因擴(kuò)增，上下游引物的5’端分別設(shè)計了BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

表1 PCR引物及序列

PCR的反應(yīng)體系：模板2 μL，上下游引物各2 μL，2×Priemix 25 μL，加重蒸水至50 μL。

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min后，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.7 表達(dá)載體的構(gòu)建

將質(zhì)粒與目標(biāo)酶基因用BamHⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，得到的線性載體與目標(biāo)酶基因用T4連接酶16 ℃連接8 h，導(dǎo)入感受態(tài)E.coliDH5α/E.coliBL21，得到重組質(zhì)粒E.coliDH5α/pGEX-6p-1-mdlC、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-kivD、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-kdcA、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-aro10、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-pdc5。

1.8 目標(biāo)酮酸脫羧酶的發(fā)酵培養(yǎng)及表達(dá)

將重組菌E.coliDH5α/pGEX-6p-1-mdlC、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-kivD、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-kdcA、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-aro10、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-pdc5，加入含Amp的LB種子培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)12 h。以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)1.5～2 h，至OD600約為0.6時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，于16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后在4 ℃下8 000 r/min離心20 min收集沉淀菌體，破碎后離心，留上清液。

1.9 酶活檢測

利用SDS-PAGE分析胞外上清液中的表達(dá)產(chǎn)物，并采用脫羧酶酶活檢測的方法測定目標(biāo)α-酮酸脫羧酶的酶活[27]。E.coliDH5α中含有BT合成途徑中所需的木糖酸脫水酶和醇脫氫酶，通過醇脫氫酶將3,4-二羥基丁醛轉(zhuǎn)化為BT過程中NADH的消耗來測量其活性。體系中含有50 mmol/L磷酸鉀(pH6.5)、10 mmol/L木糖酸、0.15 mmol/L ThDP、0.2 mmol/L NADH、10 U乙醇脫氫酶、20 μL粗酶裂解物。因為醇脫氫酶是測定中最后一種酶，所以需要添加足夠量的醇脫氫酶，使得醇脫氫酶的酶活不會對整體酶活產(chǎn)生影響。所測得的活性表示木糖酸轉(zhuǎn)化生成3,4-二羥基丁醛所經(jīng)歷的2步酶反應(yīng)的總活性。在96孔板中加入酶活測定的組分后混勻，在30 ℃下，340 nm處每隔1 min記錄一次吸光值A(chǔ)340。篩選階段為了簡化實(shí)驗，在酶活檢測中所使用的脫羧酶均為粗酶液。酶學(xué)性質(zhì)研究中所使用的均為純酶液。

反應(yīng)總酶活定義：一個單位的酶活定義為每分鐘消耗1 μmol NADH的量(U)。

1.10 支鏈-α-酮酸脫羧酶(KDCA)、木糖酸脫水酶(XYLD)的純化

將經(jīng)水系濾膜過濾的細(xì)胞破碎上清液通過鎳親和層析柱純化，收集目標(biāo)酶出峰的洗脫液，于4 ℃透析以除去咪唑和鹽。

取適當(dāng)稀釋的酶液，使用Bradfoard法測定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)。

木糖酸脫水酶的酶活定義為每分鐘消耗1 μmol木糖酸的量。采用比色法檢測木糖酸脫水酶酶活。

1)1,2,4-丁三醇體外催化。50 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.5)、0.5 mmol/L 焦磷酸硫胺素(TPP)、10 mmol/L MgCl2、20 mmol/L木糖酸、0.375 mmol/L NADH、0.5 mg/L脫羧酶、0.5 mg/L木糖酸脫水酶、25 U醇脫氫酶。體外催化中所使用的酶均為純酶。

2)1,2,4-丁三醇體外催化。將上述溶液加入1.5 mL離心管中混勻，在30 ℃、100 r/min控溫?fù)u床中避光轉(zhuǎn)化24 h。

3)1,2,4-丁三醇液相檢測方法。使用有機(jī)酸分析柱Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)檢測1,2,4-丁三醇，流動相為5 mmol/L H2SO4水溶液，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫55 ℃，檢測器為折光示差檢測器。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-酮酸脫羧酶的虛擬篩選

根據(jù)底物特點(diǎn)，在KEGG等數(shù)據(jù)庫中檢索類似的基團(tuán)反應(yīng)。本研究從BRENDA數(shù)據(jù)庫的脫羧酶EC 4.1.1-家族成員中選擇了9種具有相似基團(tuán)反應(yīng)的不同來源不同種類的脫羧酶：支鏈-α-酮酸脫羧酶(KDCA)(Lactococcuslactis)[28]、5-胍基-2含氧戊酸脫羧酶(ARUI)(Pseudomonasaeruginosa)[23]、苯丙酮酸脫羧酶(ARO10)(Saccharomycescerevisiae)[29]、丙酮酸脫羧酶(L-PDC)(Lactococcuslactis)[25]、丙酮酸脫羧酶(N-PDC)(Neurosporacrassa)[24]、支鏈α-含氧酸脫羧酶S-PDC)((Saccharomycescerevisiae)[25]、丙酮酸脫羧酶(PDC1)(Saccharomycescerevisiae)[25]、吲哚丙酮酸脫羧酶(PDC5)(Saccharomycescerevisiae)[25]、α-酮異戊酸脫羧酶(KIVD)(Lactococcuslactis)[26]進(jìn)行模擬篩選，以原有的苯甲酰甲酸脫羧酶作為對照。酶的氨基酸序列來源于Uniport蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(https:∥www.uniprot.org/)，索引號見表2。

表2 幾種不同來源的α-酮酸脫羧酶的三維結(jié)構(gòu)及序列

其中 KDCA、ARO10、L-PDC、PDC1和PDC5蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)都已經(jīng)解析，將從PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https:∥www.rcsb.org)中獲得的蛋白質(zhì)信息列在表2中，另外4個酶的三維結(jié)構(gòu)用同源建模方法構(gòu)建獲得。

利用分子對接軟件，將反應(yīng)中間體與上述蛋白的活性中心逐一對接，并以原有的MDLC做對照，對目標(biāo)酶進(jìn)行篩選，獲得可能更高效的脫羧酶，最后在實(shí)現(xiàn)篩選酶克隆表達(dá)和分離純化的基礎(chǔ)上，考察此酶的特性。脫羧酶家族(EC 4.1.1-)含有上百種不同來源、催化不同底物的脫羧酶。本研究根據(jù)催化底物特性，在KEGG數(shù)據(jù)庫中搜索相似的基團(tuán)反應(yīng)，并對數(shù)據(jù)庫大量的脫羧酶進(jìn)行比較，選擇了9個不同來源催化不同底物的α-酮酸脫羧酶進(jìn)行篩選。

選取的9種α-酮酸脫羧酶都是ThDP依賴性的非氧化酶，在反應(yīng)過程中，產(chǎn)生“底物-ThDP”的反應(yīng)中間體。反應(yīng)中間體在酶中的穩(wěn)定與否，往往能夠體現(xiàn)催化反應(yīng)的強(qiáng)弱，因此我們構(gòu)建了反應(yīng)中間體，將該中間體與所選的9種α-酮酸脫羧酶進(jìn)行了分子對接，并將MDLC作為對照，比較其結(jié)合自由能，分析其相互作用，從而進(jìn)一步篩選更有效的催化蛋白質(zhì)。

表3為不同來源的α-酮酸脫羧酶的對接自由能。由表3可知：反應(yīng)中間體均能合適地對接到9種α-酮酸脫羧酶活性中心，并有比對照組MDLC更小的對接自由能(負(fù)絕對值大)，這說明選擇的9種α-酮酸脫羧酶都有望替代原有的苯甲酰甲酸脫羧酶。尤其Lactococcuslactis來源的KDCA和Lactococcuslactis來源的KIVD的對接自由能相比對照組有更顯著的優(yōu)勢，說明反應(yīng)中間體與這些酶的親和性遠(yuǎn)高于對照組，有望獲得更高活性的α-酮酸脫羧酶。

表3 不同來源的α-酮酸脫羧酶的對接自由能

最終選擇了Lactococcuslactis來源的KDCA、Saccharomycescerevisiae來源的ARO10、S.cerevisiae來源的PDC5和L.lactis來源的KIVD進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗驗證。

2.2 α-酮酸脫羧酶的克隆表達(dá)及酶活檢測

2.2.1 α-酮酸脫羧酶的克隆表達(dá)

通過PCR擴(kuò)增得到mdlC、kdcA、kivD、pdc5和aro10這5種脫羧酶的基因片段，通過酶切連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)菌落PCR及測序驗證，選擇正確的菌落進(jìn)行保存。由于E.coliDH5α自身存在木糖脫水酶以及醇脫氫酶基因，我們將目標(biāo)脫羧酶基因克隆至E.coliDH5α中表達(dá)，可以簡化后續(xù)酶活檢測體系。將發(fā)酵破碎上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知：MDLC、KDCA和KIVD在大腸桿菌E.coliDH5α中均可表達(dá)，其表觀分子量分別為5.6×104、5.6×104和6.1×104。然而釀酒酵母(S.cerevisiae)來源的ARO10和PDC5表達(dá)量很低，表達(dá)失敗。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1—pGEX-6p-1上清液；2—pGEX-6p-1沉淀；3—MDLC上清液；4—MDLC沉淀；5—KDCA上清液；6—KDCA沉淀；7—KIVD上清液；8—KIVD沉淀；9—ARO10上清液；10—ARO10沉淀；11—PDC5上清液；12—PDC5沉淀圖2 重組酶的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the combinant recombinase

2.2.2 α-酮酸脫羧酶酶活測定

將發(fā)酵破碎離心后的上清液作為粗酶液用于脫羧酶酶活的檢測，由于E.coliDH5α中含有木糖脫水酶以及醇脫氫酶的基因，為了簡化篩選，選用粗酶液進(jìn)行酶活檢測。用BCA試劑盒檢測粗酶液的蛋白含量，再結(jié)合蛋白灰度掃描確定酮酸脫羧酶的大致濃度，進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見圖3。由圖3可知：MDLC、KDCA和KIVD均顯示出明顯的酶活，且KDCA和KIVD酶活力均高于MDLC，而ARO10和PDC5則無明顯比酶活。而孫雷等[30]研究發(fā)現(xiàn)，KIVD的催化效率要優(yōu)于MDLC，但KDCA還沒有人對其進(jìn)行討論，我們篩選所得的KDCA比KIVD有更高的酶活性，是MDLC的1.93倍，因此KDCA比KIVD在生產(chǎn)BT方面更具有優(yōu)勢。

圖3 α-酮酸脫羧酶的相對酶活力Fig.3 Relative enzyme activity of α-keto acid decarboxylase

2.3 KDCA在E.coli BL21中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 KDCA在E.coliBL21中的表達(dá)

由于E.coliDH5α并不是一個專門的蛋白表達(dá)宿主，因此，我們將支鏈-α-酮酸脫羧酶kdcA基因克隆至pET-22b(+)，轉(zhuǎn)入蛋白表達(dá)宿主E.coliBL21中表達(dá)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，KDCA成功在大腸桿菌BL21中表達(dá)。

圖4 KDCA在E.coli BL21中表達(dá)Fig.4 Expression of KDCA in E.coli BL21

2.3.2 KDCA酶學(xué)性質(zhì)分析

通過鎳柱親和層析分離獲得純的KDCA。KDCA的理論等電點(diǎn)為4.95，選擇pH 7.5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液 A平衡柱子，用緩沖液 B洗脫，收集對應(yīng)的洗脫峰。木糖酸脫水酶XYLD為本實(shí)驗室前期構(gòu)建，為了后續(xù)檢測，用相同的方法對XYLD進(jìn)行純化。

1)溫度對重組酶活力及穩(wěn)定性的影響。考察KDCA的最適催化溫度及其熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖5～6。由圖5可知：KDCA的最適溫度為30 ℃，與Wei等[28]報道的來源于Lactococcuslactis來源的KDCA的最適溫度為45 ℃相比較低。由圖6可知：KDCA在30 ℃孵育2 h后仍能保持其初始活性的90 %左右；當(dāng)溫度大于40 ℃孵育時，酶活降低顯著；當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃孵育時，幾乎喪失其初始活性的90%以上。

圖5 溫度對KDCA活力的影響Fig.5 Effect of temperature on KDCA activity

圖6 溫度對KDCA穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on KDCA stability

2)pH對重組酶活力及穩(wěn)定性的影響

考察pH對KDCA酶活的影響及其熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖7～8。由圖7可知：KDCA的最適pH為6.5，且pH為6.0～7.0時，具有較好的活性。這與Smit等[31]研究的Lactococcuslactis來源的KDCA的最適pH 6.3相近，與Wei等[28]發(fā)現(xiàn)在pH為6.0～7.0時它有廣泛活性的結(jié)論一致。

圖7 pH對KDCA的活力的影響Fig.7 Effect of pH on KDCA activity

圖9 脫羧酶體外催化結(jié)果的HPLC分析Fig.9 HPLC chromatogram analysis of results of decarboxylase catalysis in vitro

由圖8可知：KDCA在0 ℃、pH為6.0～7.0的條件下孵育2 h后，保留了其初始活性的80%以上；在pH大于8的條件下孵育2 h后，KDCA穩(wěn)定性下降顯著。這表明在pH為6.0～7.0時KDCA具有良好的pH穩(wěn)定性。

圖8 pH對KDCA穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on KDCA stability

2.4 KDCA、KIVD及MDLC的體外催化性能

發(fā)酵制備KDCA、KIVD和MDLC這3種脫羧酶的粗酶液用于1,2,4-丁三醇無細(xì)胞催化，在30 ℃、100 r/min條件下避光催化，高效液相色譜(HPLC)檢測MDLC、KDCA以及KIVD體外催化生產(chǎn)BT的產(chǎn)物，結(jié)果如圖9所示。1,2,4-丁三醇標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間為17.1 min，底物木糖酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間為11.7 min。由圖9可知：作為對照的空質(zhì)粒，無1,2,4-丁三醇產(chǎn)生；MDLC、KDCA以及KIVD均能合成1,2,4-丁三醇。MDLC、KDCA以及KIVD這3個脫羧酶催化生產(chǎn)BT的能力(從小到大)的順序為MDLC(0.175 g/L)、KIVD(0.216 g/L)、KDCA(0.337 g/L)，該結(jié)果與酶活檢測一致。KDCA體外催化24 h的BT產(chǎn)量為0.337 g/L，是MDLC的1.93倍。

3 結(jié)論

利用分子模擬技術(shù)，成功篩選出了一個較MDLC酶活力更高的脫羧酶——KDCA，經(jīng)體外催化研究發(fā)現(xiàn)，其24 h的BT產(chǎn)量是MDLC的1.93倍，并對KDCA的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度為30 ℃，最適反應(yīng)pH 為6.5，為提高BT生物合成效率提供了優(yōu)異的新酶源。