梓醇-川芎嗪方對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠認(rèn)知功能的影響

孟勝喜，陳慧澤，王 兵，李文濤，潘衛(wèi)東，張?jiān)圃?/p>

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以β淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和老年斑形成為主要特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。AD是迄今為止癡呆的最常見(jiàn)原因，占所有癡呆的80%[2]。中醫(yī)藥具有多層次、多靶點(diǎn)、多通路作用的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，在防治AD方面發(fā)揮著越來(lái)越大的作用，也受到越來(lái)越多的關(guān)注[3]。中藥有效組分是指中藥復(fù)方中具有相似化學(xué)性質(zhì)或化學(xué)結(jié)構(gòu)的對(duì)疾病具有治療作用的一類或多類有效成分群[4]。中藥有效組分配伍，不僅避免了傳統(tǒng)中藥方劑成分復(fù)雜等缺點(diǎn)，而且還保留了傳統(tǒng)方劑的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。中藥組分配伍是微觀的中藥復(fù)方，是隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程不斷發(fā)展而出現(xiàn)的新的研究熱點(diǎn)[5]。本研究探討梓醇-川芎嗪方(CL方)對(duì)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠認(rèn)知功能的影響，以期為AD的防治提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性、APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠6月齡50只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、梓醇組、川芎嗪組、CL方組、鹽酸多奈哌齊(安理申)組，每組10只。另選10只6月齡C57BL/6J小鼠為對(duì)照組。全部動(dòng)物購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0006，所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后分別單籠喂養(yǎng)，光照/黑暗交替時(shí)間12 h/12 h，溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(60±5)%，自由攝食及飲水。

1.2 藥物、試劑與儀器

1.2.1 試驗(yàn)藥物 鹽酸多奈哌齊(Aricept)，衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050978；批號(hào)：170508。CL方來(lái)源：CL方來(lái)源于本課題組長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出來(lái)的恒清Ⅱ號(hào)方[6-9]。恒清Ⅱ號(hào)方的主要組成包括熟地黃15 g、川芎10 g。梓醇在熟地黃中的平均含量為0.267%，因此，15 g熟地黃中含有梓醇0.040 05 g[10]。川芎中川芎嗪含量為0.152 3%，因此10 g川芎中含川芎嗪為0.015 23 g[11]。C組成為梓醇，CAS號(hào)：2415-24-9，純度93.7%，蘇州玉森新藥開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：080301，梓醇含量4.274 mg。L組成為川芎嗪，CAS號(hào)：1124-11-4，純度：98%，購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：081102，川芎嗪含量1.554 mg。CL方為4.274 mg的梓醇+1.554 mg的川芎嗪。

1.2.2 試劑與儀器 實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：JLBehv-MWMG-1)，小鼠自主活動(dòng)儀(成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：ZZ-6型)，動(dòng)物社會(huì)交互行為視頻分析系統(tǒng)(北京天鳴宏遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：Xeye SI V1.2)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組、造模與給藥 梓醇組、川芎嗪組、CL方組小鼠每天給予相對(duì)應(yīng)劑量的梓醇、川芎嗪及CL方 100 mg/kg灌胃；安理申組小鼠每天給予安理申5 mg/kg灌胃。對(duì)照組和模型組小鼠每天給予等體積的生理鹽水灌胃。均每天1次，連續(xù)灌胃8周。然后進(jìn)行行為測(cè)試，即Morris水迷宮(morris water maze，MWM)檢測(cè)和新物體識(shí)別(new object recognition，NOR)檢測(cè)[12]。

1.3.2 行為測(cè)試 ①M(fèi)orris水迷宮實(shí)驗(yàn)：共6 d，前5 d(定位航行試驗(yàn))每只小鼠每天訓(xùn)練3次，分別從除平臺(tái)所在象限之外的另外3個(gè)象限、頭朝向槽壁、置于水中60 s，如果60 s內(nèi)找到平臺(tái)，爬上平臺(tái)并停留5～10 s，小鼠所用時(shí)間則為逃避潛伏期(escaping latency，EL)；如果60 s內(nèi)仍未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)小鼠爬上平臺(tái)、停留10 s，則將其潛伏期計(jì)為60 s，連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄訓(xùn)練當(dāng)天3次逃避潛伏期，取其平均值。第6天(空間探索試驗(yàn))，撤去平臺(tái)，把小鼠放入目標(biāo)象限入水點(diǎn)，60 s內(nèi)記錄小鼠整個(gè)運(yùn)動(dòng)軌跡、在目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間、游泳距離、首次找到平臺(tái)時(shí)間及穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)，計(jì)算小鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間占整個(gè)游泳時(shí)間的百分比以及在目標(biāo)象限游泳距離占整個(gè)游泳距離百分比等。②新物體識(shí)別測(cè)試：準(zhǔn)備50 cm×50 cm×40 cm的實(shí)驗(yàn)箱和兩個(gè)大小相近但形狀、顏色都不一樣的物體(A和B)，在前3 d(訓(xùn)練期)，同一時(shí)間點(diǎn)把兩個(gè)相同物體(A+A或B+B)對(duì)稱放在實(shí)驗(yàn)箱中心位置上，小鼠面向籠壁放入，自由探測(cè)物體20 min；第4天(測(cè)試期)，將兩個(gè)不同物體(A+B)放在上面相同位置，小鼠自由探測(cè)物體5 min，如果小鼠頭部面向物品，頭部與物品之間的距離≤2 cm時(shí)則表明小鼠正在探索物體，記錄小鼠探測(cè)新物體和舊物體的時(shí)間，以相對(duì)識(shí)別指數(shù)(discrimination index，DI)來(lái)評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)記憶能力，DI=(新物體時(shí)間/總時(shí)間)×100%-(舊物體時(shí)間/總時(shí)間)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠不同時(shí)間的逃避潛伏期比較 第1天，各組小鼠的逃避潛伏期之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第2天，與對(duì)照組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，梓醇組、川芎嗪組、CL方組及安理申組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。第3天至第5天，與對(duì)照組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，梓醇組、川芎嗪組、CL方組及安理申組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與梓醇組比較，CL方組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與川芎嗪組比較，CL方組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與安理申組比較，CL方組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠不同時(shí)間逃避潛伏期比較 () 單位：s

2.2 各組小鼠空間記憶能力比較 與對(duì)照組比較，模型組目標(biāo)象限出現(xiàn)次數(shù)減少，目標(biāo)象限游程縮短，目標(biāo)象限游程比下降，目標(biāo)象限時(shí)間減少，目標(biāo)象限時(shí)間比下降，穿臺(tái)次數(shù)減少，首次穿越平臺(tái)時(shí)間延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，梓醇組、川芎嗪組、CL方組及安理申組目標(biāo)象限出現(xiàn)次數(shù)增加，目標(biāo)象限游程延長(zhǎng)，目標(biāo)象限游程比上升，目標(biāo)象限時(shí)間增加，目標(biāo)象限時(shí)間比上升，穿臺(tái)次數(shù)增加，首次穿越平臺(tái)時(shí)間縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與梓醇組比較，CL方組目標(biāo)象限出現(xiàn)次數(shù)增加，目標(biāo)象限游程延長(zhǎng)，目標(biāo)象限游程比上升，目標(biāo)象限時(shí)間增加，目標(biāo)象限時(shí)間比上升，穿臺(tái)次數(shù)增加，首次穿越平臺(tái)時(shí)間縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與川芎嗪組比較，CL方組目標(biāo)象限出現(xiàn)次數(shù)增加，目標(biāo)象限游程延長(zhǎng)，目標(biāo)象限游程比上升，目標(biāo)象限時(shí)間增加，目標(biāo)象限時(shí)間比上升，穿臺(tái)次數(shù)增加，首次穿越平臺(tái)時(shí)間縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與安理申組比較，CL方組目標(biāo)象限出現(xiàn)次數(shù)增加，目標(biāo)象限游程延長(zhǎng)，目標(biāo)象限游程比上升，目標(biāo)象限時(shí)間增加，目標(biāo)象限時(shí)間比上升，穿臺(tái)次數(shù)增加，首次穿越平臺(tái)時(shí)間縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠空間記憶能力比較 ()

2.3 各組小鼠新物體識(shí)別測(cè)試中DI比較 與對(duì)照組比較，模型組DI明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，梓醇組、川芎嗪組、CL方組及安理申組DI明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與梓醇組比較，CL方組DI明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與川芎嗪組比較，CL方組DI明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與安理申組比較，CL方組DI明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠新物體識(shí)別測(cè)試中DI比較 ()

3 討 論

中藥有效組分配伍不僅突破了以往主要以臨床經(jīng)驗(yàn)積累為中藥研制新藥的模式，也繼承和發(fā)揚(yáng)了中醫(yī)藥理論創(chuàng)新研究的模式，這將是中醫(yī)藥實(shí)現(xiàn)國(guó)際化、現(xiàn)代化的重要方向之一[5]。恒清Ⅱ號(hào)方是本課題組長(zhǎng)期臨床摸索、總結(jié)、反復(fù)驗(yàn)證過(guò)的防治AD有明確療效的經(jīng)驗(yàn)方[6-9]。熟地黃和川芎是恒清Ⅱ號(hào)方的主要組成藥物。熟地黃的主要成分為梓醇，川芎的主要成分為川芎嗪。梓醇是從玄參科植物地黃新鮮或干燥塊根中提取的小分子環(huán)烯醚萜類化合物，極性結(jié)構(gòu)，易溶于水，分子式C15H22O10，分子量是362.33，CAS號(hào)：2415-24-9，EINECS：219-324-0。梓醇有神經(jīng)保護(hù)、抗癌、抗炎、利尿、降血糖及抗肝炎病毒等作用，尤其在防治AD方面具有較好的作用，可以改善AD大鼠大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)異常，升高大腦皮質(zhì)膽堿能毒蕈堿受體M1亞型受體表達(dá)[13-14]。在血腦屏障的體外模型中，梓醇可以對(duì)β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)誘導(dǎo)的血腦屏障破壞具有保護(hù)作用[15]。川芎嗪為中藥川芎的主要有效成分，CAS號(hào)：1124-11-4；分子式：C8H12N2，分子量136.194 00。川芎嗪具有抗血小板聚集、擴(kuò)張小動(dòng)脈、改善微循環(huán)和腦血流等作用。由于其可通過(guò)血腦屏障，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)均發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)作用[16]。川芎嗪可以通過(guò)對(duì)AD大鼠海馬神經(jīng)元RAGE-ERK1/2-p38-NF-κB信號(hào)通路的下調(diào)作用，有效抑制神經(jīng)元活性氧生成，降低β淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性，改善AD大鼠腦組織炎性，進(jìn)而發(fā)揮其抗AD及神經(jīng)保護(hù)作用[17]。

本研究結(jié)果顯示，單用梓醇或單用川芎嗪，均可縮短APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的逃避潛伏期、增加目標(biāo)象限出現(xiàn)次數(shù)、延長(zhǎng)目標(biāo)象限游程、提高目標(biāo)象限游程比、延長(zhǎng)目標(biāo)象限時(shí)間、提高目標(biāo)象限時(shí)間比、增加穿臺(tái)次數(shù)、縮短首次穿越平臺(tái)時(shí)間、提高新物體識(shí)別測(cè)試中DI(P<0.05)，與安理申比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；梓醇與川芎嗪聯(lián)用，即組成CL方，則可以明顯縮短APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的逃避潛伏期、增加目標(biāo)象限出現(xiàn)次數(shù)、延長(zhǎng)目標(biāo)象限游程、提高目標(biāo)象限游程比、延長(zhǎng)目標(biāo)象限時(shí)間、提高目標(biāo)象限時(shí)間比、增加穿臺(tái)次數(shù)、縮短首次穿越平臺(tái)時(shí)間、提高新物體識(shí)別測(cè)試中DI(P<0.05)。其以上作用不僅優(yōu)于梓醇、川芎嗪，而且還優(yōu)于安理申。表明梓醇與川芎嗪聯(lián)用起到了顯著的增效作用，其作用機(jī)制則有待進(jìn)一步深入探索和研究。

綜上所述，CL方可以有效改善AD模型小鼠的認(rèn)知障礙，其效果既優(yōu)于其單一成分，也優(yōu)于安理申。