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    miR-206-3p靶向調(diào)控S100A9對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

    2022-01-10 03:19:12單會(huì)艷俞艷華趙瑞彪
    關(guān)鍵詞:明顯降低熒光素酶心肌細(xì)胞

    單會(huì)艷,俞艷華,趙瑞彪

    心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織缺血后恢復(fù)血流,血液的再灌注加重其結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙的病理生理過(guò)程,最終可能導(dǎo)致心肌梗死、纖維化、心肌肥厚和心力衰竭等多器官功能障礙[1]。因此,深入研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制,抑制心肌細(xì)胞凋亡,對(duì)防治心肌缺血再灌注損傷具有重要作用。研究報(bào)道,miR-206在低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡過(guò)程中發(fā)揮了保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[2]。miR-206通過(guò)靶向蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)對(duì)急性心肌梗死誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[3]。miR-206還可通過(guò)靶向CC趨化因子配體2(CC motif chemokine ligand 2,CCL2)抑制癲癇發(fā)作誘發(fā)的腦損傷[4]。S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100 calcium-binding protein A9,S100A9)是S100蛋白家族成員,在小鼠腦缺血再灌注損傷模型中高表達(dá)[5]。S100A9是早期再灌注階段上調(diào)最明顯的基因,敲除S100A9使心肌細(xì)胞凋亡明顯減少,并改善心臟功能[6]。S100A9還參與了兒童急性肺損傷[7]。然而miR-206-3p和S100A9對(duì)缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響還尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-206-3p和S100A9對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響,且miR-206-3p是否通過(guò)靶向調(diào)控S100A9表達(dá)影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自美國(guó)ATCC公司;胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;Trizol試劑、cDNA試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司;BCA試劑盒購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司;雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自上海英拜生物科技有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 H/R細(xì)胞模型的建立 將無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基先置于含95%N2、5%CO2密閉培養(yǎng)箱中3 h,進(jìn)行缺氧處理,將大鼠心肌細(xì)胞H9C2接種于上述培養(yǎng)基中繼續(xù)缺氧處理3 h,然后換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃含95%O2、5%CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)氧處理4 h。

    1.2.2 細(xì)胞分組與處理 將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照(Con)組、H/R組;H/R+miR-NC組、H/R+miR-206-3p組、H/R+si-NC組、H/R+si-S100A9組、H/R+miR-206-3p+pcDNA組、H/R+miR-206-3p+pcDNA-S100A9組。Con組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);H/R組構(gòu)建H/R細(xì)胞模型;H/R+miR-NC組、H/R+miR-206-3p組、H/R+si-NC組、H/R+si-S100A9組將miR-NC、miR-206-3p、si-NC、si-S100A9轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞H9C2中后進(jìn)行H/R處理;H/R+miR-206-3p+pcDNA組、H/R+miR-206-3p+pcDNA-S100A9組將miR-206-3p分別與pcDNA、pcDNA-S100A9共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞H9C2中后進(jìn)行H/R處理。

    1.2.3 miR-206-3p和S100A9 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) RT-qPCR檢測(cè)miR-206-3p和S100A9 mRNA的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA,合成cDNA,進(jìn)行PCR,相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。miR-206-3p和S100A9分別以U6和GAPDH為內(nèi)參,miR-206-3p正向引物序列:5′-AGCTCGATTAAGGTGGAATGTAAGGAAGT-3′,反向引物序列:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3′;U6正向引物序列:5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′,反向引物序列:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′;S100A9正向引物序列:5′-ACCCAGACACCCTGAACC-3′,反向引物序列:5′-AGCATGATGAACTCCTCGA-3′;GAPDH正向引物序列:5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′,反向引物序列:5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGAC-3′;引物均由上海生工生物工程公司合成。

    1.2.4 S100A9、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)S100A9、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。提取總蛋白采用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后加入一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,加入二抗室溫孵育2 h,用ECL發(fā)光液顯影,用Quantity One測(cè)定蛋白條帶灰度值,以目的條帶和GAPDH條帶灰度值比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

    1.2.5 SOD、GSH-Px活性和MDA含量的檢測(cè) 應(yīng)用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞SOD、GSH-Px活性和MDA含量。細(xì)胞培養(yǎng)48 h,收集各組細(xì)胞,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

    1.2.6 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。各組細(xì)胞用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗2次,與500 μL的結(jié)合緩沖液混勻,加入10 μL的Annexin V-FITC、5 μL的PI,混勻后避光孵育10 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

    1.2.7 miR-206-3p對(duì)S100A9的靶向調(diào)控的檢測(cè) 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-206-3p對(duì)S100A9的靶向調(diào)控。TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,miR-206-3p與S100A9存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建S100A9野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-S100A9和MUT-S100A9,將其分別與miR-NC和miR-206-3p共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中,按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。將miR-NC、miR-206-3p、anti-miR-NC、anti-miR-206-3p轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中檢測(cè)S100A9表達(dá)水平。

    2 結(jié) 果

    2.1 Con組與H/R組miR-206-3p和S100A9表達(dá)比較 與Con組比較,H/R組心肌細(xì)胞中miR-206-3p表達(dá)水平明顯降低,S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表1。

    圖1 Con組與H/R組S100A9蛋白表達(dá)條帶圖

    表1 Con組與H/R組miR-206-3p和S100A9表達(dá)比較 ()

    2.2 miR-206-3p過(guò)表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 與Con組比較,H/R組心肌細(xì)胞中miR-206-3p表達(dá)水平、SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平、MDA含量明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-206-3p組心肌細(xì)胞中miR-206-3p表達(dá)水平、SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);細(xì)胞凋亡率、MDA含量、Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、圖3、表2。

    圖2 4組Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖

    圖3 miR-206-3p過(guò)表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

    表2 miR-206-3p過(guò)表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 ()

    2.3 抑制S100A9表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 與Con組比較,H/R組心肌細(xì)胞中S100A9表達(dá)水平、MDA含量、細(xì)胞凋亡率、Bax表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);SOD和GSH-Px活性、Bcl-2表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與H/R+si-NC組比較,H/R+si-S100A9組心肌細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性、Bcl-2表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);S100A9表達(dá)水平、MDA含量、細(xì)胞凋亡率、Bax表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4、圖5、表3。

    圖4 4組S100A9、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)條帶圖

    圖5 抑制S100A9表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

    表3 抑制S100A9表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 ()

    2.4 miR-206-3p靶向調(diào)控S100A9的表達(dá) TargetScan預(yù)測(cè)顯示,miR-206-3p與S100A9存在結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,與miR-NC組比較,miR-206-3p組中轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-S100A9的細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);轉(zhuǎn)染突MUT-S100A9的細(xì)胞熒光素酶活性比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與miR-NC組比較,miR-206-3p組S100A9表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與anti-miR-NC組比較,anti-miR-206-3p組S100A9表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖6、表4、圖7、表5。

    圖6 S100A9的3′UTR中含有與miR-206-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

    表4 miR-NC組、miR-206-3p組細(xì)胞熒光素酶活性比較 ()

    圖7 4組S100A9蛋白表達(dá)條帶圖

    表5 miR-206-3p調(diào)控S100A9蛋白的表達(dá)()

    2.5 上調(diào)S100A9表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-206-3p過(guò)表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用 與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-206-3p組SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);S100A9表達(dá)水平、MDA含量、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與H/R+miR-206-3p+pcDNA組比較,H/R+miR-206-3p+pcDNA-S100A9組心肌細(xì)胞中S100A9表達(dá)水平、MDA含量、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);SOD和GSH-Px活性、Bcl-2表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖8、圖9及表6。

    圖8 4組S100A9、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)條帶圖

    圖9 上調(diào)S100A9表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-206-3p過(guò)表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

    表6 上調(diào)S100A9表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-206-3p過(guò)表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用 ()

    3 討 論

    心肌缺血/再灌注損傷是臨床常見(jiàn)的病理過(guò)程,如何有效預(yù)防心肌缺血/再灌注損傷,提高病人的生存質(zhì)量,是臨床研究的熱點(diǎn)[8]。研究表明,心肌缺血/再灌注損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞建立缺血再灌注損傷模型,結(jié)果顯示,H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低;細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平、MDA含量明顯升高,表明本實(shí)驗(yàn)H/R模型建立成功。

    研究表明,miRNA在心肌缺血/再灌注損傷的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用,可作為未來(lái)治療心肌缺血/再灌注損傷的新型工具和診斷心血管疾病的敏感生物標(biāo)記物[10]。研究報(bào)道,LncRNA RMRP過(guò)表達(dá)通過(guò)下調(diào)miR-206加劇了缺氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷;miR-206過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向生長(zhǎng)停滯DNA損傷誘導(dǎo)基因45β(growth arrest DNA damage-inducible gene 45β,Gadd45β)可明顯減少梗死面積并抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡;LncRNA UCA1使miR-206海綿化,從而加劇了氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)在人類巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[11-13]。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-206-3p低表達(dá);過(guò)表達(dá)miR-206-3p后H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中MDA含量明顯降低,SOD、GSH-Px活性明顯升高,細(xì)胞凋亡率明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高,Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低。表明過(guò)表達(dá)miR-206-3p可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。為進(jìn)一步研究miR-206-3p影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)其靶基因,結(jié)果顯示,miR-206-3p與S100A9存在結(jié)合位點(diǎn),雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-206-3p可靶向調(diào)控S100A9。且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中S100A9高表達(dá),表明S100A9可能參與H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。研究報(bào)道,柯薩奇病毒B3引起的心肌炎病人中S100A9高表達(dá),加重了心肌炎;S100A9基因敲除小鼠可改善左心室功能,減少心臟炎癥和氧化反應(yīng)[14]。外傷性腦損傷誘發(fā)了促炎性和淀粉樣蛋白S100A9的產(chǎn)生,S100A9是腦損傷的重要標(biāo)志[15]。血漿S100A8/A9異二聚體是心臟手術(shù)相關(guān)的急性腎損傷的早期預(yù)后標(biāo)志物[16]。因此,本實(shí)驗(yàn)為研究S100A9是否影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷,轉(zhuǎn)染S100A9抑制表達(dá)載體,結(jié)果顯示,MDA含量明顯降低,SOD、GSH-Px活性明顯升高,細(xì)胞凋亡率明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高,Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低。說(shuō)明抑制S100A9表達(dá)可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。且上調(diào)S100A9表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-206-3p過(guò)表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。提示miR-206-3p可能通過(guò)調(diào)控S100A9影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

    綜上所述,過(guò)表達(dá)miR-206-3p通過(guò)靶向下調(diào)S100A9可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,miR-206-3p對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

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