蕓豆鹽堿響應(yīng)NAC轉(zhuǎn)錄因子的分子特性分析

翟玲俠，于 崧，2，侯玉龍，秦 猛，朱雪天，王小琴，于立河，2

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319)

NAC的命名源于矮牽?；騈AM，擬南芥基因ATAF1、ATAF2及CUC2的首字母縮略詞，它是植物所特有的特異性轉(zhuǎn)錄因子[1-2]。NAC家族N末端高度保守，含有相似的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但其C末端高度多樣化，不包含任何已知的蛋白結(jié)構(gòu)域[3-4]。利用植物基因組全測(cè)序，鑒定出多個(gè)作物中含有NAC轉(zhuǎn)錄因子，例如擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有117個(gè)NAC基因，大豆(Glycinemax)中有152個(gè)，水稻(Oryzasativa)中有151個(gè)，煙草(Nicotianatabacum)中有152個(gè)，蕓豆(Phaseolusvulgaris)中有106個(gè)等[5-6]。同時(shí)，已有大量研究發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中、抗逆反應(yīng)過(guò)程中、應(yīng)對(duì)各種脅迫過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用[7-9]。如玉米ZmNAC33基因可以誘導(dǎo)包括DRE、MYC和MYB等基因的表達(dá)，從而改善植物的耐旱性[10]；大豆GmNAC15基因可以應(yīng)對(duì)多種非生物脅迫，并且具有耐鹽性[11]；PwNAC2通過(guò)多種信號(hào)通路增強(qiáng)了植物對(duì)干旱的耐受性[12]；番茄SlNAC1通過(guò)提高過(guò)氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和保持較高的光化學(xué)效率等機(jī)制來(lái)提高植株對(duì)寒冷的耐受性[13]；GmNAC109參與了生長(zhǎng)素信號(hào)通路，有助于調(diào)控毛狀根的形成[14]；BrNAC041參與ABA對(duì)GA在白菜葉片衰老過(guò)程中的拮抗作用[15]；在低溫、甘露醇和NaCl處理后，CaNAC035的基因沉默會(huì)抑制辣椒幼苗的生長(zhǎng)[16]等。目前，越來(lái)越多的NAC轉(zhuǎn)錄因子被鑒定，但是對(duì)蕓豆NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能研究較少，對(duì)鹽堿響應(yīng)的分析更是鮮有報(bào)道。

植物的非生物脅迫包括干旱脅迫、低溫脅迫、鹽堿脅迫、高溫脅迫及重金屬脅迫等，在不同的理化因素逆境條件下植物會(huì)相應(yīng)地產(chǎn)生抗性[17]。鹽堿是影響植物生長(zhǎng)的主要環(huán)境因子之一，會(huì)對(duì)植物造成大量的影響[18]，如植株不能正常生長(zhǎng)、黃化、萎蔫[19-20]、導(dǎo)致植株嚴(yán)重減產(chǎn)等[21-22]。蕓豆是豆科植物，可食用，學(xué)名為普通菜豆。蕓豆含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、膳食纖維等，除供人們食用之外，在藥用方面也存在超高的價(jià)值，如提高免疫力[23]。近年來(lái)，蕓豆?jié)u漸進(jìn)入人們的視野，我國(guó)的種植面積也不斷擴(kuò)大，然而蕓豆為鹽堿敏感作物，土壤鹽堿嚴(yán)重制約了蕓豆的生長(zhǎng)發(fā)育[24]。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，建立100 mmol/LNaHCO3和100 mmol/LNaCl處理蕓豆葉片組織24，48 h的轉(zhuǎn)錄組，以水處理為對(duì)照，共獲得8個(gè)鹽堿響應(yīng)NAC轉(zhuǎn)錄因子，利用染色體定位、進(jìn)化發(fā)育關(guān)系、基因及蛋白結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子所含元件和組織表達(dá)模式等多方面進(jìn)行綜合分析，為進(jìn)一步研究蕓豆NAC轉(zhuǎn)錄因子的抗逆功能和調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 構(gòu)建蕓豆葉片組織鹽堿脅迫轉(zhuǎn)錄組

本研究使用蕓豆品種為耐鹽堿品種HYD，用10% NaClO溶液浸泡10 min，用清水和無(wú)菌水各清洗3遍進(jìn)行消毒，將消毒后的種子放置在發(fā)芽盒中，并在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)3 d催芽，選取發(fā)芽整齊一致的種子移栽到1/4霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為光14 h/暗10 h (光強(qiáng)400 μmol/(m2·s))。培養(yǎng)5 d后換1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，當(dāng)蕓豆長(zhǎng)至第2對(duì)新生復(fù)葉時(shí)更換霍格蘭全營(yíng)養(yǎng)液并加入100 mmol/L NaHCO3和100 mmol/L NaCl溶液處理，分別在處理24，48 h對(duì)蕓豆幼苗葉片的同一部位取樣，以0 h為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。取樣后放入液氮中冷凍并放置-80 ℃冰箱備用，后將所取樣品送至百邁客公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

用所保存的0，24，48 h蕓豆葉片樣品，根據(jù)TRIzol法提取蕓豆葉片RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。之后使用東洋紡的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以總RNA為模板合成cDNA。

1.3 蕓豆NAC基因系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析

利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//phytozome.jgi.doe.gov)下載蕓豆NAC基因的蛋白質(zhì)序列，Blast與蕓豆NAC基因同源的擬南芥及水稻NAC蛋白。利用Mega 6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4 蕓豆NAC序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)下載蕓豆NAC基因的CDS序列和蛋白序列，利用在線軟件MEME (http：//meme-suite.org)預(yù)測(cè)保守序列，通過(guò)GSDS (http：//gsds.cbi.pku.edu.cn)繪制基因結(jié)構(gòu)圖，利用在線軟件SOSUI (http：//harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，通過(guò)在線網(wǎng)站NetPhos 2.0 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)數(shù)目及種類，利用PSORT (http：//psort1.hgc.jp/form.html)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，利用在線生物信息學(xué)工具ExPASy (https：//web.expasy.org/protparam)對(duì)基因理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.5 蕓豆NAC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線網(wǎng)站PSIPRED (http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/#)預(yù)測(cè)NAC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.6 蕓豆NAC基因的染色體定位分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載蕓豆染色體信息、基因信息及所在染色體位置，利用MapChart軟件制作染色體定位圖。

1.7 蕓豆NAC基因的啟動(dòng)子分析

在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)下載蕓豆NAC基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp的啟動(dòng)子序列，利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)plantCARE (http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)預(yù)測(cè)蕓豆NAC基因啟動(dòng)子所包含逆境相關(guān)順式作用元件，使用IBS 1.0軟件繪制蕓豆NAC啟動(dòng)子分析圖。

1.8 蕓豆NAC基因表達(dá)特性分析

將保存的蕓豆cDNA稀釋10倍做模板進(jìn)行qRT-PCR分析，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，以ACT11為內(nèi)參[25](表1)，使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，利用Excel軟件分析并繪制柱形圖，每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。同時(shí)在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取蕓豆在不同組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件繪制熱圖。

表1 熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequence amplified by fluorescence quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓豆鹽堿脅迫響應(yīng)NAC基因的鑒定

蕓豆中含有106個(gè)NAC基因，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，共獲得8個(gè)鹽堿響應(yīng)NAC轉(zhuǎn)錄因子，這8個(gè)基因能夠不同程度響應(yīng)鹽堿脅迫，分子量為23 676.36～44 354.33 ku，蛋白編碼203～394個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)4.74～8.86 (表2)，可見這8個(gè)基因理化性質(zhì)差異不大。此外，有3個(gè)基因具有1～8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

表2 8個(gè)鹽堿脅迫響應(yīng)NAC基因信息和理化性質(zhì)分析Tab.2 NAC gene information and physicochemical properties analysis of 8 genes in response to saline-alkali stress

2.2 蕓豆鹽堿脅迫響應(yīng)NAC基因系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析

為了進(jìn)一步了解蕓豆耐鹽堿相關(guān)的NAC基因與其他植物來(lái)源的NAC基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)NCBI獲取了8個(gè)蕓豆及其同源擬南芥和同源水稻NAC序列，利用Mega 6.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示(圖1)，8個(gè)蕓豆NAC被分為4個(gè)亞家族(a～d)，其中在a族中，蕓豆鹽堿脅迫NAC基因最多，c族中含有2個(gè)蕓豆NAC基因，而b族和d族中都僅含有1個(gè)蕓豆NAC基因，與其他基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

星號(hào)標(biāo)識(shí)代表該基因已有相關(guān)報(bào)道。The asterisk indicates that the gene has been reported.

2.3 鹽堿脅迫下蕓豆NAC基因結(jié)構(gòu)和保守域分析

為了揭示蕓豆中NAC家族基因序列的多樣性，利用MEME在線預(yù)測(cè)工具，預(yù)測(cè)響應(yīng)鹽堿脅迫的NAC蛋白中10個(gè)不同的保守元件 (圖2)，大部分都在N端，8個(gè)蕓豆NAC基因的N段均含有Motif 3，這些元件組成了蕓豆NAC轉(zhuǎn)錄因子特有的保守的DNA結(jié)合域。所有NAC基因的N端都含有4～6個(gè)不等的Motif，僅AT5G64530中不含有Motif 6，這表明該元件并不是在所有的基因中都發(fā)揮功能。所有亞族中都能看到一些特異性Motif，如Motif 7，8，10僅在d亞家族中所特有，且在b和d亞家族中不含有Motif 1?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，多數(shù)亞族的基因顯示了相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，表明這些基因具有相似的特征。

圖2 8個(gè)蕓豆NAC轉(zhuǎn)錄因子保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Conserved motif and gene structure analysis of eight common bean NAC transcription factors

2.4 蕓豆鹽堿脅迫響應(yīng)NAC基因染色體定位分析

對(duì)蕓豆8個(gè)鹽堿脅迫響應(yīng)NAC基因在染色體上的分布統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，8個(gè)基因分別分布在8個(gè)不同的染色體上，除染色體3、7、10外，其他染色體上均有鹽堿響應(yīng)基因分布(圖3)。

圖3 8個(gè)蕓豆NAC基因染色體定位分析Fig.3 Chromosomal localization of eight common bean NAC transcription factors

2.5 蕓豆鹽堿脅迫響應(yīng)NAC蛋白磷酸化位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位點(diǎn)分析

8個(gè)NAC蛋白的磷酸化位點(diǎn)總數(shù)在15～33，不同蛋白間磷酸化位點(diǎn)數(shù)目相差較大，從3種磷酸化位點(diǎn)數(shù)目來(lái)看，絲氨酸數(shù)目最多，分別在10～22，其次為蘇氨酸，酪氨酸數(shù)目最少。通過(guò)Softberry分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)蕓豆鹽堿響應(yīng)NAC蛋白都定位在細(xì)胞核上(表3)。

2.6 蕓豆鹽堿脅迫響應(yīng)NAC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)在線軟件PSIPRED預(yù)測(cè)8個(gè)蕓豆NAC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)，所有NAC蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)比例最高(表4)，α-螺旋的結(jié)構(gòu)比例在7.9%～20.6%，而β-折疊的結(jié)構(gòu)比例在7.6%～15.9%。

表4 蕓豆NAC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Tab.4 Prediction of secondary structure of common bean NAC protein %

2.7 鹽堿脅迫響應(yīng)蕓豆NAC基因的組織部位表達(dá)模式

利用蕓豆各NAC的編碼序列，在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行表達(dá)數(shù)據(jù)的檢索，共得到了8個(gè)蕓豆NAC基因的9個(gè)不同表達(dá)部位的表達(dá)譜。其中Phvul.005G084500基因在花蕾、花和未成熟的豆莢中均有較高的表達(dá)量，而Phvul.004G077400基因在幼葉中特異性表達(dá)，Phvul.009G156300基因成熟豆莢中有較高表達(dá)，Phvul.011G024700在各個(gè)部位均有所表達(dá)，其余4個(gè)蕓豆NAC基因在蕓豆部分組織中表達(dá)較低或不表達(dá)(圖4)。

圖4 8個(gè)鹽堿脅迫響應(yīng)的NAC基因組織部位表達(dá)分析Fig.4 Tissue expression analysis of 8 saline-alkali response NAC

2.8 蕓豆鹽堿脅迫響應(yīng)NAC基因啟動(dòng)子分析

為了更深入地了解8個(gè)蕓豆NAC在鹽脅迫下的功能，利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)分析蕓豆NAC的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp啟動(dòng)子區(qū)域。結(jié)果表明，7個(gè)蕓豆NAC基因含有光響應(yīng)元件(ABRE)，6個(gè)蕓豆NAC基因含有水分脅迫響應(yīng)元件(MYB)和部分參與光響應(yīng)的保守DNA模塊(Box 4)，5個(gè)蕓豆NAC基因含有光響應(yīng)元件(G-box)、逆境響應(yīng)元件(TC-rich)和厭氧反應(yīng)元件(ARE)，4個(gè)蕓豆NAC基因含有ABA響應(yīng)元件(MYC)和茉莉酸響應(yīng)元件(CGTCA-motif)，2個(gè)蕓豆NAC基因含有光響應(yīng)模塊(AE-box)，僅有一個(gè)蕓豆NAC基因含有WRKY響應(yīng)元件(W box)。其中有一些元件在同一個(gè)基因中重復(fù)出現(xiàn)3次及以上，如ABRE元件在Phvul.008G159200啟動(dòng)子中出現(xiàn)了3次，在Phvul.006G188900啟動(dòng)子中出現(xiàn)了7次，在Phvul.005G084500啟動(dòng)子中出現(xiàn)10次，Box 4元件在Phvul.008G159200啟動(dòng)子中出現(xiàn)了5次，在Phvul.002G283600和Phvul.011G024700啟動(dòng)子中出現(xiàn)了4次，ARE元件在Phvul.002G283600啟動(dòng)子中出現(xiàn)過(guò)3次，G-box元件在Phvul.004G077400中出現(xiàn)3次，在Phvul.005G084500中出現(xiàn)5次，CGTCA-motif元件在Phvul.005G084500啟動(dòng)子中出現(xiàn)3次，而MYC和MYB則出現(xiàn)4次，并且8個(gè)蕓豆NAC啟動(dòng)子中都含有3～7種不同元件(圖5)。

圖5 8個(gè)鹽堿脅迫響應(yīng)NAC基因啟動(dòng)子序列分析Fig.5 Sequence analysis of 8 saline-alkali response NAC gene promoters

2.9 蕓豆NAC基因在不同時(shí)間點(diǎn)鹽堿處理下的表達(dá)分析

為了更深入地了解蕓豆NAC基因在不同時(shí)間點(diǎn)下鹽堿處理的表達(dá)，對(duì)從轉(zhuǎn)錄組中篩選出的8個(gè)鹽堿脅迫響應(yīng)的NAC基因做了qRT-PCR分析，結(jié)果表明，在NaHCO3處理下4個(gè)NAC基因上調(diào)表達(dá)，2個(gè)NAC基因下調(diào)表達(dá)(圖6)；在NaCl處理下，1個(gè)NAC基因表現(xiàn)出了上調(diào)表達(dá)，4個(gè)NAC基因下調(diào)表達(dá)(圖7)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)基因同時(shí)響應(yīng)鹽脅迫與堿脅迫(圖8)，其中Phvul.001G192000和Phvul.008G159200在鹽堿脅迫下均下調(diào)表達(dá)，Phvul.009G156300無(wú)論在堿脅迫或是鹽脅迫都上調(diào)表達(dá)。

3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以0 h為對(duì)照，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖7同。Three biological replicates, with 0 h as the control, different capital letters indicate extremely significant differences (P<0.01).The same as Fig.7.

圖7 NaCl脅迫下蕓豆NAC基因的表達(dá)Fig.7 Expression profile of NAC gene in common bean under NaCl stress

圖8 8個(gè)蕓豆NAC鹽堿響應(yīng)基因重疊韋恩圖Fig.8 Overlapped Venn plots of NAC salt-alkali response genes in eight common bean

3 討論與結(jié)論

NAC基因廣泛的參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)，并且調(diào)控著植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)生命進(jìn)程[26-27]，如調(diào)控細(xì)胞分裂[28]、調(diào)節(jié)植物的細(xì)胞生長(zhǎng)[29]、誘導(dǎo)植株抗生素的合成[30]以及植物次生壁的形成等[31-32]。NAC轉(zhuǎn)錄因子被證明可以提高擬南芥的抗逆性之后，大量的NAC基因在作物中發(fā)揮的功能被陸續(xù)的報(bào)道出來(lái)，例如過(guò)表達(dá)脅迫誘導(dǎo)的SNAC1基因水稻在四葉期表現(xiàn)出更好的抗旱性和耐鹽性[33]；小麥中的TaNAC29基因參與鹽脅迫的響應(yīng)，并能增強(qiáng)植株抗氧化酶的活性，減少鹽脅迫對(duì)植株的損傷[34]；SNAC2/OsNAC6轉(zhuǎn)基因水稻在低溫下細(xì)胞膜更穩(wěn)定[35]。然而并不是所有NAC轉(zhuǎn)錄因子都可以提高作物的抗逆性，如甜瓜的CmNAC14，發(fā)現(xiàn)其過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥增加了對(duì)鹽脅迫的敏感性等[36]?，F(xiàn)在，越來(lái)越多的NAC轉(zhuǎn)錄因子功能被鑒定出來(lái)，但在蕓豆中，NAC轉(zhuǎn)錄因子研究卻很有限，本研究通過(guò)蕓豆葉片組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定了蕓豆8個(gè)響應(yīng)鹽堿NAC轉(zhuǎn)錄因子，表明這些基因在鹽堿反應(yīng)中可能發(fā)揮重要的作用。

本研究通過(guò)進(jìn)化發(fā)育分析、基因結(jié)構(gòu)分析及保守域分析可以發(fā)現(xiàn)，8個(gè)蕓豆NAC基因被分為4個(gè)亞家族，包含已知的逆境相關(guān)NAC基因，其中AT3G15500基因被驗(yàn)證和大豆的抗旱性相關(guān)[37]，Wu等[38]也提及Phvul.005G084500與干旱有關(guān)，而本研究中發(fā)現(xiàn)Phvul.005G084500與抗堿性相關(guān)，由此猜測(cè)a亞族中的基因可能與干旱脅迫及堿脅迫相關(guān)，可以發(fā)現(xiàn)有的基因不止在一種逆境下有所表達(dá)，一個(gè)基因可能同時(shí)響應(yīng)多種非生物脅迫，本研究分析也得到3個(gè)基因同時(shí)響應(yīng)鹽脅迫和堿脅迫。

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與DNA上的特異性元件結(jié)合，會(huì)驅(qū)動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。像GmDGAT1A基因通過(guò)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控油脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響大豆種子中油脂的合成與分解[39]，馮珊珊等[40]發(fā)現(xiàn)了與CBF冷反應(yīng)通路相關(guān)的CRT/DRE元件，證明了TaEXPB12-A/B/D可能在CBF冷反應(yīng)通路中承擔(dān)著一定的角色。本研究中一些逆境相關(guān)元件在啟動(dòng)子中高頻出現(xiàn)，如ABRE、Box 4和MYB等，這表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在參與蕓豆鹽堿脅迫信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，可能作為相關(guān)基因的上游調(diào)控因子，結(jié)合啟動(dòng)子中相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)從而激活或抑制基因的表達(dá)。

磷酸化位點(diǎn)是一種特殊的分子區(qū)域，它們對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)特別重要，它可以激活或停用蛋白質(zhì)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要的作用。有大部分的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)蛋白磷酸化來(lái)提高植物的抗逆能力，像轉(zhuǎn)錄因子的MAPK可以改變細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、反式激活或抑制活性、DNA結(jié)合活性和核小體結(jié)構(gòu)的重塑。MAPK介導(dǎo)的WRKY8的磷酸化激活其DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)移活性，并且WRKY8誘導(dǎo)下游防御基因[41]。本研究中8個(gè)NAC蛋白均有磷酸化位點(diǎn)，但磷酸化位點(diǎn)數(shù)目及類型有所不同，說(shuō)明這8個(gè)蕓豆NAC蛋白的磷酸化位點(diǎn)都有可能被特定的蛋白激酶磷酸化從而影響植物的抗逆能力。通過(guò)對(duì)NAC蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占據(jù)著主導(dǎo)地位，無(wú)規(guī)則卷曲有明確而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，受側(cè)鏈相互作用的影響很大，它們經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異的功能部位。

本研究對(duì)各組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，蕓豆的NAC基因在蕓豆植株各部位均有不同程度的表達(dá)。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證分析篩選出的8個(gè)蕓豆NAC基因在鹽堿脅迫下出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，表明這8個(gè)基因在鹽堿脅迫中都具有一定的功能。

本研究從基因組范圍內(nèi)對(duì)蕓豆NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)分析，從中鑒定得到了8個(gè)蕓豆NAC基因，表明這些基因可能在蕓豆鹽堿脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。利用生物學(xué)信息的方法對(duì)這些NAC基因的進(jìn)化關(guān)系，啟動(dòng)子分析和組織表達(dá)模式以及qRT-PCR等多方面進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)蕓豆NAC出現(xiàn)不同程度的表達(dá)，表明其對(duì)鹽堿有一定的響應(yīng)。本研究可以提供關(guān)于逆境誘導(dǎo)候選基因的有用信息，這些潛在基因發(fā)現(xiàn)對(duì)于提高作物抗逆性研究及蕓豆后續(xù)NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究具有重要意義。