C19orf33在胰腺導(dǎo)管腺癌中的診斷及預(yù)后作用分析

鐘慧敏 莫華倩 姜燕慧 沈婷 劉宜敏

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）是常見的惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率、死亡率分別位于惡性腫瘤中前10 位、第4 位［1］。手術(shù)治療和化療是其主要治療手段，然而目前二者對PAAD 患者的總體生存率影響有限［2］。盡管CA19?9、CA125、CEA 等可作為PAAD 診斷和預(yù)后的臨床標(biāo)志物，但其預(yù)測準(zhǔn)確性還有待提高［3］。因此，需要找到新的生物標(biāo)志物以實現(xiàn)胰腺癌的早期診斷，把握胰腺癌的關(guān)鍵治療時機。

C19orf33 基因是由4 個跨越約1 kbp 的外顯子組成，位于HAI?2 基因下游的11 kbp 處［4］。研究表明，C19orf33 在多種腫瘤如卵巢癌中表達(dá)異常且與預(yù)后緊密相關(guān)［5］。但其在胰腺癌中的作用還尚未研究透徹。因此，本研究旨在通過生物信息學(xué)分析TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫中C19orf33 和臨床相關(guān)信息，評估C19orf33 基因表達(dá)在胰腺癌中的診斷和預(yù)后價值，并對其潛在的作用機制進行探索。

1 臨床資料

1.1 一般資料我們從TCGA 數(shù)據(jù)庫和基因型組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Genotype?Tissue Expression，GTEx，V8 版本）中下載最新的RNA 測序數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床病理信息（截止至2021 年1 月2 日）。患者均簽署知情同意書并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2021?KY015）。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）“0”基因表達(dá)值；（2）臨床資料不完整；（3）組織病理類型不為PAAD 的患者；（4）生存時間＜1個月的患者；共納入178例符合標(biāo)準(zhǔn)的PAAD 樣本和336 例正常胰腺組織樣本。為了提高篩選結(jié)果的可靠證據(jù)，我們另外從GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫下載GSE71729數(shù)據(jù)集的RNA 芯片表達(dá)和相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，包括145例腫瘤組織和46例胰腺正常組織［6］。

1.2 差異表達(dá)基因篩選R 軟件deseq2 包、GEO2R 分別用于篩選TCGA?PAAD、GTEx 和GSE71729 數(shù)據(jù)集中胰腺癌和正常胰腺組織的差異表達(dá)的基因（differentially expressed genes，DEGs）及與C19orf33 相關(guān)的DEGs［7］；R 軟件ggplot2 包繪制差異表達(dá)火山圖和上調(diào)及下調(diào)DEGs 的韋恩圖（Venn），確定可信的DEGs。差異表達(dá)的篩選閾值為：|log2（FC）|＞2&p.adjust＜0.05。

1.3 生存分析采用基因表達(dá)中位數(shù)作為分組依據(jù)，Kaplan?Meier 法分析不同組的OS 和PFI 的預(yù)后差異，預(yù)后數(shù)據(jù)來自《Cell》的一篇文章［8］。

1.4 差異表達(dá)及ROC分析Mann?Whitney U 檢驗探索TCGA?PAAD、GTEx 數(shù)據(jù)集胰腺癌與正常胰腺組織及腫瘤不同T 分期亞組之間的C19orf33 表達(dá)差異，R 軟件包ggplot2 繪制箱式圖。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線下面積（area under the curve，AUC）預(yù)測C19orf33 表達(dá)對患者是否罹患胰腺癌和腫瘤T 分期的診斷價值。

1.5 REACTOME 和KEGG GSEA 分析參考基因集合為MSigDB（v7.4）［9］中的c2.cp.v7.2.symbols.gmt［Curated］，每次分析重復(fù)1000 次，用Benjamini?Hochberg 方法進行P 值矯正，以標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（normalized enrichment score，NES）＞1.5，錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25 且p.adjust＜0.05作為顯著富集標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析所有統(tǒng)計學(xué)分析和可視化均使用R 軟件（v.3.6.3）進行。Excel 軟件（v2020）進行統(tǒng)計描述；χ2檢驗和Fisher 精確檢驗進行統(tǒng)計檢驗。Kaplan?Meier 法計算生存率；使用單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險模型進行生存分析。具有統(tǒng)計學(xué)意義的檢驗水準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因篩選及C19orf33 的生存分析和差異表達(dá)結(jié)果見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因篩選及C19orf33 的生存分析和差異表達(dá)結(jié)果

2.2 C19orf33 是胰腺癌OS 相關(guān)的獨立預(yù)后危險因素見表1。

表1 胰腺癌患者C19orf33 相關(guān)的基線資料表

2.3 胰腺癌患者中基于C19orf33 表達(dá)水平的REACTOME 和KEGG 功能富集分析見圖2。

圖2 REACTOME 和KEGG GSEA 分析胰腺癌中C19orf33 高、低表達(dá)組DEGs 富集的功能和通路

3 討 論

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，且當(dāng)前治療手段對PAAD 患者的總體生存率影響有限。研究表明C19orf33 高表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后較差緊密相關(guān)。然而，C19orf33在PAAD 中的臨床意義、作用和分子機制仍不明確，因此C19orf33 在胰腺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中的確切作用值得進一步研究。

在這項研究中，我們篩選發(fā)現(xiàn)C19orf33 在PAAD 中具有差異表達(dá)，進一步地，我們發(fā)現(xiàn)C19orf33 表達(dá)水平與PAAD 患者的總生存率及無進展間期呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05），同時，ROC 曲線分析也證實C19orf33 表達(dá)可作為胰腺癌理想的診斷生物標(biāo)志物。與我們研究結(jié)果相似，研究發(fā)現(xiàn)在乳頭腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌［10］中，C19orf33 高表達(dá)，且與其預(yù)后差相關(guān)。這表明C19orf33 可作為惡性腫瘤患者的預(yù)后預(yù)測標(biāo)志物。然而其具體相關(guān)作用機制尚不明確。

有研究表明C19orf33 可分別通過調(diào)節(jié)上皮?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化或與Hippo 通路YAP1 協(xié)調(diào)作用進而抑制乳腺癌細(xì)胞系或甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的進展［11］。本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)C19orf33 在神經(jīng)活性配體和受體間相互作用、趨化因子信號通路等多個信號通路上聚集，由此可見，C19orf33 在免疫相關(guān)的生物學(xué)過程中發(fā)揮著一定作用。但是C19orf33 與這些通路之間的確切相互作用關(guān)系還有待進一步的實驗驗證。

綜合上述分析，C19orf33 不僅對胰腺癌患者的疾病狀態(tài)具有診斷價值，而且是胰腺癌的獨立預(yù)后危險因素，但尚需開展更多的實驗來進一步驗證。