核聚集相關(guān)蛋白1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義*

劉雷，鄭雙英

（常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)系，湖南 常德 415006）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma,RCC）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其主要病理類型包括透明細(xì)胞癌、乳頭狀細(xì)胞癌、嗜鉻細(xì)胞癌、集合管癌和未分類癌等［1］。其中，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma,CCRCC）是最常見的類型，約占RCC 總數(shù)80%［2］。CCRCC 分子機(jī)制尚未完全闡明，其發(fā)生與多種基因突變和異常表達(dá)有關(guān)。FIORENTINO 等［3］發(fā)現(xiàn)，APC、ERBB4、RB1、EGFR和FGFR3突變?cè)贑CRCC 中十分頻繁。CCRCC 起病隱匿，缺乏早期診斷性腫瘤標(biāo)志物，約有30% 的CCRCC 患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移［4］。因此，開發(fā)新的腫瘤標(biāo)志物用于CCRCC 診斷具有重要意義。

核聚集相關(guān)蛋白 1（nucleus accumbensassociated protein 1,NAC1）是一種核蛋白，屬于BTB/POZ-ZF 結(jié)構(gòu)域家族成員，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞形態(tài)維持等功能［5］。NAC-1在前列腺癌、卵巢癌中發(fā)揮重要作用［6-7］。目前，關(guān)于NAC1 表達(dá)與CCRCC 關(guān)系的研究較少，本研究擬對(duì)此進(jìn)行初步探討，以期提高CCRCC 早期診斷率，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月至2016 年12 月在常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院連續(xù)收集的110 例患者CCRCC組織及鄰近正常組織標(biāo)本。所有患者行根治性腎切除術(shù)，未進(jìn)行放療、化療、靶向治療等新輔助治療，病理診斷為CCRCC。采集患者臨床及病理資料，包括年齡、性別、病理分級(jí)、臨床分期、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí)間及生存時(shí)間。其中，男性73 例，女性37 例；平均年齡（57.32±11.05）歲；病理分級(jí)：＞Ⅱ級(jí)20 例，≤Ⅱ級(jí)90 例。按照2010 年創(chuàng)立的美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)TNM 分期將RCC 患者分為Ⅰ～Ⅳ期［8］，其中Ⅰ期70 例，Ⅱ期25 例，Ⅲ期12 例，Ⅳ期3 例。平均隨訪（48.61±14.95）個(gè)月后，18 例（16.8%）患者術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。其中，16 例（14.5%）患者死于CCRCC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。平均總生存期（OS）（26.38±6.33）個(gè)月，2 年和5 年疾病特異性生存率（DSS）分別為94.5% 和85.5%。第1、2 年每年隨訪4 次，第3～5 年每年隨訪2 次。隨訪內(nèi)容包括病史采集、體格檢查、胸部X 射線檢查、腹部多普勒超聲或CT 檢查交替進(jìn)行，并根據(jù)腎功能血檢結(jié)果進(jìn)行腎小球?yàn)V過率檢查。本研究通過常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)（IHC）和染色結(jié)果評(píng)估

切片常規(guī)脫蠟脫水，并采用檸檬酸進(jìn)行抗原修復(fù)。隨后將切片放入3%過氧化氫溶液中，室溫25 min；然后放入PBS（pH 值7.4）中15 min。將BSA（3%，美國Sigma 公司）均勻加入組織中，室溫下密封30 min。用抗NAC1 抗體（ab8192，美國Abcam 公司）（1∶200 稀釋）在4℃下孵育8 h，再用二抗（HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG，武漢塞維爾生物科技有限公司）在室溫下孵育50 min。然后將所有切片用DAB 處理5 min，隨后用蘇木精-伊紅反染；最后將切片分別置于無水乙醇和二甲苯中進(jìn)行脫水處理。

每組中的每個(gè)切片隨機(jī)選擇＞3 個(gè)200 倍視野進(jìn)行攝影。用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD，美國）計(jì)算組織的綜合光密度（IOD）和像素面積（AREA），平均密度（MD）等于IOD 除以AREA。NAC1 表達(dá)由兩位病理學(xué)家根據(jù)IHC 圖像和相應(yīng)的MD 值進(jìn)行量化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。相關(guān)樣本W(wǎng)ilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)用于分析癌組織與相鄰組織間NAC1 表達(dá)的差異，獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon signedrank 檢驗(yàn)用于比較不同臨床病理特征的CCRCC 組織間NAC1 表達(dá)情況；采用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-rank 檢驗(yàn)分析NAC1 表達(dá)與CCRCC 患者預(yù)后關(guān)系，采用Cox 回歸的單因素和多因素分析來評(píng)估CCRCC 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測NAC1 在CCRCC 中表達(dá)

分別分析CCRCC 組織和相鄰組織的染色情況，陽性染色強(qiáng)度分別定義為0、1、2、3 為無染色、淺黃色、黃褐色和棕色（見圖1、圖2）。CCRCC 組織中NAC1 平均表達(dá)量為（1.06±0.88），相鄰組織為（1.91±1.02）。相關(guān)樣本W(wǎng)ilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)顯示，NAC1 在CCRCC 組織中表達(dá)量低于相鄰組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=6.040,P＜0.001）。

圖1 CCRCC 組織中NAC1 的表達(dá)

圖2 CCRCC 癌旁正常組織中NAC1 的表達(dá)

2.2 CCRCC 中NAC1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

采用獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)比較不同年齡、性別、腫瘤病理分級(jí)和TNM 分期的NAC1表達(dá)情況。結(jié)果顯示NAC1 表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；病理分級(jí)為≤Ⅱ級(jí)患者NAC1 表達(dá)量高于＞Ⅱ級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但NAC1 在CCRCC 中表達(dá)與年齡、性別和TNM 分期無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 CCRCC 中NAC1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表1 CCRCC 中NAC1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

2.3 NAC1 表達(dá)與CCRCC 預(yù)后的關(guān)系

本研究110 例患者中，16 例患者死于CCRCC遠(yuǎn)處 轉(zhuǎn)移，OS 為（26.38±6.33）個(gè)月。根據(jù)NAC1 表達(dá)，將患者分為NAC1 低表達(dá)組和NAC1高表達(dá)組。Kaplan-Meier 生存率和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)顯示，NAC1 高表達(dá)組預(yù)后優(yōu)于NAC1 低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）見圖3。

圖3 Kaplan-Meier 曲線分析NAC1 表達(dá)與癌癥特異性生存率的關(guān)系

采用Cox 回歸單因素和多因素分析評(píng)估CCRCC 預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素，單因素Cox 回歸分析顯示，病理分級(jí)、TNM 分期和NAC1 表達(dá)是RCC 預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素（P＜0.05）。多因素Cox 回歸分析顯示，NAC1 表達(dá)和TNM 分期是RCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。NAC1 表達(dá)量低和Ⅲ、Ⅳ期RCC 患者預(yù)后較差。見表2。

表2 CCRCC 預(yù)后因素分析參數(shù)

3 討論

RCC 是一種起源于腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。由于RCC 一般缺乏早期癥狀，當(dāng)患者出現(xiàn)RCC 的典型三聯(lián)征（即腰痛、血尿、腹部腫塊）時(shí)，往往已是癌癥晚期［9］。為了排除不同細(xì)胞類型對(duì)研究的影響，本研究只納入病理類型確認(rèn)的CCRCC 患者。CCRCC的臨床分期主要通過增強(qiáng)CT 掃描確定，增強(qiáng)CT掃描可以評(píng)價(jià)RCC 局部浸潤、淋巴腺病變和轉(zhuǎn)移情況。本研究納入Ⅰ期70 例、Ⅱ期25 例、Ⅲ期12 例和Ⅳ期3 例。為排除手術(shù)方法對(duì)RCC 預(yù)后的影響，本研究納入患者均行根治性腎切除術(shù)。

術(shù)后隨訪是治療RCC 的重要環(huán)節(jié)，RCC 患者應(yīng)接受專業(yè)泌尿外科醫(yī)生隨訪。通過對(duì)臨床癥狀和體征、腎功能、局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況隨訪，可以獲得重要的預(yù)后信息。以往研究發(fā)現(xiàn)，接受定期隨訪患者較未接受定期隨訪患者OS 更長［10］。本研究110 例患者中，18 例復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移?？倧?fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率為16.8%，與以往研究相似。BEISLAND等［10］前瞻性地隨訪了195 例RCC 患者，31 例患者在隨訪期間出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，總體復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率約為15.9%。18 例復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者中，16 例（14.5%）患者死于CCRCC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，OS 為（26.38±6.33）個(gè)月，5 年疾病DSS 為85.5%。根據(jù)美國SEER 數(shù)據(jù)庫，2007―2013 年美國RCC 患者的5 年生存率約為74%。本研究預(yù)后好于以往數(shù)據(jù)，這可能與對(duì)RCC 早期診斷和治療及晚期RCC 靶向治療的原因有關(guān)。

NAC1 基因是一種腫瘤抑制基因，在DNA 損傷修復(fù)反應(yīng)和維持細(xì)胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性方面起著重要作用。由于NAC1 表達(dá)不足，腫瘤細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致基因突變，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果表明，NAC1 表達(dá)量在RCC 組織中明顯低于鄰近組織。NAC1 基因的低表達(dá)或缺失主要由基因突變引起。COMSIC數(shù)據(jù)庫對(duì)169 個(gè)腫瘤的500 多個(gè)蛋白激酶突變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NAC1 基因突變頻率在所有基因中排名第3 位。NAC1 在許多腫瘤組織中表達(dá)量較低或存在缺陷。FERRIS 等［11］比較了165 例非小細(xì)胞肺癌患者的肺癌組織和正常肺組織中NAC1 表達(dá)情況，結(jié)果顯示21.8% 肺癌組織中無NAC1 表達(dá)，NAC1 在腫瘤組織中表達(dá)明顯低于正常肺組織。WANG 等［12］對(duì)早期乳腺癌的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，NAC1 在癌組織中表達(dá)明顯低于正常乳腺上皮組織。類似的研究表明，NAC1 在胃癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌中表達(dá)低于正常組織［13-15］。NAC1 表達(dá)與RCC 的關(guān)系研究不多。

NAC1 表達(dá)與腫瘤的臨床病理因素相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC1 表達(dá)與RCC 的病理分級(jí)有關(guān)，但與年齡、性別和臨床分期無關(guān)。NAC1 在病理＞Ⅱ級(jí)RCC 組織中表達(dá)明顯低于≤Ⅱ級(jí)RCC 組織。經(jīng)過大量文獻(xiàn)查閱，筆者未發(fā)現(xiàn)關(guān)于RCC 中NAC1 表達(dá)與臨床病理數(shù)據(jù)關(guān)系的研究。然而關(guān)于NAC1 表達(dá)與其他癌癥的臨床病理間的關(guān)系有大量的文獻(xiàn)，結(jié)果也較相似。NAC1 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)量較低，且與結(jié)直腸癌的病理分級(jí)相關(guān)。NAC1 在高等級(jí)腫瘤組織中表達(dá)量明顯低于低等級(jí)腫瘤組織。NAC1 表達(dá)與包括RCC 在內(nèi)的多種腫瘤組織的腫瘤分化呈正相關(guān)關(guān)系，本研究證明了這一點(diǎn)。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，NAC1 在RCC 中表達(dá)與RCC 患者的預(yù)后有關(guān)。NAC1 表達(dá)量低的患者總生存期較短。NAC1 表達(dá)與RCC 預(yù)后的關(guān)系報(bào)道較少。但也有報(bào)道稱，NAC1 表達(dá)與其他腫瘤的預(yù)后有關(guān)。TNM 分期和NAC1 表達(dá)是獨(dú)立預(yù)后因素。本研究發(fā)現(xiàn)NAC1 表達(dá)與TNM 期是RCC 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與上述研究結(jié)果基本一致。因此，提示NAC1 基因在RCC 中具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值，可作為RCC 的潛在治療靶點(diǎn)。

本研究存在一些局限性：首先，該研究受限于相對(duì)較小的樣本；第二，一些因素可能未被納入，如腫瘤的位置；第三，雖然數(shù)據(jù)是在前瞻性維護(hù)的數(shù)據(jù)庫中仔細(xì)收集，但使用回顧性分析存在一些偏差。盡管有這些局限性，但筆者明白這項(xiàng)研究結(jié)果對(duì)RCC 的治療具有重要意義，然而需要更多樣本的前瞻性研究。

綜上所述，NAC1 表達(dá)水平可以作為RCC 預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。NAC1 表達(dá)水平低的患者可能有較短的總生存期。隨著對(duì)RCC 潛在致病機(jī)制的進(jìn)一步了解，NAC1 可作為RCC 新的生物標(biāo)志物和潛在的分子治療靶點(diǎn)。