1-芘丁酸人工抗原的制備及鑒定

孔蒙蒙， 黃忠民， 鄧瑞廣， 索 標(biāo)，劉情情1，，4， 胡驍飛， 王 娜*，4

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 河南鄭州 450002；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南鄭州 450002；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南鄭州 450002；4. 鄭州市營養(yǎng)與健康食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002）

1-芘丁酸（PBA）分子式為C20H16O2，屬于多苯環(huán)芳香烴（簡稱多環(huán)芳烴，是由兩個(gè)以上苯環(huán)稠和而成的有機(jī)物），結(jié)構(gòu)式見圖1。 多環(huán)芳烴具有很強(qiáng)的致癌性、致畸性和致突變性[1-2]，主要通過水、空氣和食物進(jìn)入人體，致使DNA 發(fā)生突變產(chǎn)生癌細(xì)胞，對人類的身體健康產(chǎn)生巨大威脅。 1-芘丁酸是多環(huán)芳烴最常見的一種衍生物， 它對人體的血液和神經(jīng)也存在嚴(yán)重危害[3-4]。

圖1 1-芘丁酸的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formula of 1-pyrenebutyric acid

常見的多環(huán)芳烴檢測方法主要有色譜法、色譜衍生法、毛細(xì)管電泳法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法等[5]，這些方法雖然有效，但耗時(shí)長、費(fèi)用高、操作復(fù)雜、對檢測人員的要求相當(dāng)高，浪費(fèi)人力和物力且不適用于大量樣品的快速檢測[6-8]。 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是利用抗原抗體的特異性結(jié)合來對待測物質(zhì)進(jìn)行檢測[9-11]，它具有簡單、快速、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量樣品的快速檢測[12-13]。 因此如何實(shí)現(xiàn)ELISA 快速檢測1-芘丁酸就尤為重要。

1-芘丁酸屬于小分子基團(tuán)， 是半抗原分子，本身不具有免疫學(xué)活性，必須將其和載體蛋白等大分子偶聯(lián)在一起，合成完全人工抗原，才會產(chǎn)生免疫學(xué)活性。 EDC 法是最常見的偶聯(lián)方法，其最早運(yùn)用于有機(jī)化學(xué)和藥化學(xué)領(lǐng)域。EDC 化學(xué)性質(zhì)相對比較活躍，可以與半抗原上的氨基或者羧基發(fā)生反應(yīng)形成肽鍵，此方法簡便，偶聯(lián)效率相對較高。 1-芘丁酸由4 個(gè)苯環(huán)加羧酸分子稠合而成，其分子上含有活潑的羧基， 因此選用EDC 法將其與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。

通過制備1-芘丁酸人工抗原，并對其性質(zhì)進(jìn)行鑒定，為1-芘丁酸免疫學(xué)快速檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1-芘丁酸：Alfa Aesar 公司產(chǎn)品； 牛血清蛋白（BSA）、 雞卵清白蛋白 （OVA）、 完全弗氏佐劑（FCA）、 不完全弗氏佐劑 （FIA）：Sigma 公司產(chǎn)品；PBS（磷酸鹽緩沖液0.01 mol/L）、包被液CBS（碳酸鹽緩沖液0.05 mol/L）、PBST（PBS 與吐溫20 體積比為2 000∶1）、 封閉液 （含有體積分?jǐn)?shù)5%豬血清的PBST）、顯色液（V3∶V4=1∶1）、終止液（2 mol/L 的硫酸溶液55～56 mL 稀釋至500 mL）、雙蒸水等：均為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級BALB/c 雌性小鼠（7 周齡）：鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 EDC法合成抗原稱取10 mg PBA 溶解于1 mL 二甲基甲酰胺（DMF），至質(zhì)量濃度為10 mg/mL，加入等摩爾質(zhì)量的N-羥基琥珀酰亞胺 （NHS）和EDC， 室溫?cái)嚢?.5 h； 稱取14.4 mg BSA 溶解于2 mL PBS 中， 將19.5 mg OVA 溶解于3 mL PBS 中；將上述PBA 溶液等分成2 份， 分別沿壁緩慢加入BSA 溶液和OVA 溶液，保持澄清；室溫下攪拌反應(yīng)72 h 后裝入透析袋，4 ℃PBS 透析3 d，一天換3 次透析液，5 000 r/min 離心10 min，棄去沉淀，取上清液，在－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 紫外掃描鑒定配制相同質(zhì)量濃度的PBA、PBA-BSA（見圖2）、BSA 溶液，采用紫外掃描儀觀察220～350 nm 處的特征值和最大吸收峰[14]。

圖2 PBA-BSA 抗原合成圖Fig. 2 Synthesis of PBA-BSA antigen

1.3.3 SDS-PAGE分析采用體積分?jǐn)?shù)12%的分離膠、體積分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠，蛋白質(zhì)3～5 μg，上樣量10～20 μL，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓100 V，考馬斯亮藍(lán)染色1～2 h，脫色過夜，中間不定時(shí)更換脫色液，拍照，根據(jù)相對分子質(zhì)量大小和條帶變化判斷是否偶聯(lián)成功[15]。

1.3.4 動(dòng)物免疫取7 周齡BALB/c 雌性小鼠6只，分高、低劑量兩組，每組3 只。 采用免疫球蛋白，高劑量組每只40 μg，低劑量組每只10 μg，每只背部皮下多點(diǎn)注射200 μL。 抗原用高壓滅菌PBS 稀釋并與等量的弗氏佐劑混合，第1 次免疫用完全弗氏佐劑（FCA），第2 次到第4 次用不完全弗氏佐劑（FIA）。 用乳化器將其乳化到取一點(diǎn)放入水中，不再散開或者散開速度緩慢即可。 每次免疫間隔3 周，免疫4 次。

1.3.5 多克隆抗體的制備及鑒定第4 次免疫10 d 后，對小鼠進(jìn)行斷尾取血，每只小鼠尾部采血10 μL 溶到990 μL PBS 中，冷凍離心機(jī)5 000 r/min 離心10 min，取上清液得到多克隆抗體（PBA-pAb），并對其效價(jià)和抑制價(jià)進(jìn)行測定。用包被液CBS 稀釋包被原PBA-OVA， 包被原質(zhì)量濃度為4 μg/mL，每孔50 μL， 置于37 ℃恒溫箱2 h，PBST 洗板6 次晾干， 加入含有體積分?jǐn)?shù)5%豬血清的封閉液， 每孔175 μL， 置于37 ℃恒溫箱內(nèi)1 h，PBST 洗板6 次，晾干，置于4 ℃冰箱中備用。

1） PBA-pAb 效價(jià)的測定 采用ELISA 法對PBA-pAb 的效價(jià)進(jìn)行測定。 每孔加入50 μL PBS，取50 μL 稀釋100 倍的PBA-pAb 加入第1 孔，依次向下倍比稀釋，設(shè)有陰性孔（NC）和空白孔（BC），置于37 ℃恒溫箱內(nèi)15 min，PBST 洗板6 次晾干。羊抗小鼠酶標(biāo)二抗（GaMIgG-HRP）和體積分?jǐn)?shù)5%豬血清的PBST 以體積比1∶1 000 混合， 每孔50 μL， 置于37 ℃恒溫箱內(nèi)30 min，PBST 洗板6 次晾干。加入顯色液，每孔50 μL，避光顯色10 min。加入終止液， 每孔50 μL。 若待測孔的OD450≥NC 孔OD450的2.1 倍且待測孔的值大于0.2， 則說明待測孔為陽性[16]，以陽性孔最小OD450所對應(yīng)的多抗血清稀釋倍數(shù)作為血清效價(jià)。

2） PBA-pAb 抑制價(jià)的測定 采用阻斷ELISA對PBA-pAb 的抑制價(jià)進(jìn)行測定。 加入OD450在1.0左右的PBA-pAb，每孔50 μL，加入不同質(zhì)量濃度（分別是600、300、150、75、37.5、18.75、9.375、4.687 5、2.344、1.72、0 ng/mL(陽性孔）)的PBA 標(biāo)準(zhǔn)品作為抑制劑，每孔50 μL，設(shè)有陰性孔（NC）和空白孔(BC)，其余操作過程與步驟1）一致。 以PBA 溶液質(zhì)量濃度的lg 值為橫坐標(biāo)，抑制價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制出抑制曲線的變化圖， 根據(jù)抑制曲線推導(dǎo)出回歸方程，得出PBA-pAb 對PBA 50%抑制時(shí)的PBA 質(zhì)量濃度（IC50），以此來衡量多抗血清的敏感性高低。 PBA-pAb抑制價(jià)的計(jì)算公式如下：

式中：S 為PBA-pAb 抑制價(jià)；B 為PBA 不同質(zhì)量濃度時(shí)待測孔的OD450；B0為PBA 質(zhì)量濃度為0 時(shí)待測孔OD450。

3） 多抗血清特異性測定 采用間接競爭ELISA 測定PBA-pAb 與PBA 的類似物1-芘甲醇、1-芘甲醛、苯并芘、菲、萘、芘以及BSA 和OVA 之間的交叉反應(yīng)，具體操作過程與步驟2）相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外掃描鑒定

紫外掃描法是通過分析抗原與載體蛋白在220～350 nm 波長范圍內(nèi)最大吸收峰的差別來判斷是否偶聯(lián)成功。 當(dāng)其最大吸收峰發(fā)生偏移時(shí)，吸收波長沒有重合，則證明抗原偶聯(lián)成功[19-20]。 BSA、PBA-BSA、PBA 在220～350 nm 處的波長變化見圖3。 BSA、PBA-BSA、PBA 的最大吸收峰出現(xiàn)變化，PBA-BSA 與BSA 和PBA 的吸收峰并沒有發(fā)生重合，初步證明抗原偶聯(lián)成功。

圖3 BSA、PBA-BSA、PBA 紫外掃描鑒定圖Fig. 3 UV scanning identification of BSA, PBA-BSA and PBA

2.2 SDS-PAGE 鑒定結(jié)果

SDS-PAGE 鑒定法則是通過觀察抗原分子與載體蛋白相對分子質(zhì)量的大小以及目的條帶的位置來判斷是否偶聯(lián)成功。 當(dāng)目的條帶出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象或位置發(fā)生偏移時(shí)， 則證明抗原偶聯(lián)成功。由圖4 可知，BSA 的泳動(dòng)速度明顯大于PBA-BSA的泳動(dòng)速度，PBA-BSA 的相對分子質(zhì)量大于BSA的相對分子質(zhì)量，初步證明抗原偶聯(lián)成功。

圖4 SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖Fig. 4Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) result

2.3 PBA-pAb 的鑒定結(jié)果分析

2.3.1 PBA-pAb 效價(jià)的測定結(jié)果由表1 可知，6只小鼠之間存在差別， 其中效價(jià)最好的是L1、H1、H2，可高達(dá)12 800。 其中L2、L3、H3 稍微低一些，但6 只小鼠免疫效價(jià)均已超過1 000，說明對6 只小鼠進(jìn)行免疫原注射后，免疫效果良好。

表1 PBA-pAb 效價(jià)的測定結(jié)果Table 1 Results of PBA-pAb titer

2.3.2 PBA-pAb 抑制價(jià)的測定結(jié)果免疫學(xué)方法是對偶聯(lián)成功的抗原免疫BALB/c 小鼠進(jìn)行斷尾采血， 通過測定其PAB-pAb 是否具有效價(jià)和敏感性來判斷抗原是否偶聯(lián)成功。由表2 可知，6 只小鼠對PBA 均有抑制，其中H1 小鼠的抑制效果最好。從圖5 可知， 其線性回歸方程為y=-0.354 11x+0.906 1，R2=0.973 6，其中，x 為lg ρPBA，y 為抑制價(jià)，曲線斜率越大，IC50越小，即制備的抗體越敏感。 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得IC50=14.31 ng/mL。 綜合來看，H1 小鼠的PBA-pAb 對PBA 最為敏感， 同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了紫外掃描和SDS-PAGE 的結(jié)果，證明抗原偶聯(lián)成功。

圖5 H1 小鼠抑制曲線圖Fig. 5 H1 mouse inhibition curve

表2 PBA-pAb 抑制價(jià)（OD450）的測定結(jié)果Table 2 Results of inhibition of PBA-pAb

2.3.3 PBA-pAb 特異性測定結(jié)果 PBA-pAb特異性測定結(jié)果見表3。 交叉反應(yīng)率（CR）是指標(biāo)準(zhǔn)抗原與同標(biāo)準(zhǔn)抗原類似物與50%抗體結(jié)合時(shí)質(zhì)量濃度的比值， 即待測物IC50與其他抑制物IC50比值的百分?jǐn)?shù)。 通過ELISA 法分別測定各抑制物的IC50，計(jì)算交叉反應(yīng)率。 交叉反應(yīng)率小說明抗體特異性高，高特異性可提高檢測方法的靈敏度，從而決定單克隆抗體的真正價(jià)值。1-芘丁酸的IC50為14.31 ng/mL，與1-芘甲醇、1-芘甲醛以及芘類物質(zhì)的交叉反應(yīng)率≤14.40%，與菲、萘、苯并芘、BSA 以及OVA 的交叉反應(yīng)率均小于0.05%，特異性良好。

表3 PBA-pAb 特異性測定結(jié)果Table 3 PBA-pAb specific determination results

3 結(jié) 語

通過EDC 法制備出1-芘丁酸人工抗原， 經(jīng)過紫外掃描鑒定、SDS-PAGE 以及免疫學(xué)鑒定方法初步證明了PBA 人工抗原偶聯(lián)成功。小鼠經(jīng)免疫后得到效價(jià)高達(dá)12 800，IC50=14.31 ng/mL 的PBA-pAb；與多環(huán)芳烴1-芘甲醇、1-芘甲醛、 芘的交叉反應(yīng)率小于14.40%，與菲、萘、苯并芘、BSA 以及OVA 交叉反應(yīng)率均小于0.05%。1-芘丁酸人工抗原偶聯(lián)成功，并制備出了敏感性良好的PBA-pAb， 為1-芘丁酸單克隆抗體的篩選和食品安全快速檢測方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。