基于計(jì)算機(jī)虛擬技術(shù)研究牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味肽的抑菌活性差異

楊保軍， 梁 琪*， 宋雪梅

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2. 甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070）

抗菌肽主要來(lái)自乳源蛋白水解物[1-2]，已證明乳鐵蛋白和酪蛋白片段具有抑菌活性。 1930 年Jones等首次從牛乳中發(fā)現(xiàn)抑制鏈球菌的抗菌性物質(zhì)，命名為乳鐵蛋白[3]。 1974 年，Hill 等用凝乳酶水解牛乳αS1-酪蛋白，得到第一個(gè)對(duì)應(yīng)于αS1-酪蛋白1～23 位殘基的抗菌肽（isracidine）[4]。2005 年Mccann 等用胃蛋白酶酶解牛乳酪蛋白， 得到對(duì)應(yīng)于αS1-酪蛋白99～109 位殘基的新型抗菌肽（Cp1）和對(duì)應(yīng)于αS2-酪蛋白183～207 位殘基的抗菌肽（Cp2）[5]。 大多數(shù)抗菌肽在自然pH 下帶正電荷， 正電荷數(shù)目的增加不僅可以提高抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)合能力，還能有效降低抗菌肽的殺菌濃度[6]。 Sedaghati 等研究發(fā)現(xiàn)肽的疏水性對(duì)抑菌活性有影響，抗菌肽的N 末端富含親水性氨基酸殘基，如賴氨酸、精氨酸等，C 末端富含疏水性氨基酸殘基，如丙氨酸、甘氨酸，且通常被酰胺化[7]。 此外，抗菌肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受肽鏈長(zhǎng)度的影響， 從而抑菌活性也受到肽鏈長(zhǎng)度的影響。Phambu 等通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、熱重分析（TGA）及示差掃描量熱法（DSC）研究表明理想的肽鏈長(zhǎng)度（肽段含有6個(gè)氨基酸）可以增加分子內(nèi)氫鍵作用，從而保持肽鏈的穩(wěn)定性， 進(jìn)而與陰離子的脂質(zhì)更好地結(jié)合，發(fā)揮更強(qiáng)的抑菌作用[8]。 Théolier 等研究了加拿大5 種市售干酪 （Mozzarella，Gouda，Swiss，old Cheddar，medium Cheddar）脫鹽純化的水溶性提取物后發(fā)現(xiàn)，只有Mozzarella 和Gouda 干酪對(duì)李斯特菌ivanovii和大腸桿菌MC4100 有明顯抑制作用[9]。項(xiàng)目組前期研究牦牛乳硬質(zhì)干酪水溶性肽粗提物的抑菌活性發(fā)現(xiàn)， 其對(duì)大腸桿菌的最大抑菌圈直徑為15.91 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑為16.50 mm， 對(duì)沙門氏菌的最大抑菌圈直徑為16.03 mm。Fontenele 等研究了Coalho 干酪酪蛋白衍生肽的生物活性后發(fā)現(xiàn)，β-酪蛋白肽（193～209 位）具有免疫調(diào)節(jié)、抑菌和降壓活性，αS1-酪蛋白肽（1～23 位）是一種具有免疫調(diào)節(jié)活性和抑菌活性的肽片段，這些結(jié)果被確定為巴西干酪的權(quán)威性標(biāo)志[10]。 當(dāng)然牦牛乳硬質(zhì)干酪中的肽粗提物也具有類似的抑菌、抗氧化和降壓活性等。 Fialho 等結(jié)合MALDI-TOF/TOF、MASCOT Daemon 與UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)3 種市售Minas 干酪中提取的可溶性肽進(jìn)行測(cè)序和鑒定，發(fā)現(xiàn)起源于αS1-酪蛋白的肽序列PKHPIKHQ、RPKHPIKHQG、RPKHPIKHQGLPQ 和RPKHPIKHQ GLPQE 是屬于Isracidine 的片段， 另外發(fā)現(xiàn)了兩種β-酪蛋白衍生的新抗菌肽序列HQPHQPLPPT 和MHQPHQPLPPT[11]。 宋雪梅等經(jīng)葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）色譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）從牦牛乳硬質(zhì)干酪中鑒定出14 種苦味肽， 但肽與不同菌體蛋白之間相互作用的抑菌機(jī)理尚不清楚[12]。

基于結(jié)構(gòu)的藥物研究和設(shè)計(jì)主要采用的是分子對(duì)接技術(shù)。 分子對(duì)接就是把配體分子放在受體活性位點(diǎn)的位置，然后按照幾何互補(bǔ)、能量互補(bǔ)和化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)配體與受體相互作用的好壞，并找到兩個(gè)分子間的最佳結(jié)合模式。 目前對(duì)牦牛乳干酪中蛋白質(zhì)降解肽抑菌活性的研究仍局限于其粗提物，關(guān)于凈電荷、疏水性和疏水力矩等因素對(duì)肽段抑菌活性的影響鮮有報(bào)道。 因此，運(yùn)用相關(guān)生物信息學(xué)軟件計(jì)算牦牛乳硬質(zhì)干酪中4種苦味肽（RPKHPIK、TPVVVPPFL、VYPFPGPIPN 和SLVYPFPGPIPN）的分子特性，運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)從分子水平研究苦味肽抑菌活性、研究配體（苦味肽）和受體（不同菌體蛋白）間相互作用的分子機(jī)制，通過(guò)BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)表征肽段抑菌活性。 為理論水平分析和分子水平解釋干酪苦味肽的抑菌活性提供了有力支撐， 為完善BIOPEP 的抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)工具和材料

實(shí)驗(yàn)工具：ChemBioDraw14.0.0.117（化學(xué)結(jié)構(gòu)繪圖軟件），Discovery Studio Client v16.1.0 （DS）（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件）；實(shí)驗(yàn)材料：以項(xiàng)目組前期從牦牛乳硬質(zhì)干酪中鑒定出的4 種苦味肽為研究對(duì)象，4種苦味肽的基本信息見(jiàn)表1 （表中Q 為氨基酸自由能改變量與肽鏈中氨基酸殘基摩爾數(shù)的比值）。

表1 牦牛乳硬質(zhì)干酪中苦味肽氨基酸序列及其Q 值Table 1 Amino acid sequence and Q value of bitter peptide in yak milk hard cheese

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦味肽分子特性計(jì)算用Peptide Property Calculator 軟件計(jì)算4 種苦味肽的理論相對(duì)分子質(zhì)量和凈電荷[13]；用HeliQuest 軟件計(jì)算4 種苦味肽的疏水性指數(shù)和疏水力矩[14]；用PEPTIDE 2.0 軟件計(jì)算4 種苦味肽的疏水性氨基酸比例[13]；用PEPTIDE 2.0 軟件預(yù)測(cè)肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)[15]。

圖1 RK7、TL9、VN10 和SN12 的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of RK7, TL9, VN10 and SN12

1.2.3 準(zhǔn)備受體蛋白從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)（www.rcsb.org） 中下載大腸桿菌（PDB ID：5BNS，分辨率為2.2 ?）、金黃色葡萄球菌（PDB ID：4ALM， 分辨率為2.45 ?） 和沙門氏菌 （PDB ID：6CH3，分辨率為2.68 ?）蛋白晶體的X 射線衍射三維結(jié)構(gòu)，并用DS 軟件處理蛋白質(zhì)，去除所有的水分子，去除蛋白質(zhì)多構(gòu)象，補(bǔ)充完整的氨基酸殘基，為蛋白質(zhì)加氫等（1?=0.1 nm）。

1.2.4 分子對(duì)接基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)工具LibDock 適用于對(duì)大規(guī)模數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行快速精確地虛擬篩選[16]，因此，選擇DS 軟件中的LibDock 程序進(jìn)行分子對(duì)接研究。對(duì)接前用DS 軟件中的Define 和Edit Binding Site 工具尋找菌體蛋白的可能結(jié)合部位，對(duì)接時(shí)將每個(gè)分子生成的對(duì)接構(gòu)象數(shù)目設(shè)置為10，其他參數(shù)均為系統(tǒng)默認(rèn)值，對(duì)接后根據(jù)對(duì)接得分和結(jié)合能，確定苦味肽在菌體蛋白活性部位的最佳對(duì)接位姿；DS 軟件還用于識(shí)別肽與菌體蛋白結(jié)合位點(diǎn)上殘基之間的氫鍵、鹽橋和范德華力等。

1.2.5 肽數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)根據(jù)文獻(xiàn)[17]對(duì)BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)的描述，結(jié)合分子對(duì)接情況，將牦牛乳硬質(zhì)干酪中4 種苦味肽與BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)中的抗菌肽序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)苦味肽段中具有抑菌活性的肽序列來(lái)表征和預(yù)測(cè)苦味肽的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦味肽分子特性分析

有關(guān)研究表明，決定抗菌肽抑菌活性的因素包括肽的疏水性強(qiáng)弱、含正電荷數(shù)、疏水力矩和二級(jí)結(jié)構(gòu)等[14]，另外，具有α-螺旋構(gòu)型的抗菌肽有較高的抑菌活性[15]。 4 種苦味肽分子特性的計(jì)算結(jié)果表明（見(jiàn)表2），RK7 含有3 個(gè)堿性氨基酸和3 個(gè)疏水性氨基酸，所帶凈電荷為3.1，疏水性氨基酸比例為42.86%，是4 種苦味肽中疏水性氨基酸含量最低的肽段；TL9 含有8 個(gè)疏水性氨基酸，疏水性氨基酸比例為88.89%，是4 種苦味肽中疏水性氨基酸含量最高的肽段；VN10 和SN12 分別含有7 個(gè)和8 個(gè)疏水性氨基酸，疏水性氨基酸比例為70.00%和66.67%，疏水力矩分別為0.189 和0.372；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)這4 種苦味肽均以無(wú)規(guī)則卷曲形式存在。 所以可排除RK7、TL9、VN10 和SN12 二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其抑菌活性的影響，即這4 種苦味肽的抑菌活性很大程度上可能取決于其疏水性、正電荷數(shù)和疏水力矩。 將通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件和分子對(duì)接工具對(duì)RK7、TL9、VN10 和SN12 的抑菌活性進(jìn)行研究。

表2 苦味肽的理化特性Table 2 Physicochemical properties of the bitter peptides

2.2 尋找受體結(jié)合區(qū)

利用DS 軟件中的Define 和Edit Binding Site工具尋找受體中的空腔，以此來(lái)確定受體中可能的結(jié)合部位。 圖2（a）為5BNS 的三維構(gòu)象，經(jīng)過(guò)處理后系統(tǒng)視圖中自動(dòng)添加9 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（Site1～9），即找到了9 個(gè)可能的結(jié)合區(qū)域；圖2（b）為4ALM 的三維構(gòu)象， 經(jīng)過(guò)處理后系統(tǒng)視圖中自動(dòng)添加31 個(gè)結(jié)合位點(diǎn) （Site1～31）， 即找到了31 個(gè)可能的結(jié)合區(qū)域；圖2（c）為6CH3 的三維結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)處理后系統(tǒng)視圖中自動(dòng)添加15 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（Site1～15），即找到了15 個(gè)可能的結(jié)合區(qū)域。

圖2 從受體中尋找可能結(jié)合區(qū)域Fig. 2 Searching for possible binding regions from receptor

2.3 分子對(duì)接

2.3.1 大腸桿菌（5BNS）與配體的作用機(jī)制通過(guò)DS 軟件中的LibDock 對(duì)接程序研究了RK7、TL9、VN10 和SN12 對(duì)5BNS 的抑制機(jī)制， 對(duì)接后RK7、TL9 與5BNS 成功形成配體-受體復(fù)合物構(gòu)象，最佳對(duì)接構(gòu)象見(jiàn)圖3 和圖4。

RK7 與5BNS 對(duì)接后得到26 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，這些構(gòu)象均位于Site7 區(qū)域（X：6.28 Y：41.91 Z：28.88 R：9.00 ?），最佳對(duì)接構(gòu)象的對(duì)接得分為163.023，結(jié)合能為5 622.91 kJ/mol。 圖3 為RK7 與5BNS 對(duì)接形成的最佳構(gòu)象圖，結(jié)果顯示RK7 與5BNS 的氨基酸殘基Glu31（4.34 ?）、Thr35（3.90 ?）和Arg151（4.10 ?、6.48 ?）之間形成了4 個(gè)不同距離的氫鍵，其中RK7和氨基酸殘基Arg151 之間含有2 個(gè)氫鍵，與Thr35之間形成的氫鍵最短， 結(jié)合最緊密；RK7 與氨基酸殘基Trp32 （3.00 ?、3.89 ?）、Asp150 （4.69 ?）和Arg151（3.32 ?）形成4 個(gè)距離不同的碳?xì)滏I，與氨基酸殘基Asp150（4.68 ?）和Arg151（3.41 ?）形成鹽橋或電荷相互作用。

圖3 RK7 與5BNS 的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用Fig. 3 Binding site and interaction between RK7 and 5BNS

TL9 與5BNS 對(duì)接后得到2 個(gè)對(duì)接構(gòu)象， 這2個(gè)構(gòu)象均位于Site7 區(qū)域（X：6.28 Y：41.91 Z：28.88 R：9.00 ?），最佳對(duì)接構(gòu)象的對(duì)接得分為148.819，結(jié)合能為8 391.90 kJ/mol。 圖4 為TL9 與5BNS 對(duì)接形成的最佳構(gòu)象圖，結(jié)果表明，TL9 與5BNS 的氨基酸殘基Asp27（4.31 ?）、Trp32（5.35 ?）、Arg36（4.05 ?）、Arg151（6.12 ?）和Asn210（5.06 ?）之間形成了5 個(gè)不同距離的氫鍵， 與Arg36 之間形成的氫鍵最短，結(jié)合最緊密；TL9 與氨基酸殘基Asp27（4.45 ?、5.02 ?）、Thr28（4.18 ?）和Gly152（2.96 ?）形成4 個(gè)距離不同的碳?xì)滏I，與氨基酸殘基Arg36（4.12 ?）形成電荷相互作用。

（2） 校對(duì)。由于WORD和WPS有區(qū)別或者WORD版本不同，PPT上會(huì)有很多字母、符號(hào)、上下標(biāo)等編輯到視頻中后不能顯示或顯示錯(cuò)誤，所以需要仔細(xì)審核、修改。每一句配音到底應(yīng)該從哪一個(gè)鏡頭到哪一個(gè)鏡頭，都需要認(rèn)真校對(duì)、精確到秒。還有一些照片或者視頻編輯出來(lái)后效果不理想，就得重新拍攝。

圖4 TL9 與5BNS 的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用Fig. 4 Binding site and interaction between TL9 and 5BNS

2.3.2 金黃色葡萄球菌（4ALM）與配體的作用機(jī)制RK7、TL9、VN10 和SN12 與4ALM 的對(duì)接構(gòu)象見(jiàn)圖5～8。RK7 與4ALM 對(duì)接后得到232 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，其中Site1 區(qū)域包含50 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site3 區(qū)域包含8個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site6 區(qū)域包含39 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site8區(qū)域包含50 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site10 區(qū)域包含16 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site15 區(qū)域包含50 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site16 區(qū)域包含16 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site19 區(qū)域包含2 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site24 區(qū)域包含1 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，最佳對(duì)接構(gòu)象位于Site8 區(qū)域 （X：-32.27 Y：13.97 Z：45.97 R：9.00 ?），對(duì)接得分為192.573，結(jié)合能為2 729.67 kJ/mol。圖5 為RK7 與4ALM 對(duì)接形成的最佳構(gòu)象圖，結(jié)果表明，RK7 與4ALM 的氨基酸殘基Leu176（4.44 ?）、Ser189（3.62 ?、4.59 ?）、Gly191（2.83 ?）、Lys209（6.03 ?）、Thr242（2.81 ?、3.90 ?）、Gly243（4.81 ?）和Asp249 （3.73 ?） 之間形成了9 個(gè)距離不同的氫鍵， 其中Ser189 和Thr242 分別參與了2 個(gè)氫鍵的形成， 在RK7 與4ALM 的相互作用中貢獻(xiàn)較大；RK7 與氨基酸殘基Thr242 （4.24 ?）、Glu244（4.19 ?）、Asp249（3.30 ?）和Ser250（4.27 ?）形成4 個(gè)距離不同的碳?xì)滏I， 與氨基酸殘基Lys209 （5.05 ?）、Glu225（7.54 ?）、Glu244（5.28 ?）、His247（4.52 ?）和Asp249（4.35 ?）形成電荷或π-Cation 相互作用。

圖5 RK7 與4ALM 的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用Fig. 5 Binding site and interaction between RK7 and 4ALM

TL9 與4ALM 對(duì)接后得到47 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，其中Site1 區(qū)域包含20 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site6 區(qū)域包含5 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site8 區(qū)域包含12 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site15 區(qū)域包含10 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，最佳對(duì)接構(gòu)象位于Site1 區(qū)域（X：-42.00 Y：-2.21 Z：32.23 R：9.00 ?），對(duì)接得分為158.314，結(jié)合能為3127.41 kJ/mol。圖6 為TL9與4ALM 對(duì)接形成的最佳構(gòu)象圖，結(jié)果顯示，TL9 與4ALM 的氨基酸殘基Lys164 （5.05 ?）、Glu168（5.04 ?）和Lys256（5.57 ?）之間形成了3 個(gè)距離不同的氫鍵；TL9 與氨基酸殘基His247（5.28 ?）形成1 個(gè)碳?xì)滏I，與Lys256（5.57 ?）形成電荷相互作用。

圖6 TL9 與4ALM 的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用Fig. 6 Binding site and interaction between TL9 and 4ALM

VN10 與4ALM 對(duì)接后得到21 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，其中Site1 區(qū)域包含20 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site8 區(qū)域包含1個(gè)對(duì)接構(gòu)象， 最佳構(gòu)象位于Site8 區(qū)域 （X：-32.27 Y：13.97 Z：45.97 R：9.00 ?）， 對(duì)接得分為179.923，結(jié)合能為162 654.67 kJ/mol。圖7 為VN10 與4ALM對(duì)接形成的最佳構(gòu)象圖， 結(jié)果表明，VN10 與4ALM的氨基酸殘基Arg184 （4.19 ?）、Gly191 （4.50 ?）、Glu244（4.76 ?）和Asp249（3.55 ?）之間形成了4 個(gè)不同距離的氫鍵；VN10 與氨基酸殘基Leu176（3.92 ?）、Gly179（3.36 ?）、Gly191（4.23 ?）、Thr242（2.90 ?）、Gly243（3.96 ?）、Glu244（5.09 ?）、His247（2.78 ?）、Asp249（4.06 ?、4.95 ?、5.34 ?）和Ser250（4.19 ?、4.25 ?） 形成碳?xì)滏I或π-Donor Hydrogen 鍵，與His247（4.73 ?）形成電荷相互作用。

圖7 VN10 與4ALM 的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用Fig. 7 Binding site and interaction between VN10 and 4ALM

SN12 與4ALM 對(duì)接后得到22 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，其中Site1 區(qū)域包含10 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site8 區(qū)域包含9個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site15 區(qū)域包含1 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site16區(qū)域包含2 個(gè)對(duì)接構(gòu)象， 最佳構(gòu)象位于Site1 區(qū)域（X：-42.00 Y：-2.21 Z：32.23 R：9.00 ?）， 對(duì)接得分為31.892，結(jié)合能為5 703.22 kJ/mol。 圖8 為SN12與4ALM 對(duì)接形成的最佳構(gòu)象圖， 結(jié)果顯示，SN12與4ALM 的氨基酸殘基Ala254（4.26 ?）和Lys256（3.89 ?、6.32 ?）之間形成了3 個(gè)距離不同的氫鍵；SN12 與氨基酸殘基Ala165 （3.45 ?）、Glu168（3.78 ?）和His253（4.52 ?）形成3 個(gè)距離不同的碳?xì)滏I，與Lys164（5.51 ?、6.45 ?）、Arg194（5.89 ?）和Lys256（8.12 ?）形成電荷相互作用。

圖8 SN12 與4ALM 的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用Fig. 8 Binding site and interaction between SN12 and 4ALM

2.3.3 沙門氏菌（6CH3）與配體的作用機(jī)制 RK7、TL9、VN10 和SN12 與6CH3 的對(duì)接構(gòu)象見(jiàn)圖9～12。 RK7 與6CH3 對(duì)接后得到58 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，其中Site1 區(qū)域包含50 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site2 區(qū)域包含1 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site5 區(qū)域包含5 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site9 區(qū)域包含2 個(gè)對(duì)接構(gòu)象， 最佳構(gòu)象位于Site1 區(qū)域（X：4.21 Y：39.79 Z：4.74 R：9.00 ?）， 對(duì)接得分為186.054，結(jié)合能為38 274.18 kJ/mol。圖9 為RK7 和6CH3 對(duì)接形成的最佳構(gòu)象圖， 結(jié)果顯示，RK7 與6CH3 的氨基酸殘基Arg41（5.83 ?）、Lys60（6.15 ?）、Leu197（3.47 ?）、Arg198 （3.58 ?）、Gln475 （3.85 ?、5.05 ?）、Val481（4.53 ?）和Glu483（4.31 ?）之間形成了8 個(gè)距離不同的氫鍵，其中RK7 和氨基酸殘基Gln475 之間含有2 個(gè)氫鍵， 與Leu197 之間形成的氫鍵最短， 結(jié)合最緊密；RK7 與氨基酸殘基Met30（4.39 ?）、Gly34 （2.72 ?、3.38 ?）、Arg41 （3.44 ?）、Ala57 （3.41 ?、3.44 ?）、Leu197 （5.80 ?）、Gln475（6.56 ?）、Phe479（5.61 ?）和Thr480（4.23 ?）之間形成了10 個(gè)距離不同的碳?xì)滏I，與Asp33（6.10 ?）、Arg41（5.30 ?）和Glu483（6.36 ?）形成電荷相互作用。

圖9 RK7 與6CH3 的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用Fig. 9 Binding site and interaction between RK7 and 6CH3

TL9 與6CH3 對(duì)接后得到6 個(gè)對(duì)接構(gòu)象， 這些構(gòu)象均位于Site1 區(qū)域（X：4.21 Y：39.79 Z：4.74 R：9.00 ?），最佳構(gòu)象的對(duì)接得分為144.172，結(jié)合能為4 198.23 kJ/mol。 圖10 為TL9 與6CH3 對(duì)接形成的最佳構(gòu)象圖，結(jié)果表明，TL9 與6CH3 的氨基酸殘基Ser14（4.18 ?）和Glu483（4.68 ?）之間形成了2 個(gè)距離不同的氫鍵；TL9 與氨基酸殘基Gln475（5.14 ?）和Gly478（3.50 ?、3.58 ?）形成了3 個(gè)距離不同的碳?xì)滏I，與Glu483（7.27 ?）形成電荷相互作用。

圖10 TL9 與6CH3 的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用Fig. 10 Binding site and interaction between TL9 and 6CH3

VN10 與6CH3 對(duì)接后得到1 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，該構(gòu)象位于Site1 區(qū)域 （X：4.21 Y：39.79 Z：4.74 R：9.00 ?），對(duì)接得分為109.897，結(jié)合能為61 702.13 kJ/mol。圖11 為VN10 與6CH3 對(duì)接形成的構(gòu)象圖，結(jié)果表明，VN10 與6CH3 的氨基酸殘基Ser14（4.24 ?、4.39 ?）、Asp33（4.53 ?）、Arg198（3.92 ?）和Lys471（5.60 ?） 之間形成了5 個(gè)距離不同的氫鍵；VN10 與氨基酸殘基Ala11（2.75 ?）、Met30（3.33 ?）、Arg41（6.44 ?）、Glu56（5.57 ?）和Lys471（5.60 ?）形成了5 個(gè)距離不同的碳?xì)滏I，與Glu56（6.60 ?）形成電荷相互作用。

圖11 VN10 與6CH3 的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用Fig. 11 Binding site and interaction between VN10 and 6CH3

SN12 與6CH3 對(duì)接后得到4 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，這4個(gè)構(gòu)象全部位于Site1 區(qū)域（X：4.21 Y：39.79 Z：4.74 R：9.00 ?），最佳構(gòu)象的對(duì)接得分為-272.228，結(jié)合能為252 021 549.25 kJ/mol。圖12 為SN12 與6CH3對(duì)接形成的最佳構(gòu)象圖， 結(jié)果表明，SN12 與6CH3的氨基酸殘基Lys60 （4.93 ?）、Arg198 （5.34 ?）和Val481 （4.90 ?） 之間形成3 個(gè)距離不同的氫鍵；SN12 與氨基酸殘基Lys8（3.70 ?）、Ala11（5.43 ?）和Arg198（3.67 ?、5.87 ?）形成了4 個(gè)距離不同的碳?xì)滏I，與Arg41（5.82 ?）、Glu56（6.65 ?）和Lys60（7.40 ?）形成電荷相互作用。

圖12 SN12 與6CH3 的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用Fig. 12 Binding site and interaction between SN12 and 6CH3

抗菌肽抑菌活性強(qiáng)弱與肽鏈中某些特殊氨基酸殘基密切相關(guān)， 如含有Arg 和Val 的抗菌肽，Arg可以使陰離子膜上的磷脂形成環(huán)形孔[18]，Val 可以促進(jìn)β-折疊片段的延伸[19]，因此這類抗菌肽具有更強(qiáng)的靜電膜吸附作用和較高的抑菌活性。 Lee 等對(duì)人工合成抗菌肽P1（KWKLFK KIPKFLHLAKKF）C 端和N 端氨基酸逐一切除發(fā)現(xiàn)Pro 對(duì)該肽的抑菌活性發(fā)揮著重要作用[20]。 所有肽段當(dāng)中均含有不同數(shù)量的Arg、Val 或Pro，這為肽段具有抑菌活性奠定了基礎(chǔ)。

抗菌肽疏水性是影響其抑菌活性的重要因素之一[21]。 在一定范圍內(nèi)，抗菌肽疏水性越大，抑菌活性越強(qiáng)，但疏水性過(guò)高會(huì)導(dǎo)致抗菌肽自身聚集至沉淀析出，降低抑菌活性[22]。 Jiang 等研究表明，提高抗菌肽的疏水性，其抑菌活性得到提高，但其溶血活性也隨之提高，且溶血活性提高幅度大于抑菌活性提高幅度，極大降低了抗菌肽的治療指數(shù)[23]。溶血活性是抗菌肽的一個(gè)毒副作用，代表抗菌肽對(duì)血紅細(xì)胞的破壞力度。 肽鏈長(zhǎng)度與抗菌肽抑菌活性之間存在二次函數(shù)關(guān)系，且較短的抗菌肽往往擁有更低的細(xì)胞毒性和溶血活性[24]。 疏水力矩用于對(duì)多肽兩親性指標(biāo)的定量描述[25]，平均疏水力矩對(duì)抑菌活性的影響要大于疏水性對(duì)抑菌活性的影響[26]。Hawrani 等研究指出，增加抗菌肽的疏水力矩和疏水性使得抗菌肽的抑菌活性降低，溶血活性增加[27]。抗菌肽大部分為堿性陽(yáng)性肽，可以與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜通過(guò)正負(fù)電荷之間的靜電引力相結(jié)合，使細(xì)菌細(xì)胞膜破裂或形成孔洞，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，菌體不能維持正常生命活動(dòng)所需的胞內(nèi)滲透壓而死亡[28-29]。

此外，抗菌肽與膜脂之間的氫鍵對(duì)抗菌肽維持活性結(jié)構(gòu)至關(guān)重要[30]，片層結(jié)構(gòu)型抗菌肽主要通過(guò)肽與膜脂間的氫鍵或范德華力而不是殘基間的氫鍵來(lái)發(fā)揮作用[31]。 經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)4 種苦味肽RK7、TL9、VN10 和SN12 的二級(jí)結(jié)構(gòu)均以無(wú)規(guī)則卷曲形式存在，所以排除肽與脂膜間氫鍵對(duì)苦味肽抑菌活性的影響；氫鍵是分子間的較強(qiáng)作用力，對(duì)配體和受體形成穩(wěn)定復(fù)合物構(gòu)象發(fā)揮著重要作用。

2.4 苦味肽抑菌活性表征和預(yù)測(cè)

BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)是目前最全面的生物活性肽數(shù)據(jù)庫(kù)[18]，截至2021 年1 月，BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)記錄了4 132 種功能活性已知的肽段， 其中510 種肽段具有抑菌活性， 將RK7、TL9、VN10 和SN12 與BIOPEP 中的抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)RK7（ID：8164）來(lái)源于αS1-酪蛋白（1～7 位），為抑菌活性已知的肽段，最高相似度為100%，TL9、VN10 和SN12 當(dāng)中均不含BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)中抑菌活性已知的肽片段， 但分子對(duì)接顯示這3 種肽仍能和5BNS、4ALM或6CH3 結(jié)合，所以推測(cè)TL9、VN10 和SN12 為新型抗菌肽。 綜上所述，預(yù)測(cè)4 種苦味肽的抑菌活性，大腸桿菌抑制活性：RK7 > TL9，金黃色葡萄球菌抑制活性：RK7 > VN10 > TL9 > SN12，沙門氏菌抑制活性：RK7 > TL9 > VN10 > SN12。

3 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪中4 種苦味肽RK7、TL9、VN10 和SN12 的分子特性進(jìn)行計(jì)算和分析，對(duì)肽結(jié)構(gòu)做能量最小化處理并將它們定義為配體，從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取來(lái)自不同菌體（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）蛋白質(zhì)晶體的X 射線衍射三維結(jié)構(gòu)（5BNS、4ALM、6CH3）并將它們定義為受體， 配體和受體經(jīng)DS 軟件優(yōu)化處理后運(yùn)用分子對(duì)接工具對(duì)苦味肽抑菌活性及其作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明RK7、TL9 均能和5BNS、4ALM、6CH3 形成配體-受體復(fù)合物構(gòu)象，VN10 和SN12 僅能和4ALM、6CH3 形成配體-受體復(fù)合物構(gòu)象。 將RK7、TL9、VN10 和SN12 與BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)中的抗菌肽比對(duì)后發(fā)現(xiàn)RK7 為抑菌活性已知的完整肽段，TL9、VN10 和SN12 當(dāng)中雖不含已知抑菌活性的肽片段，但仍能和5BNS、4ALM 或6CH3 結(jié)合， 所以推測(cè)TL9、VN10 和SN12 為新型抗菌肽。結(jié)合肽段分子特性分析、分子對(duì)接和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)預(yù)測(cè)4 種苦味肽的抑菌活性，大腸桿菌抑制活性：RK7 > TL9，金黃色葡萄球菌抑制活性：RK7 > VN10 > TL9 > SN12，沙門氏菌抑制活性：RK7 > TL9 > VN10 > SN12。 下一步將通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)4 種肽段單體的抑菌活性進(jìn)行驗(yàn)證。 分子對(duì)接等生物信息學(xué)方法有效揭示了牦牛乳硬質(zhì)干酪中具有抑菌活性的苦味肽與不同微生物菌體蛋白間相互作用的分子機(jī)制，為抗菌肽的研究提供技術(shù)支持，此外，選取的3 種肽TL9、VN10和SN12 并不在BIOPEP 的抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)中， 因此有可能成為抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)充片段。