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    酶水解法在大曲淀粉檢測上的應(yīng)用研究

    2022-01-07 07:15:24王軍凱王衛(wèi)東代利平黃祖耀
    釀酒科技 2021年12期
    關(guān)鍵詞:三角瓶糖化酶大曲

    王軍凱,王衛(wèi)東,蔣 明,代利平,黃祖耀

    (江蘇洋河酒廠股份有限公司,江蘇宿遷 223700)

    淀粉是一種高分子碳水化合物,是由葡萄糖聚合而成的多糖。在釀酒生產(chǎn)中,淀粉質(zhì)糧食是重要的釀酒原料。作為釀酒生產(chǎn)的糖化發(fā)酵劑,大曲以大麥、小麥等為原料,粉碎后由人工控制適當?shù)乃帧囟?、疏松度等條件來選擇、富集有益微生物培育而成[1]。大曲的淀粉含量反映了大曲發(fā)酵的成熟程度,是評判大曲質(zhì)量好壞的一個重要指標[2]。傳統(tǒng)的淀粉含量檢測方法為酸水解法。酸水解法檢測淀粉含量需用強酸作催化劑,檢測過程中還需用強堿中和多余的酸。在水解過程中,強酸會使半纖維素等一些非淀粉多糖水解為還原糖。因此,酸水解法更適用于淀粉含量較高的樣品[3]。

    糖化酶,又稱葡萄糖淀粉酶,是一種單鏈酸性糖苷鍵水解酶,在發(fā)酵過程中通過水解糖苷鍵將淀粉逐步降解為葡萄糖,具有性能穩(wěn)定、水解安全的優(yōu)點[4-6]。根據(jù)糖化酶的水解原理,本研究通過對比大曲淀粉經(jīng)酸水解和酶水解后的結(jié)果發(fā)現(xiàn),酶水解法檢測大曲淀粉含量操作簡單,結(jié)果可靠,避免了強堿強酸的使用,可應(yīng)用于大曲淀粉的日常檢測。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑及儀器

    原料:大曲為釀酒車間使用曲,糖化酶(10萬U/g)由無錫市雪酶酶制劑科技有限公司提供。

    試劑及耗材:斐林氏甲液、乙液、1 g/L 葡萄糖標準溶液、20 %(V/V)鹽酸溶液、20 %(W/V)氫氧化鈉溶液、可溶性淀粉。所用化學藥品均為分析純,均由國藥集團化學試劑有限公司提供。

    儀器設(shè)備:TCS-100 型標準COD 消解器、分析天平、三角瓶、容量瓶、量筒、電爐、酸式滴定管。

    1.2 酸水解法

    1.2.1 檢測原理

    淀粉在強酸和高溫作用下,葡萄糖苷鏈裂解,生成不同分子量的糖類聚合物,最終生成葡萄糖。酸水解后的溶液用堿中和至微酸性,按斐林氏法測定還原糖含量,最后折算為淀粉含量。

    1.2.2 檢測步驟

    1.2.2.1 試樣酸水解

    準確稱取大曲樣品5.0 g 于250 mL 三角瓶中,加入20 %鹽酸溶液100 mL,將三角瓶放于消解器中高溫消解2 h。消解完成后取出三角瓶并冷卻,用20 %的氫氧化鈉溶液中和至微酸性(pH 試紙驗證),脫脂棉過濾至500 mL 容量瓶,濾液搖勻并定容。

    1.2.2.2 試樣測定

    空白試驗:準確吸取斐林氏甲液、乙液各5.0 mL于100 mL 三角瓶中,預(yù)先向三角瓶內(nèi)加入葡萄糖標準溶液9.0 mL左右,混合均勻后將三角瓶放于電爐上加熱,沸騰后,緩慢滴入葡萄糖標準溶液,待三角瓶內(nèi)藍色消失,記錄空白試驗消耗葡萄糖標準溶液量。

    樣品試驗:樣品預(yù)滴定:準確吸取甲液、乙液各5.0 mL 以及1.0 mL 樣品濾液于100 mL 三角瓶中,混合均勻后將三角瓶放于電爐上加熱,沸騰后,緩慢滴入葡萄糖標準溶液,待三角瓶內(nèi)藍色消失,記錄葡萄糖標準溶液消耗量;樣品滴定:準確吸取甲液、乙液各5.0 mL 以及1.0 mL 樣品濾液于100 mL三角瓶中,預(yù)先加入比預(yù)滴定少1.0 mL左右的葡萄糖標準溶液,混合均勻后將三角瓶放于電爐上加熱,沸騰后,緩慢滴入葡萄糖標準溶液,待三角瓶內(nèi)藍色消失,記錄樣品試驗消耗葡萄糖標準溶液量。計算:

    式中:V0——空白試驗消耗葡萄糖標準溶液量,mL;

    V——樣品試驗消耗葡萄糖標準溶液量,mL;

    C——葡萄糖標準溶液的濃度,g/L;

    500——樣品濾液定容體積,mL;

    1——滴定時溶液的取樣量,mL;

    0.9——葡萄糖換算成淀粉的系數(shù);

    m——試樣質(zhì)量,g。

    1.3 酶水解法

    1.3.1 檢測原理

    糖化酶為糖苷鍵水解酶,在其最適反應(yīng)條件下,促使淀粉中的糖苷鍵斷裂,最終生成葡萄糖。本試驗所使用的糖化酶由黑曲霉優(yōu)良菌種經(jīng)深層發(fā)酵精制而成,在其最適反應(yīng)條件下,能將淀粉逐步水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖,糖化效率高。為加速淀粉糖化,首先對淀粉進行加熱糊化,當?shù)矸酆耆珪r,淀粉天然的半結(jié)晶結(jié)構(gòu)完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型結(jié)構(gòu),此時淀粉更易被糖化酶水解。酶水解完成后,按斐林氏法測定還原糖含量,最后折算為淀粉含量。

    1.3.2 檢測步驟

    1.3.2.1 試樣酶水解

    準確稱取大曲樣品5.0 g 于250 mL 三角瓶中,加入蒸餾水100 mL。樣品前處理采用高溫加熱,加快淀粉降解。待大曲溶液冷卻后,加入適量糖化酶(使用量按產(chǎn)品使用說明添加),將三角瓶放于恒溫水浴鍋中,調(diào)節(jié)水溫至糖化酶的最適反應(yīng)溫度進行糖化(大曲溶液pH 值接近于糖化酶的反應(yīng)pH 值)。糖化完成后(碘液驗證),脫脂棉過濾至500 mL容量瓶,濾液搖勻并定容。

    1.3.2.2 試樣測定

    操作步驟同1.2.2.2。

    2 結(jié)果與分析

    為了比較兩種方法檢測大曲淀粉結(jié)果的精密度和準確度,將大曲樣品平均分成6 份,即為樣品1、樣品2……樣品6。采用兩種方法分別檢測,每個樣品檢測2 次,并以各組數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值作為樣品的真實值。檢測結(jié)果如表1所示。

    表1 大曲淀粉檢測結(jié)果對比表 (%)

    2.1 精密度的比較

    精密度反映了重復(fù)檢測樣品時檢測結(jié)果的重現(xiàn)性,常用相對標準偏差來反映精密度的高低。相對標準偏差越小,說明重復(fù)檢測結(jié)果間的誤差越小。兩種方法檢測6 個樣品結(jié)果的絕對偏差如圖1所示。

    圖1 大曲淀粉檢測結(jié)果絕對偏差對比圖

    由圖1 可以看出,酶水解法檢測結(jié)果的絕對偏差低于酸水解法。其中酸水解法的相對標準偏差為1.83 %,酶水解法的相對標準偏差為1.38 %,說明酶水解法的精密度高于酸水解法。

    2.2 準確度的比較

    準確度是反映檢測結(jié)果接近于真實值的程度,常用相對誤差來表示準確度的高低。相對誤差越小,說明檢測結(jié)果越接近于真實值。兩種方法檢測6個樣品結(jié)果的相對誤差如圖2所示。

    圖2 大曲淀粉檢測結(jié)果相對誤差對比圖

    由圖2 可以看出,酶水解法檢測的6 組數(shù)據(jù)的相對誤差比酸水解法低,說明酶水解法的準確度要高于酸水解法。

    2.3 加標回收試驗驗證

    為進一步考察酶水解法的準確性,隨機選取3個大曲樣品,分別加入不等量的可溶性淀粉(烘干至恒重)做加標回收試驗。試驗結(jié)果如表2所示。

    由表2 可以看出,酶水解法檢測結(jié)果的平均回收率為93.94%±1.12%,表明此方法檢測大曲淀粉含量的準確性較高。

    表2 大曲淀粉回收結(jié)果對比表

    2.4 實用性驗證

    由表1 可知,酸水解法測定的淀粉含量為59.16 %±1.08 %,酶水解法測定的淀粉含量為58.67 %±0.81 %,相差為0.49 %。為分析酶水解法與酸水解法在檢測時產(chǎn)生的誤差是由偶然因素引起或是系統(tǒng)因素引起的,隨機選取10 個樣品,采用兩種方法分別檢測,檢測結(jié)果如圖3所示。

    圖3 大曲淀粉檢測結(jié)果對比圖

    由圖3 可以看出,酶水解法檢測結(jié)果與酸水解法檢測結(jié)果的誤差沒有規(guī)律性。為考察兩種方法檢測結(jié)果之間誤差的顯著性,采用MINITAB 軟件對10 組數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。結(jié)果如表3所示。

    從表3 可以看出,在0.05 水平上,兩種方法差值的顯著性結(jié)果P 值為0.541,大于0.05,表明兩種方法檢測結(jié)果的差異性并不顯著,產(chǎn)生的誤差不是由方法本身帶來的。說明酶水解法檢測大曲淀粉含量可以用于實際生產(chǎn)上的檢測應(yīng)用。

    表3 差異顯著性分析結(jié)果

    3 結(jié)論

    通過對酸水解法和酶水解法在大曲淀粉檢測結(jié)果對比可以看出,在檢測精密度上,酶水解法的相對標準偏差小于酸水解法,檢測結(jié)果再現(xiàn)性更好;在檢測準確度上,酶水解法相對誤差小于酸水解法。兩種方法檢測結(jié)果的差異性并不顯著,酶水解法不存在系統(tǒng)誤差。在實際生產(chǎn)中,酶水解法避免了強酸強堿的使用,符合現(xiàn)代環(huán)保檢測的要求,在檢測大曲淀粉含量應(yīng)用上具有重要的實用意義。

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