• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于生物信息學(xué)分析IL-15在胸腺上皮腫瘤中的表達(dá)及臨床意義①

    2022-01-06 06:45:28陳敏鎵李瑋瑋
    中國免疫學(xué)雜志 2021年23期
    關(guān)鍵詞:共表達(dá)胸腺腺瘤

    朱 瑩 陳敏鎵 李瑋瑋

    (南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院病理科,東莞 523059)

    胸腺上皮腫瘤(thymic epithelial tumors,TETs)是最常見的前縱隔腫瘤,但也是成人罕見的惡性腫瘤之一,包括胸腺瘤和胸腺癌(又稱C 型胸腺瘤)[1]。2015 版WHO 已將胸腺瘤更新為惡性腫瘤,其預(yù)后主要參考腫瘤分期、手術(shù)切除是否徹底及病理組織學(xué)的診斷(A 型、AB 型、B1 型、B2 型、B3 型預(yù)后依次變差),晚期患者的五年生存率為69%[1-2]。胸腺癌發(fā)病率低,但其臨床侵襲性較胸腺瘤更強(qiáng),晚期病人五年生存率僅為36%[1]。目前臨床缺乏有效的協(xié)助TETs臨床診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物。

    IL-15作為一種多效促炎癥因子,具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)活性,參與自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的發(fā)育、增殖和存活[3-5]。研究發(fā)現(xiàn),IL-15 通過刺激免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,促進(jìn)多種免疫器官或免疫細(xì)胞相關(guān)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展,如多發(fā)性骨髓瘤、皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤、大顆粒淋巴細(xì)胞白血病和B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病等[6-9]。而IL-15 作為一種與免疫器官(細(xì)胞)腫瘤密切相關(guān)的細(xì)胞因子,其在TETs 中的研究十分有限。因此,本研究利用生物信息學(xué)方法和腫瘤組織標(biāo)本檢測,綜合分析IL-15 在TETs 組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系,為TETs的診斷和預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物。進(jìn)一步探究TETs中IL-15參與的生物學(xué)功能、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和蛋白-蛋白相互作用,為TETs的發(fā)病機(jī)制提供線索和思路。

    1 資料與方法

    1.1 資料

    1.1.1 患者一般資料 回顧性收集2014 年至2018年于東莞市人民醫(yī)院手術(shù)切除的38例TETs 標(biāo)本及病歷資料(其中A 型胸腺瘤4 例,AB 型胸腺瘤8例,B1型胸腺瘤3例,B2型胸腺瘤18例,B3型胸腺瘤5 例),患者年齡19~74 歲,中位年齡48 歲。納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者經(jīng)影像學(xué)、病理學(xué)等手段確診;入組前未行放化療及其他免疫治療;患者或親屬簽署知情同意書,并上報(bào)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.1.2 主要試劑 鼠抗人IL-15 單克隆抗體(ab55276,Abcam);IgG 羊抗鼠二抗、免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋)。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)檢測TETs 組織中IL-15蛋白表達(dá) 采用鼠抗人IL-15單克隆抗體、IgG羊抗鼠二抗以及免疫組織化學(xué)試劑盒,根據(jù)試劑盒說明對石蠟切片進(jìn)行IHC染色。

    評分標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)染色組織的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合評分。①按染色強(qiáng)度評分:不著色評為0分,淡黃色評為1分,黃褐色評為2分,棕褐色評為3 分。②根據(jù)陽性細(xì)胞百分率評分:陽性比例≤5%評為1分,5%<陽性比例≤25%評為2分,25%<陽性比例≤50%評為3 分,50%<陽性比例≤100%評為4分。免疫組織化學(xué)染色評分為以上2個(gè)評分相乘,0~4 分為低表達(dá),5~12 分為高表達(dá)。陽性率按陽性例數(shù)除以總例數(shù)計(jì)算。由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法分別觀察切片,若觀察結(jié)果相差3 分,則重新評定。

    1.2.2 數(shù)據(jù)來源 數(shù)據(jù)源于TCGA(http://cancergenome.nih.gov/)腫瘤數(shù)據(jù)庫中2018 年胸腺上皮腫瘤IL-15的mRNA seq表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床資料123例(Thymoma,TCGA,PanCancer Altas,2018)。將IL-15 mRNA 數(shù)據(jù)與其他臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)合并,刪除無預(yù)后信息、術(shù)前接受輔助治療、微結(jié)節(jié)型胸腺瘤的患者,最終得到115 例患者數(shù)據(jù)[10]。數(shù)據(jù)說明:在TCGA數(shù)據(jù)庫中,胸腺瘤(thymoma,THYM)數(shù)據(jù)包含10 例胸腺癌數(shù)據(jù),本文中統(tǒng)一注釋為TETs進(jìn)行分析。

    1.2.3 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA2(gene expression profiling interactive analysis 2)數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn)由北京大學(xué)研發(fā),用于結(jié)合分析TCGA 和GTEx(genotype-tissues expression)數(shù)據(jù)庫中基因在不同腫瘤和正常樣本中的mRNA 表達(dá)情況[11]。用于分析在TETs 組織和正常胸腺組織中IL-15的表達(dá)。

    1.2.4 IL-15共表達(dá)基因的獲得與富集分析 利用cBioPortal在線分析平臺[12](https://www.cbioportal.org/)進(jìn)一步深入挖掘TCGA TETs 數(shù)據(jù)信息,獲得IL-15 共表達(dá)基因,設(shè)置Spearman 相關(guān)系數(shù)|R|≥0.4。采用DAVID[13](https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行IL-15 共表達(dá)基因GO(gene ontology)功能分析和KEGG(Kyoto encyclopedia of gene and genomes)信號通路的富集分析。P-value<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    1.2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測 STRING 數(shù)據(jù)庫[14](https://string-db.org/)基于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、基因鄰近、共表達(dá)、同源推測等認(rèn)證提供基因或蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系。本文利用STRING 數(shù)據(jù)庫預(yù)測并構(gòu)建人類樣本中IL-15 蛋白互作網(wǎng)絡(luò),設(shè)置置信度0.7,最大相互作用基因數(shù)10,并在線進(jìn)行GO 和KEGG分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用卡方檢驗(yàn)分析IL-15 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。Log-rank 檢驗(yàn)構(gòu)建Kaplan-Meier 曲線進(jìn)行總體生存(overall survival,OS)及無進(jìn)展生存(progress free survival,PFS)分析。利用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對IL-15 及臨床病理特征進(jìn)行多因素分析。GraphPad Prism 8 軟件繪圖,計(jì)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示,兩組計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用Student'st檢驗(yàn)(t-test)。P<0.05或P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 IL-15 在胸腺上皮腫瘤組織中高表達(dá) GEPIA網(wǎng)站綜合分析TCGA 數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫,結(jié)果顯示,與對應(yīng)正常組織相比,IL-15 mRNA 在胸腺上皮腫瘤(thymoma,THYM)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)、卵巢漿液性癌(ovarian serous cystadenocarcinoma,OV)、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma,DLBC)中表達(dá)升高(圖1)。其中,118 例TETs 組織中IL-15 mRNA 表達(dá)高于339 例正常胸腺組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖2A)。同時(shí),IHC 結(jié)果顯示,IL-15 蛋白表達(dá)定位于胸腺上皮細(xì)胞核,IL-15在38 例TETs 組織中表達(dá)高于10 例正常胸腺組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2B)。

    圖1 IL-15在不同腫瘤組織和對應(yīng)的正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of IL-15 in different tumor tissues and corresponding normal tissues

    圖2 IL-15在TETs組織中高表達(dá)Fig.2 IL-15 was overexpressed in TETs tissues

    2.2 TETs 中IL-15 表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中115 例TETs 組織中IL-15 mRNA 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)IL-15 表達(dá)與患者的組織學(xué)分型診斷及是否伴有重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)相關(guān)(P<0.01)。即IL-15 高表達(dá)見于12.07%(7/58)的A 型及AB 型胸腺瘤組,而B 型及C 型胸腺瘤組IL-15 高表達(dá)約占33.33%(19/57),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TETs 不伴MG(TETs/MG-)的患者IL-15 高表達(dá)約占13.41%(11/82),TETs 伴MG(TETs/MG+)的組患者IL-15高表達(dá)約占46.88%(15/32),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。IL-15的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤Masaoka-Koga分期、淋巴細(xì)胞分級無關(guān)(P>0.05)。見表1。

    進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)染色檢測TETs 組織標(biāo)本中IL-15蛋白表達(dá)情況(圖3)。結(jié)果顯示,IL-15蛋白低表達(dá)組織占65.79%(1~4 分,25/38),IL-15蛋白高表達(dá)組織占34.21%(5~12分,13/38)。IL-15蛋白表達(dá)與淋巴細(xì)胞分級和患者是否伴有重癥肌無力有關(guān)(P<0.05),而與患者年齡、性別、腫瘤Masaoka-Koga 分期和組織學(xué)分型診斷無關(guān)(P>0.05)。見表1。

    表1 TETs中IL-15表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Association between IL-15 expression and clinical pathology parameters in TETs

    圖3 TETs組織中IL-15的表達(dá)(IHC,×200)Fig.3 Expression of IL-15 in TETs(IHC,×200)

    2.3 IL-15 表達(dá)水平與TETs 患者預(yù)后的關(guān)系 運(yùn)用Kaplan-Meier 曲線法分析TETs(TCGA,PanCancer Altas,2018,n=115),結(jié)果顯示IL-15高表達(dá)患者OS(HR=31.996,95%CI:3.915~261.473,P<0.001,圖4A)和PFS(HR=5.6,95%CI:2.241~13.991,P<0.001,圖4B)顯著縮短,預(yù)后差。Cox多因素分析發(fā)現(xiàn),IL-15 可作為TETs 患者OS(HR=27.047,95%CI:3.174~230.452,P=0.003,表2)及PFS(HR=7.734,95%CI:2.882~20.753,P<0.001,表3)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

    表2 TETs患者總預(yù)后的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of prognostic factors for OS in TETs patients

    表3 TETs患者無進(jìn)展預(yù)后的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of prognostic factors for PFS in TETs patients

    圖4 IL-15表達(dá)與TETs患者預(yù)后密切相關(guān)Fig.4 IL-15 expression was closely associated with prognosis of TETs patients

    2.4 TETs 中IL-15 共表達(dá)基因富集分析和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測 cBioPortal 在線分析TCGA 胸腺上皮腫瘤數(shù)據(jù)IL-15 共表達(dá)基因,獲得256 個(gè)基因,其中正相關(guān)表達(dá)基因225個(gè),負(fù)相關(guān)表達(dá)基因31個(gè)。隨后利用DAVID 進(jìn)行IL-15 共表達(dá)基因GO 功能分析和KEGG 通路富集分析。GO 結(jié)果顯示,IL-15 共表達(dá)基因主要富集于免疫應(yīng)答生物過程、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的細(xì)胞組成成分、多肽抗原結(jié)合分子功能和INF-γ 信號相關(guān)的生物學(xué)過程(圖5A)。KEGG 結(jié)果顯示,IL-15 共表達(dá)基因富集于抗原加工遞呈、細(xì)胞因子與受體相互作用、細(xì)胞黏附分子(膜型免疫分子)、TNF信號通路等(圖5B)。

    圖5 TETs中IL-15共表達(dá)基因GO和KEGG通路富集分析Fig.5 GO and KEGG pathway analysis of IL-15 co-expressed genes in TETs

    同時(shí),利用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建IL-15 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示,PPI 網(wǎng)絡(luò)中與IL-15 相互作用的蛋白有IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL-15RA、IL-2、STAT3、STAT5A、STAT5B、JAK1、JAK3,與IL-15 蛋白結(jié)合分?jǐn)?shù)均大于0.9,PPI 富集P<1.0e-16(圖6)。STRING數(shù)據(jù)庫在線GO分析結(jié)果表明,IL-15及其互作蛋白富集于IL-15、IL-2 等細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、蛋白磷酸化等生物學(xué)功能。KEGG 通路分析結(jié)果顯示,互作蛋白顯著富集于JAK-STAT 信號通路中。

    圖6 STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測IL-15相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Network of interaction protein with IL-15 using STRING database

    3 討論

    胸腺作為重要的中樞免疫器官,可通過胸腺上皮細(xì)胞及其他基質(zhì)細(xì)胞分泌胸腺激素和細(xì)胞因子誘導(dǎo)和決定T 淋巴細(xì)胞的分化、增殖和選擇性發(fā)育[15]。發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的胸腺可誘導(dǎo)成熟的T 細(xì)胞,導(dǎo)致胸腺免疫微環(huán)境紊亂和嚴(yán)重的免疫調(diào)節(jié)功能障礙[16]。因此,識別和探討TETs免疫相關(guān)的分子標(biāo)志物對其診斷和治療有重要的意義。

    越來越多研究顯示,在免疫器官或免疫細(xì)胞相關(guān)的腫瘤中,IL-15 異常表達(dá),并通過自分泌或旁分泌方式促進(jìn)腫瘤相關(guān)信號通路和腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)特性[17]。多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞自分泌產(chǎn)生的IL-15可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活,降低抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡能力[6]。皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)中顯示出IL-15 異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo),即IL-15 過度表達(dá)驅(qū)動(dòng)HDAC1 和HDAC6 上調(diào),并激活致癌性miR-21 轉(zhuǎn)錄上調(diào)促進(jìn)腫瘤發(fā)生[7]。同時(shí),利用IL-15的轉(zhuǎn)基因小鼠模型模仿證明IL-15 過表達(dá)誘導(dǎo)人類自發(fā)CTCL[7]。IL-15 是大顆粒淋巴細(xì)胞(LGLs)白血病中升高的促炎細(xì)胞因子,其異常表達(dá)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性和DNA 超甲基化[8]。同樣,在B 細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)中,TLR-9 配體(ODN)與IL-15 協(xié)同作用促進(jìn)B-CLL 克隆擴(kuò)增[18]。且IL-15 在ODN 啟動(dòng)的B-CLL 中激活PI3K/AKT 和JAK/STAT5 途徑,進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)周期蛋白D2(CCND2)表達(dá),并減弱DNA損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá),促進(jìn)G1/S 期轉(zhuǎn)變[9]。SHI等[19]研究發(fā)現(xiàn)胸腺瘤患者血清中IL-15 蛋白水平顯著高于健康人。本文研究發(fā)現(xiàn)IL-15 表達(dá)定位于胸腺上皮細(xì)胞,且在TETs 組織中高表達(dá),并隨著病理組織學(xué)分級升級而表達(dá)升高。同時(shí),IL-15高表達(dá)患者OS和PFS顯著縮短,并可作為獨(dú)立預(yù)后因子。上述研究提示,長期IL-15 異常表達(dá)可能促進(jìn)胸腺免疫微環(huán)境的惡性轉(zhuǎn)變,可作為TETs診斷和不良預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

    約30%~40%胸腺瘤患者伴隨著自身免疫疾病,尤其是胸腺瘤相關(guān)的重癥肌無力(TAMG)[10]。研究結(jié)果顯示,MG 患者或MG 小鼠的血清IL-15 蛋白表達(dá)顯著高于正常組[19-20],且IL-15 在胸腺瘤伴有MG 患者、無胸腺瘤的MG 患者和健康人血清中發(fā)生顯著變化,IL-15 可能在MG 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[20]。本文基于TCGA 數(shù)據(jù)和病人標(biāo)本IHC 檢測發(fā)現(xiàn),TETs 細(xì)胞中IL-15 表達(dá)與TETs 患者是否伴有MG 相關(guān),即TETs 伴隨MG 的患者IL-15 表達(dá)水平高于不伴MG 的患者。上述結(jié)果提示TETs 相關(guān)的MG可能與IL-15高表達(dá)有關(guān)。IL-15異常表達(dá)可能導(dǎo)致TETs 中AChR 自身耐受和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的破壞,促進(jìn)MG 的發(fā)生和進(jìn)展,但具體致病機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

    大量研究發(fā)現(xiàn),IL-15主要通過與受體結(jié)合激活胞內(nèi)JAK/STAT 信號通路、Ras/MAPK 信號通路、PI3K/AKT 信號通路,發(fā)揮促進(jìn)靶細(xì)胞增殖活化,減弱凋亡信號,IFN-γ、TNF-α 分泌增強(qiáng)等生物學(xué)功能[17]。本文通過STRING 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示IL-15互作蛋白主要參與IL-15 受體介導(dǎo)的JAK/STAT 信號通路。同時(shí),TETs 中IL-15 共表達(dá)基因富集分析結(jié)果顯示,這些基因主要富集于免疫分子、免疫細(xì)胞等介導(dǎo)的免疫相關(guān)的生物學(xué)功能和信號通路,如免疫應(yīng)答過程、多肽抗原結(jié)合分子功能、INF-γ 介導(dǎo)的信號通路、抗原加工遞呈、TNF信號通路等。提示在TETs 免疫微環(huán)境中,IL-15 可能促進(jìn)活化腫瘤相關(guān)信號通路,導(dǎo)致胸腺上皮細(xì)胞的惡性增殖。

    綜上所述,本文依據(jù)生物信息學(xué)和病人組織標(biāo)本檢測分析IL-15與TETs發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系,并進(jìn)一步通過生物功能和信號通路富集結(jié)果探討其分子機(jī)制。我們認(rèn)為在TETs 中,IL-15 可能通過TETs細(xì)胞的自分泌或旁分泌途徑,活化腫瘤相關(guān)信號通路,導(dǎo)致免疫微環(huán)境異常、免疫功能失調(diào),促進(jìn)TETs細(xì)胞增殖,并引起TETs相關(guān)的MG 發(fā)生。這些認(rèn)識和發(fā)現(xiàn)將為臨床TETs患者的管理提供參考,也為后續(xù)深入開展臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)和方向。

    猜你喜歡
    共表達(dá)胸腺腺瘤
    兒童巨大胸腺增生誤診畸胎瘤1例
    侵襲性垂體腺瘤中l(wèi)ncRNA-mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
    后腎腺瘤影像及病理對照分析
    胸腺鱗癌一例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    膀胱癌相關(guān)lncRNA及其共表達(dá)mRNA的初步篩選與功能預(yù)測
    胸腔鏡胸腺切除術(shù)后不留置引流管的安全性分析
    中國流行株HIV-1gag-gp120與IL-2/IL-6共表達(dá)核酸疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)免疫研究
    姜兆俊治療甲狀腺腺瘤經(jīng)驗(yàn)
    胸腺瘤放射治療研究進(jìn)展
    甲狀腺顯示胸腺樣分化的癌1例報(bào)道及文獻(xiàn)回顧
    黄色毛片三级朝国网站| www日本在线高清视频| 一级毛片电影观看| 成人三级做爰电影| 大码成人一级视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 99香蕉大伊视频| 18在线观看网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品.久久久| 亚洲中文av在线| 色网站视频免费| 国产伦人伦偷精品视频| 久久99一区二区三区| 国产精品 国内视频| 久久久久久久久久久久大奶| 黄频高清免费视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 人成视频在线观看免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 1024视频免费在线观看| 久久性视频一级片| 美女主播在线视频| 国产一区二区在线观看av| 色婷婷av一区二区三区视频| 日韩大片免费观看网站| 色综合欧美亚洲国产小说| av网站在线播放免费| 高清av免费在线| 国产精品女同一区二区软件| 天美传媒精品一区二区| 国产免费视频播放在线视频| 丰满少妇做爰视频| av国产精品久久久久影院| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲情色 制服丝袜| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产av国产精品国产| 热re99久久国产66热| 男男h啪啪无遮挡| 黄片小视频在线播放| 亚洲成人国产一区在线观看 | av女优亚洲男人天堂| 亚洲欧美激情在线| 妹子高潮喷水视频| 亚洲国产成人一精品久久久| www.自偷自拍.com| 亚洲国产精品国产精品| 国产免费又黄又爽又色| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美黑人欧美精品刺激| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲中文av在线| 叶爱在线成人免费视频播放| 免费观看人在逋| 精品福利永久在线观看| svipshipincom国产片| 国产男女内射视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产精品免费大片| 91老司机精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲五月色婷婷综合| 久久久久久免费高清国产稀缺| 成年av动漫网址| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久亚洲国产成人精品v| 国产免费现黄频在线看| 国产成人精品无人区| 日韩人妻精品一区2区三区| 日韩伦理黄色片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 高清不卡的av网站| 国产精品熟女久久久久浪| 激情视频va一区二区三区| 97在线人人人人妻| 亚洲视频免费观看视频| 最近中文字幕2019免费版| av网站免费在线观看视频| 波多野结衣一区麻豆| 日日撸夜夜添| 成人漫画全彩无遮挡| 女性被躁到高潮视频| 国产一级毛片在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 在线观看免费午夜福利视频| www.熟女人妻精品国产| 中文字幕精品免费在线观看视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 伊人久久国产一区二区| 精品视频人人做人人爽| 看免费成人av毛片| 国产伦人伦偷精品视频| 日本av免费视频播放| 欧美国产精品一级二级三级| 一二三四中文在线观看免费高清| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产一区有黄有色的免费视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久青草综合色| 色婷婷久久久亚洲欧美| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 少妇精品久久久久久久| 国产色婷婷99| 五月开心婷婷网| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲免费av在线视频| 精品少妇久久久久久888优播| 在现免费观看毛片| 亚洲国产成人一精品久久久| av视频免费观看在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 国产成人精品久久二区二区91 | 久久人人爽av亚洲精品天堂| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲欧洲日产国产| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久精品性色| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 丝袜喷水一区| 女人久久www免费人成看片| 国产精品国产三级专区第一集| 国产男女内射视频| av电影中文网址| 黄色 视频免费看| 国产av一区二区精品久久| 大陆偷拍与自拍| 美女主播在线视频| www.熟女人妻精品国产| 亚洲综合精品二区| 超碰97精品在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲人成电影观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | av电影中文网址| 18禁动态无遮挡网站| 久久天堂一区二区三区四区| 永久免费av网站大全| 精品久久久久久电影网| 黄片播放在线免费| 9热在线视频观看99| 熟妇人妻不卡中文字幕| 熟女av电影| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 天天操日日干夜夜撸| 国产成人91sexporn| 国产99久久九九免费精品| 国产乱来视频区| 国产一区有黄有色的免费视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 男女国产视频网站| av不卡在线播放| 亚洲伊人色综图| 人妻一区二区av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品一区二区免费观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲,欧美,日韩| 天天操日日干夜夜撸| 桃花免费在线播放| 国产99久久九九免费精品| 久热爱精品视频在线9| 亚洲欧美色中文字幕在线| 看十八女毛片水多多多| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品一区在线观看国产| 一本大道久久a久久精品| 亚洲专区中文字幕在线 | 国产激情久久老熟女| 一级毛片我不卡| 美女视频免费永久观看网站| av视频免费观看在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 人人妻人人澡人人看| 最近中文字幕高清免费大全6| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一区在线观看完整版| 免费观看性生交大片5| 一二三四在线观看免费中文在| 天天影视国产精品| 深夜精品福利| 1024视频免费在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产av精品麻豆| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲精品成人av观看孕妇| videos熟女内射| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av在线播放精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 宅男免费午夜| 这个男人来自地球电影免费观看 | avwww免费| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 777米奇影视久久| 老司机影院成人| 国产xxxxx性猛交| 国产av码专区亚洲av| 亚洲国产av新网站| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲视频免费观看视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 色94色欧美一区二区| av福利片在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产精品二区激情视频| 超色免费av| 男女国产视频网站| 亚洲欧美一区二区三区国产| 一区福利在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 大码成人一级视频| 一区二区三区乱码不卡18| 午夜福利视频在线观看免费| 久久久国产精品麻豆| 日韩精品有码人妻一区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品久久久久久精品古装| 美女中出高潮动态图| 精品一品国产午夜福利视频| 国产亚洲一区二区精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 丰满乱子伦码专区| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲国产最新在线播放| 秋霞在线观看毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 成人黄色视频免费在线看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 中文字幕亚洲精品专区| 九草在线视频观看| 国产成人91sexporn| 又黄又粗又硬又大视频| 天天影视国产精品| 久久免费观看电影| 午夜久久久在线观看| av女优亚洲男人天堂| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美中文综合在线视频| 一二三四在线观看免费中文在| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 热re99久久精品国产66热6| 老熟女久久久| 免费观看av网站的网址| 大片电影免费在线观看免费| 老司机亚洲免费影院| 国产免费又黄又爽又色| 麻豆av在线久日| 成人漫画全彩无遮挡| 超碰97精品在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 午夜老司机福利片| 丰满少妇做爰视频| 午夜影院在线不卡| 1024视频免费在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲专区中文字幕在线 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 高清av免费在线| 国产黄色视频一区二区在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日本vs欧美在线观看视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 国产 一区精品| 午夜福利视频精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产极品天堂在线| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久国产欧美日韩av| 国产av码专区亚洲av| 亚洲综合色网址| 国产黄色视频一区二区在线观看| 宅男免费午夜| av福利片在线| 一本大道久久a久久精品| 午夜免费观看性视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 色视频在线一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 欧美最新免费一区二区三区| 女人精品久久久久毛片| 国产精品熟女久久久久浪| 另类亚洲欧美激情| 91aial.com中文字幕在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 美女视频免费永久观看网站| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人国产av品久久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| a级片在线免费高清观看视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 超碰成人久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲精品,欧美精品| 99久久99久久久精品蜜桃| h视频一区二区三区| 久久性视频一级片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品久久久av美女十八| 91aial.com中文字幕在线观看| 中文字幕高清在线视频| 在线观看一区二区三区激情| 久久99精品国语久久久| 美女福利国产在线| 欧美精品高潮呻吟av久久| 男女边摸边吃奶| 精品第一国产精品| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美日韩综合久久久久久| 男女国产视频网站| 久久人人97超碰香蕉20202| 中文字幕人妻丝袜制服| www.熟女人妻精品国产| 中文字幕制服av| 国产女主播在线喷水免费视频网站| av天堂久久9| 丝袜喷水一区| 欧美日韩视频精品一区| 欧美乱码精品一区二区三区| 一区福利在线观看| 美女主播在线视频| 老司机亚洲免费影院| 亚洲男人天堂网一区| 成人国语在线视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 午夜激情久久久久久久| 国产一级毛片在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产黄色免费在线视频| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久这里只有精品19| 9热在线视频观看99| 亚洲在久久综合| 成人国语在线视频| 国产精品一二三区在线看| 在线天堂最新版资源| 久久久久人妻精品一区果冻| 日日啪夜夜爽| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久精品国产综合久久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 日本午夜av视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 少妇人妻 视频| 久热爱精品视频在线9| 90打野战视频偷拍视频| svipshipincom国产片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩一本色道免费dvd| 在线观看免费高清a一片| 欧美变态另类bdsm刘玥| av片东京热男人的天堂| 韩国av在线不卡| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 91老司机精品| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品无大码| 亚洲精品日本国产第一区| 精品酒店卫生间| 欧美中文综合在线视频| 久久久久久人妻| 这个男人来自地球电影免费观看 | 深夜精品福利| 日韩伦理黄色片| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲成色77777| 国产片内射在线| 国产深夜福利视频在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 在线观看免费午夜福利视频| 一本久久精品| 不卡视频在线观看欧美| av片东京热男人的天堂| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产免费现黄频在线看| 精品第一国产精品| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久精品久久久久真实原创| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 天天影视国产精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产有黄有色有爽视频| av国产精品久久久久影院| 日韩电影二区| 99热网站在线观看| 亚洲成人一二三区av| 久久久久久久久久久久大奶| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 午夜精品国产一区二区电影| 1024视频免费在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲国产最新在线播放| 久久鲁丝午夜福利片| 免费av中文字幕在线| 在线观看一区二区三区激情| 一区在线观看完整版| 九色亚洲精品在线播放| 免费高清在线观看日韩| 黄色怎么调成土黄色| 午夜免费观看性视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 黄色 视频免费看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | a 毛片基地| 成人亚洲欧美一区二区av| 中国国产av一级| 赤兔流量卡办理| 大片电影免费在线观看免费| 日日啪夜夜爽| 看非洲黑人一级黄片| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 麻豆av在线久日| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| av在线app专区| 一区二区av电影网| 婷婷色av中文字幕| 91国产中文字幕| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产高清不卡午夜福利| 久久韩国三级中文字幕| 热99久久久久精品小说推荐| 久久久国产一区二区| 亚洲精品一区蜜桃| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 性少妇av在线| 精品少妇内射三级| 高清视频免费观看一区二区| 丰满乱子伦码专区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久这里只有精品19| 三上悠亚av全集在线观看| 香蕉国产在线看| 国产乱来视频区| 亚洲av国产av综合av卡| 成年人午夜在线观看视频| 免费高清在线观看日韩| 高清不卡的av网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美少妇被猛烈插入视频| 天天影视国产精品| 亚洲免费av在线视频| 自线自在国产av| 日本一区二区免费在线视频| 婷婷色av中文字幕| 一区二区三区精品91| 欧美国产精品va在线观看不卡| 黄色视频不卡| 天美传媒精品一区二区| 黄片小视频在线播放| 多毛熟女@视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲国产av影院在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产亚洲一区二区精品| 午夜日本视频在线| 丝袜脚勾引网站| 国产免费福利视频在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 90打野战视频偷拍视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 99国产精品免费福利视频| 国产高清国产精品国产三级| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 成人国产麻豆网| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 夫妻性生交免费视频一级片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 黄色一级大片看看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 黄片小视频在线播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品国产av在线观看| 男女国产视频网站| 秋霞伦理黄片| 久久久精品94久久精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 男女国产视频网站| 国产成人午夜福利电影在线观看| av一本久久久久| 国产精品国产av在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品二区激情视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 90打野战视频偷拍视频| 一级毛片我不卡| 国产熟女欧美一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产精品一区二区在线观看99| 99久久99久久久精品蜜桃| 最近中文字幕2019免费版| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 老司机亚洲免费影院| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产 精品1| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲三区欧美一区| 午夜av观看不卡| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 在线观看人妻少妇| 国产成人91sexporn| 日日啪夜夜爽| 国产亚洲欧美精品永久| 另类亚洲欧美激情| 天堂8中文在线网| 国产精品.久久久| 国产在视频线精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲四区av| 一级片免费观看大全| 激情视频va一区二区三区| 一区在线观看完整版| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 日本欧美视频一区| 免费av中文字幕在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 我的亚洲天堂| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品久久久精品久久久| 国产成人精品无人区| 一级a爱视频在线免费观看| 成人手机av| 国产精品久久久久久久久免| 欧美日韩一级在线毛片| 一级爰片在线观看| 两性夫妻黄色片| 18禁动态无遮挡网站| 日日撸夜夜添| 精品一区二区三卡| 精品一区在线观看国产| 男女床上黄色一级片免费看| 中文字幕av电影在线播放| 老司机影院毛片| 国产精品熟女久久久久浪| 一级片免费观看大全| 另类精品久久| 中文字幕人妻熟女乱码| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产亚洲欧美精品永久| 国产av一区二区精品久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 精品酒店卫生间| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产成人欧美| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲成人免费av在线播放| 精品久久蜜臀av无| 成人午夜精彩视频在线观看| 日本av手机在线免费观看| 色94色欧美一区二区| 日韩免费高清中文字幕av|