反復著床失敗患者預防性免疫治療后妊娠結(jié)局評估①

趙 捷 李小雪 葛逸盟 馬彩紅 李 蓉

（北京大學第三醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，北京 100191）

全球約1.86 億人口和8%～12%的育齡夫婦患有不孕不育，盡管體外受精-胚胎移植技術（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）成為治療不孕癥的有效手段，但仍有8%～10%的患者經(jīng)歷著反復著床失?。╮epeated implantation failure，RIF）而未能成功妊娠［1］。目前RIF 尚無統(tǒng)一的診斷標準，廣泛認同的定義是：年齡＜40 歲的女性，至少經(jīng)過3 次新鮮或者凍融胚胎移植周期，累計至少移植4 枚優(yōu)質(zhì)胚胎而未能獲得臨床妊娠為RIF［2］。

作為生殖領域的難點，RIF 患者病因不明，難以查找，因此無有效的處理手段。目前認為50%～60%的RIF 可能與子宮內(nèi)膜局部免疫相關，但臨床常用相關抗體檢查只能篩出合并有自身免疫性疾病的患者進行免疫治療，而對于非合并自身免疫疾病患者的治療，則不能提供治療依據(jù)［3］。雖然目前國內(nèi)外尚無相關指南或共識，嘗試性應用阿司匹林或免疫抑制劑已廣泛應用于臨床RIF 患者的治療，有研究認為預防性口服阿司匹林或者聯(lián)合應用強的松可作為有效的治療手段，但另有研究得出不一致的結(jié)果［4-8］，為了解目前臨床常用抗體檢查與預防性治療之間的關系，本課題組進行了該回顧性研究。

1 資料與方法

1.1 資料 回顧性分析2016年1月至2017年12月在北京大學第三醫(yī)院生殖醫(yī)學中心因RIF行解凍移植的患者臨床資料，所有患者信息來源于患者病歷、醫(yī)院信息中心與生殖中心數(shù)據(jù)庫。該回顧性研究經(jīng)本院倫理委員會批準，免除研究對象知情同意。

2016年1月至2017年12月期間共有1 078例患者診斷為RIF，即年齡＜40 歲至少經(jīng)過3 次新鮮或者凍融胚胎移植周期，累計至少移植4 枚優(yōu)質(zhì)胚胎而未能獲得臨床妊娠者。所有患者都曾進行過抗核抗體譜、抗心磷脂抗體檢查、狼瘡抗凝物、抗凝血酶、蛋白S、蛋白C、血小板聚集率等相關檢查，排除合并有系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者1 例，抗磷脂綜合征2 例，類風濕關節(jié)炎4 例，干燥綜合征3 例，未分化結(jié)締組織病患者6例，剩余1 062例RIF患者。

1 062 例患者中排除卵巢功能減退者48 例，即IVF 前檢查抗苗勒氏管激素（anti-mullerianbormone，AMH）≤1.1 μg/L［9］；排除合并子宮肌瘤者65 例，合并卵巢囊腫者32例，子宮完全或者不全縱隔者8例，單角子宮或雙子宮共5 例，排除有子宮黏連史移植前內(nèi)膜厚度≤7 mm 患者5 例，2 次移植前內(nèi)膜厚度≤7 mm患者12例，子宮腺肌癥或腺肌瘤患者43例，子宮內(nèi)膜異位癥12 例，排除有血栓史患者3 例，原發(fā)性血小板增多癥1 例，排除以上疾病后，剩余患者828例。

1.2 方法

1.2.1 分組及觀察指標 將1.1 中828 例患者，根據(jù)移植前是否曾用藥分為2 組，治療組為移植前開始用阿司匹林+強的松至少14 d者共450例患者，對照組為未用藥者共378 例患者。亞組分類：兩組患者中，將抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）比值為1∶80 者的患者篩選出來，其中ANA 1∶80 對照亞組72例和ANA 1∶80治療亞組106例，共178例。

此外，針對低補體C3、低補體C4、高免疫球蛋白A、高免疫球蛋白G、高免疫球蛋白E，從828 例兩組患者中，將單個指標符合以上檢查結(jié)果的患者篩選出來，共124 例，分別為個別抗體異常對照亞組56例和個別抗體異常治療亞組68例。

比較兩組間及各個對照亞組與治療亞組間移植后臨床妊娠率、胚胎著床率、早期流產(chǎn)率和持續(xù)妊娠率。

1.2.2 用藥方法及助孕情況 治療組患者阿司匹林應用：移植前后至少口服14 d，每日口服75～100 mg；強的松應用：移植前后至少口服14 d，每日5 mg。

所有患者均行解凍胚胎移植，移植方案有自然周期解凍移植和人工周期解凍移植兩種。自然周期解凍移植適用于月經(jīng)周期規(guī)律、能正常排卵者，B超監(jiān)測卵泡生長和排卵情況，排卵后第3 天解凍移植卵裂期胚胎或排卵后第5天移植囊胚期胚胎。人工周期適用于月經(jīng)周期不規(guī)律、長期持續(xù)無排卵或子宮內(nèi)膜生長不良者，于月經(jīng)周期第2～3 天開始口服戊酸雌二醇（補佳樂，德國先靈公司）4～6 mg/d，根據(jù)內(nèi)膜厚度調(diào)整劑量，內(nèi)膜厚度達到8 mm 以上時給予黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，4 d后解凍移植卵裂期胚胎或6 d 后解凍移植囊胚。囊胚率為移植囊胚數(shù)比胚胎總數(shù)［10］。

1.2.3 妊娠判斷及監(jiān)測 觀察指標包括：主要結(jié)局：臨床妊娠率，臨床妊娠率=臨床妊娠周期/移植周期，臨床妊娠指胚胎移植后28～30 d 超聲探及宮內(nèi)妊娠囊或臨床明確診斷異位妊娠者；次要結(jié)局：包括①早期流產(chǎn)率，早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期/臨床妊娠周期，早期流產(chǎn)指妊娠12 周前的胎兒丟失；②持續(xù)妊娠率，持續(xù)妊娠率=持續(xù)妊娠周期/移植周期，持續(xù)妊娠為宮內(nèi)妊娠活胎持續(xù)至妊娠10 周者；③胚胎著床率，胚胎著床率=有心管搏動的孕囊數(shù)/移植胚胎總數(shù)；監(jiān)測：移植后第14 天與21 天抽血查β-HCG，移植后第30天與第37天做盆腔彩超檢查。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。對于符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用表示，采用獨立樣本t檢驗進行組間比較。計數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 精確概率法進行，Logistic 多元逐步回歸分析影響臨床妊娠率的因素。所有檢驗以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 828例患者對照組與治療組間比較

2.1.1 828 例患者對照組與治療組間一般資料比較 828 例患者中，對照組與阿司匹林+強的松治療組患者在年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、不孕年限、抗繆勒氏管激素（anti-mullerian hormone，AMH）、基礎促卵泡生成素（follicle stimulatin hormone，F(xiàn)SH）和既往移植次數(shù)的比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在解凍移植周期時的轉(zhuǎn)化內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、囊胚率和自然周期率的比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

2.1.2 828 例患者對照組與治療組兩組間妊娠結(jié)局比較 治療組患者在此次解凍周期中的胚胎著床率與臨床妊娠率分別為36.12%與40.89%，數(shù)值上略高于對照組的33.91%與39.68%；早期流產(chǎn)率為17.39%，略低于對照組的18.00%，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 828例患者對照組與治療組兩組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.1 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 828 patients in two groups（）

表1 828例患者對照組與治療組兩組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.1 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 828 patients in two groups（）

根據(jù)移植胚胎的階段，分為卵裂期胚胎和囊胚期胚胎移植兩亞組。卵裂期胚胎移植亞組里，治療組胚胎著床率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率分別為27.45%、35.29%和26.14%，數(shù)值上略高于對照組的25.93%、33.33% 和24.44%，早期流產(chǎn)率為25.92%，低于對照組的26.67%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表2）。同樣地，在囊胚期胚胎移植亞組內(nèi)，治療組胚胎著床率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率分別為44.88%、43.77%和37.37%，稍高于對照組的42.60%、43.21%和37.04%，早期流產(chǎn)率治療組為14.61%，對照組為14.29%，但兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 828例患者兩組卵裂期胚胎與囊胚期胚胎解凍移植妊娠結(jié)局比較Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes after thawing cleavage embryo/blastocyst transfer of 828 patients in two groups

進一步就年齡、BMI、不孕年限、AMH、FSH、移植前內(nèi)膜厚度和移植胚胎數(shù)與臨床妊娠率之間進行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)均無相關性（表3）。

表3 臨床妊娠率影響因素多元回歸分析Tab.3 Multiple regression analysis of risk factors in clinical pregnancy rate

2.2 178 例ANA 抗體1∶80 患者治療組與對照組間比較 ANA 1∶80患者對照組與治療組的比較，兩組在年齡、BMI、不孕年限、AMH、基礎FSH、轉(zhuǎn)化內(nèi)膜厚度、囊胚率和移植胚胎數(shù)等一般情況的比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在該解凍移植周期中治療組的胚胎著床率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率數(shù)值均略高于對照組，但與早期流產(chǎn)率一樣，兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表4）。

表4 ANA 1∶80 對照組與治療組兩組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.4 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of ANA 1∶80 patients in two groups（）

表4 ANA 1∶80 對照組與治療組兩組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.4 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of ANA 1∶80 patients in two groups（）

同樣地，根據(jù)移植胚胎的階段，將兩組分為卵裂期胚胎和囊胚期胚胎兩亞組。兩個亞組中治療組的胚胎著床率、持續(xù)妊娠率、臨床妊娠率數(shù)值上都稍高于對照組，早期流產(chǎn)率都低于對照組，囊胚期胚胎移植亞組中治療組的早期流產(chǎn)率數(shù)值為13.79%，低于對照組的15.79%，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表5）。進一步就年齡、BMI、不孕年限、AMH、FSH、移植前內(nèi)膜厚度和移植胚胎數(shù)與臨床妊娠率之間進行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)均無相關性。

表5 ANA 1∶80患者兩組卵裂期胚胎與囊胚期胚胎解凍移植妊娠結(jié)局比較Tab.5 Comparison of pregnancy outcomes after thawing cleavage embryo/blastocyst transfer of ANA 1∶80 patients in two groups

2.3 124例1個指標異?；颊咧委熃M與對照組間比較 兩組間在低補體C3率、低補體C4率、高免疫球蛋白A 率、高免疫球蛋白E 率和高免疫球蛋白G 率、年齡、BMI、不孕年限、AMH、基礎FSH等一般情況的比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表6）；在該解凍移植周期時的轉(zhuǎn)化內(nèi)膜厚度、囊胚率、移植胚胎數(shù)和胚胎著床率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率和早期流產(chǎn)率等的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表6），無論是在卵裂期胚胎亞組內(nèi)，還是囊胚期胚胎亞組內(nèi)，治療組的胚胎著床率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率數(shù)值上都稍高于對照組，早期流產(chǎn)率略低于對照組，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表7）。

表6 124例個別抗體陽性患者對照與治療組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.6 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 124 patients with one abnormal antibodies in two groups（）

表6 124例個別抗體陽性患者對照與治療組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.6 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 124 patients with one abnormal antibodies in two groups（）

表7 124例個別抗體陽性患者兩組卵裂期胚胎與囊胚期胚胎解凍移植妊娠結(jié)局比較Tab.7 Comparison of pregnancy outcomes after frozen thawed embryo transfer in 124 cases of individual antibodies positive normal antibodies in two groups

3 討論

胚胎的侵入是一個生理性的炎癥過程，是胚胎與子宮內(nèi)膜間免疫微環(huán)境破壞重建并維持平衡的過程，局部免疫功能紊亂可以降低子宮內(nèi)膜容受性，導致RIF［11-13］。盡管機制尚未明了，甾體激素、羥氯喹、強的松、他克莫司、淋巴細胞主動免疫、聚落刺激因子、被動免疫治療如靜脈注射免疫球蛋白等已經(jīng)嘗試性應用于臨床，其中強的松因相對安全、方便價廉，與阿司匹林聯(lián)合應用最多，但是療效未得到證實［14-17］。一項隨機對照研究對既往1～2 周期ICSI失敗的195 例患者給予強的松+阿司匹林治療，認為治療后可利于提高胚胎種植率［18］；另外一項前瞻性研究認為，對于抗卵巢抗體陽性的既往兩周期IVF 失敗的患者，強的松應用可以提高著床率與妊娠率［19］；然而，另有回顧性研究發(fā)現(xiàn)，對既往≥2 周期IVF 失敗的患者，強的松+阿司匹林的臨床應用不能改善患者最終妊娠結(jié)局［20］。本研究回顧性分析也得出類似的結(jié)果，雖然數(shù)值上胚胎著床率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率略有提高，早期流產(chǎn)率略有下降，但是無顯著性差異。

育齡期間常見的自身免疫系統(tǒng)疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、類風濕關節(jié)炎、橋本甲狀腺炎、結(jié)締組織病和抗磷脂抗體綜合癥，其中抗磷脂抗體綜合癥是最影響妊娠結(jié)局和最容易導致妊娠不良結(jié)局發(fā)生的自身免疫性疾病，免疫抑制劑、阿司匹林與肝素治療可以明顯改善生殖結(jié)局和妊娠結(jié)局［21-22］。RIF 患者中僅有4.3%～8.0%的患者被發(fā)現(xiàn)患有上述自身免疫性疾病可以進行相應治療，而70%～85%患者就目前常見免疫學相關檢查不能發(fā)現(xiàn)異?；蛘邇H個別指標異常而不能診斷為自身免疫性疾?。?3］。在常見的免疫抗體檢查中，ANA 是一組對細胞核內(nèi)的DNA、RNA、蛋白或這些物質(zhì)的分子復合物產(chǎn)生的自身抗體，是最常見的陽性指標，常見于各種自身免疫疾病，在健康人群中單純陽性率為13.45%，一般認為可以不需治療，定期風濕免疫科隨訪即可［24］，而RIF 人群中外周血ANA 陽性率可增高達15%～20%，認為在內(nèi)膜局部或者卵泡液中陽性可能導致細胞的異常凋亡而影響著床，但是缺乏系統(tǒng)基礎研究和較少的臨床研究，目前認為ANA 1∶80 不需要治療，定期復查與隨訪觀察［25］；FAN 等［26］的研究選擇了133 例ANA 陽性≥1∶160 的IVF-ET 患者，其中60 例在IVF-ET 之前3 個月開始口服強的松10 mg/d+阿司匹林100 mg/d，同時比較73例未用藥的患者，發(fā)現(xiàn)ANA陽性患者進行治療后可以明顯增加著床率，減少早期流產(chǎn)率，但是該研究沒有將ANA 1∶80 的患者納入研究范圍。本研究回顧性分析首次將ANA 為1∶80 的臨界患者作為觀察對象，發(fā)現(xiàn)ANA 陽性患者經(jīng)阿司匹林+強的松數(shù)值上可以提高著床率與臨床妊娠率數(shù)值，降低早期流產(chǎn)率，但是與未治療組比較無顯著性差異。

在臨床常用RIF 免疫學檢查中，補體系統(tǒng)是體內(nèi)重要的免疫效應系統(tǒng)和放大系統(tǒng)，參與免疫調(diào)節(jié)與抗感染，補體C3、C4 是補體系統(tǒng)中含量最高的成分，在生殖領域中補體系統(tǒng)參與了早期的精卵結(jié)合，近年在卵巢組織中測序到補體的存在，認為補體參與了卵巢局部組織的重建［27］。此外，免疫球蛋白是血液和組織液中的一類糖蛋白，由B 淋巴細胞接受抗原刺激后增殖分化生成的漿細胞產(chǎn)生，能與相應抗原特異性結(jié)合，是介導體液免疫的重要效應分子，然而，補體系統(tǒng)與免疫球蛋白在子宮內(nèi)膜局部免疫微環(huán)境及在著床過程中的作用尚不清楚，亦未見與RIF患者的相關研究［28］。本研究回顧性分析將補體C3、補體C4、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白E抗體檢查中單個指標異常的患者篩選出來，發(fā)現(xiàn)阿司匹林+強的松后可以提高胚胎著床率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率的數(shù)值，降低早期流產(chǎn)率，但是與未治療組相比無顯著統(tǒng)計學差異。

目前針對有自身免疫性疾病擬輔助生育的患者，已經(jīng)形成共識，認為通過風濕免疫科規(guī)律有效的免疫治療后可以改善生殖結(jié)局。然而，針對無明確自身免疫性疾病的RIF 患者或者反復流產(chǎn)的患者，在生殖領域進行免疫療法以改善生殖結(jié)局是有爭議的，部分研究認為可以提高胚胎著床率、降低早期流產(chǎn)率，但多項前瞻性研究認為免疫療法并不能提高IVF-ET患者活產(chǎn)率，建議免疫療法應用于研究，或者更準確地篩選出適宜干預的患者，而不應用于常規(guī)臨床實踐以改善生殖結(jié)果［5，11］。

綜上所述，該研究結(jié)果提示對于不具有自身免疫性疾病的RIF患者，阿司匹林+強的松的治療不能顯著改善生殖結(jié)局，而針對ANA 1∶80 的患者、單獨一個低補體C3/C4 或者單獨高免疫球蛋白的患者，阿司匹林+強的松的治療也不能顯著提高胚胎著床率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率，降低早期流產(chǎn)率。然而，鑒于該研究樣本量小，為回顧性研究，存在回顧性研究的局限性和臨床樣本少的缺陷，不能完全客觀準確評估，因此關于強的松或其他免疫抑制劑的臨床應用，需要擴大樣本量和開展大規(guī)模的多中心前瞻性研究，并進行相關的基礎研究，可以更準確地篩選患者和提高RIF 患者的治療效果，同時為RIF患者的治療提供理論依據(jù)。