前胃泌素釋放肽ProGRP生物信息學(xué)分析及抗原決定簇預(yù)測①

郭玉鳳 張 婷 張 超 薛振偉 孔曉娜 周小林

（中國輻射防護研究院，太原 030006）

肺癌是發(fā)病率和病死率都極高的惡性腫瘤，其中小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）約占15%～20%［1］。SCLC的特點是瘤體倍增時間短、預(yù)后差、分化程度最低、極易轉(zhuǎn)移，但其對放化療敏感［2］，因此SCLC 的早期診斷和治療至關(guān)重要。前胃泌素釋放肽（pro-gastrin-releasing peptide，ProGRP）是SCLC的可靠、靈敏、特異性的腫瘤標志物，在血液中相對穩(wěn)定，已被用于SCLC早期臨床診斷［2］。ProGRP 由信號肽（1～23）、胃泌素釋放肽（gastrinreleasing peptide，GRP）（24～50）、酶切位點（51～53）、恒定區(qū)（54～121）以及可變的羧基末端組成［3］。隨著基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展，治療性抗體藥物逐漸占據(jù)全球市場，用于對惡性腫瘤和自身免疫病等疾病的診斷和治療［4-5］?？筆roGRP 單克隆抗體及基因工程抗體的研制是SCLC 診治方向之一。本研究應(yīng)用不同生物信息學(xué)方法分析了ProGRP 蛋白理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)以及抗原決定簇，為抗ProGRP 單克隆抗體的鑒定及SCLC診治奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料 通過NCBI 網(wǎng)站獲取ProGRP 蛋白的氨基酸序列。

1.2 方法

1.2.1 ProGRP 序列比對及理化性質(zhì)分析 通過EBI 提供的在線Clustalw 工具（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/）對ProGRP 氨基酸序列進行比對，Blast分析序列相似性。通過在線工具Expasy Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測ProGRP的理化性質(zhì)。

1.2.2 ProGRP跨膜區(qū)分析 通過在線軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析ProGRP的跨膜區(qū)。

1.2.3 ProGRP 二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)分析 通過DNAstar Protean 軟件中的Garnier-Robson 和Chou-Fasman 方法綜合分析ProGRP 二級結(jié)構(gòu)。其中Garnier-Robson 是基于氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，Chou-Fasman 是基于氨基酸序列的晶體結(jié)構(gòu)來預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。將ProGRP蛋白的氨基酸序列分別提交至Swiss Model（https：//www.swissmodel.expasy.org/）在線工具，通過同源建模的方法模擬蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 ProGRP 抗原決定簇預(yù)測 應(yīng)用DNAstar Protean 軟件中的Kyte-Doolittle 和Hopp-Woods 方法綜合分析ProGRP 親水性與疏水性；用Emini 方法分析蛋白表面可及性；用Karplus-Schulz方法分析蛋白的柔韌性；用Jameson-Wolf 分析序列的抗原指數(shù)。應(yīng)用在線工具BepiPred-2.0（http：//tools.iedb.org/bcell/）和ABCpred（http：//webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）預(yù)測ProGRP潛在的抗原決定簇。

2 結(jié)果

2.1 ProGRP同型異構(gòu)體氨基酸序列比對 ProGRP具有3個同型異構(gòu)體，NP編號分別為NP_002082.2，NP_001012530.1，NP_001012531.1。ProGRP 同 型異構(gòu)體序列比對（圖1）結(jié)果顯示，3 個亞型的第1～121位的氨基酸序列完全一致，NP_002082.2與NP_001012530.1 和NP_001012531.1 的相似性分別為95.27%和99.18%。

圖1 ProGRP同型異構(gòu)體氨基酸序列比對及分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 ProGRP isoform amino acid sequence alignment and molecular structure diagram

2.2 ProGRP 的理化性質(zhì)分析 通過Protparam 分析ProGRP 3個亞型的理化性質(zhì)，結(jié)果如表1所示。

表1 ProGRP不同亞型的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果Tab.1 Prediction results of physical and chemical properties of ProGRP different subtypes

2.3 ProGRP的跨膜區(qū)預(yù)測 TMHMM分析ProGRP跨膜區(qū)結(jié)果表明，ProGRP 無跨膜螺旋區(qū)，整個氨基酸序列皆在細胞膜外（圖2）。

圖2 ProGRP跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果Fig.2 Prediction results of transmembrane area in ProGRP

2.4 ProGRP 二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)分析 分析ProGRP 同型異構(gòu)體氨基酸序列的相同區(qū)域，即ProGRP（1～121），發(fā)現(xiàn)α 螺旋主要位于第1～18、42～50、61～92、119～121 位氨基酸殘基；β 折疊主要形成在第23～26、31～37、43～46 位氨基酸殘基；β 轉(zhuǎn)角主要位 于 第1～4、18～22、27～30、38～41、51～52、54～61、63～66、93～96、98～111、114～118位氨基酸殘基；無規(guī)則卷曲位于第30～31、42～43、53～60、97～100、103～104、107～109、111～113位氨基酸殘基（圖3A）。

圖3 ProGRP二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及同源建模Fig.3 Secondary structure prediction and homology modeling of ProGRP

通過Swiss Model 同源建模法對ProGRP 三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，選擇方法為X-ray，2.80?，模板為3kxy.2.C，模板序列與目的蛋白序列相似度為36%，從第45 位丙氨酸（Ala，A）到第105 位甘氨酸（Gly，G），共模擬出61個氨基酸（圖3B）。

2.5 抗原決定簇預(yù)測

2.5.1 用DNAstar Protean 軟件預(yù)測ProGRP抗原決定簇相關(guān)性質(zhì) 分析ProGRP（54～121）親水性與疏水性、表面可及性、蛋白柔韌性以及抗原指數(shù)（圖4），ProGRP（54～121）親水性區(qū)域分布廣泛，主要位于第54～82 和89～121 位氨基酸殘基；ProGRP（54～121）呈現(xiàn)的表面可及性大于1 的區(qū)域在54～57、64～76、78～81、90～102 和106～121 區(qū)域；ProGRP（54～121）柔韌性區(qū)域存在于第58～72 和90～118 位氨基酸殘基；抗原指數(shù)較高區(qū)域位于第54～73、75～82和88～121位氨基酸。

圖4 ProGRP（54～121）的DNAstar Protean預(yù)測結(jié)果Fig.4 DNAstar Protean prediction results of ProGRP（54～121）

2.5.2 通過BepiPred-2.0 在線預(yù)測ProGRP（54～121）抗原結(jié)合區(qū)域應(yīng)用BepiPred-2.0 預(yù)測ProGRP（54～121）抗原結(jié)合區(qū)域，設(shè)置閾值為0.5，結(jié)果顯示ProGRP（54～121）具有兩個可能的抗原結(jié)合區(qū)域，分別為第58～76 位氨基酸殘基和第89～118 位氨基酸殘基（圖5）。

圖5 ProGRP（54～121）的BepiPred-2.0在線預(yù)測結(jié)果Fig.5 BepiPred-2.0 prediction results of ProGRP（54～121）

2.5.3 通過ABCpred 在線預(yù)測ProGRP（54～121）抗原決定簇 通過ABCpred 預(yù)測ProGRP（54～121）抗原決定簇，采用遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)計算方法，設(shè)置閾值為0.51。結(jié)果如表2所示，共有5個肽段可作為抗原決定簇。

表2 ProGRP（54～121）的ABCpred抗原決定簇預(yù)測結(jié)果Tab.2 ProGRP（54～121）epitope prediction results by ABCpred

3 討論

蛋白質(zhì)是否為親水性蛋白主要取決于蛋白表面的電荷量［6］。ProGRP 具有3 個同型異構(gòu)體，其親水性平均值為負數(shù)，說明該蛋白為親水性蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)大于40 表明蛋白可能不穩(wěn)定［7］。ProGRP穩(wěn)定性指數(shù)明顯大于40，說明該蛋白不穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)為脂肪族側(cè)鏈（丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸）占據(jù)的相對體積，被認為是增加球蛋白熱穩(wěn)定性的積極因素［7］。ProGRP 同型異構(gòu)體脂肪族指數(shù)分別為75.14、73.33和87.61，可在一定程度上增加蛋白穩(wěn)定性。ProGRP 半衰期長達30 h，作為免疫抗原，其可在宿主體內(nèi)穩(wěn)定存在較長時間。ProGRP 具有N-端信號肽，有信號肽的蛋白大多被分泌到膜外發(fā)揮作用；在線軟件TMHMM 預(yù)測結(jié)果表明，ProGRP無跨膜區(qū)，其氨基酸殘基全部在膜外，說明ProGRP分泌后被運輸?shù)侥ね狻?/p>

ProGRP 含有α 螺旋、β 折疊、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲多種二級結(jié)構(gòu)。其中α 螺旋、β 折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則、形態(tài)固定、一般位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，難以與抗體嵌合；而β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲多處于蛋白質(zhì)表面，結(jié)構(gòu)突出，有利于與抗體嵌合，成為抗原表位的可能性大［8］。通過對ProGRP 二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測以及Swiss Model 同源建模發(fā)現(xiàn)，ProGRP 序列中第51～66 位氨基酸以及第93～118 位氨基酸區(qū)域主要為β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，可能分布有較好的抗原決定簇。天然蛋白質(zhì)的抗原決定簇一般為6～12 個氨基酸殘基。此外應(yīng)滿足以下條件：形成β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的片段、高親水性、高的表面可及性，避免出現(xiàn)4個以上連續(xù)相鄰的疏水氨基酸殘基，且疏水性殘基數(shù)不能超過6個［9］。

DNAstar Protean 分析了蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、蛋白柔韌性以及抗原指數(shù)等多個參數(shù)，綜合各項參數(shù)篩選出ProGRP 的以下幾段抗原結(jié)合位點：第58～73、75～82、90～102 和106～118 位氨基酸殘基。該軟件是在氨基酸一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上預(yù)測抗原結(jié)合位點，但它忽略了各氨基酸之間的分子作用力，因此對構(gòu)象依賴抗原表位的預(yù)測有一定局限性。BepiPred-2.0 在線工具預(yù)測出兩個可能的抗原結(jié)合區(qū)域：第58～76 和89～118 位氨基酸殘基，該方法基于Random Forest 算法對根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)確定的表位和非表位氨基酸進行預(yù)測，這種方法的性能優(yōu)于其他基于序列的表位預(yù)測工具［10］。ABCpred基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測抗原表位，是應(yīng)用比較廣泛并具有較高準確率的預(yù)測方法［11］，通過分析預(yù)測出以下抗原決定簇：第55～70、74～89、84～99、92～107以及102～117位氨基酸殘基。依據(jù)天然蛋白質(zhì)抗原決定簇的性質(zhì)，綜合DNAstar Protean，BepiPred-2.0和ABCpred 預(yù)測結(jié)果，從ProGRP（54～121）肽段中篩選重復(fù)性較高的區(qū)域，預(yù)測出以下5 個抗原決定簇：第58～64、65～74、76～83、91～102、105～118位氨基酸。

1994年MIYAKE等［12］研究發(fā)現(xiàn)血清ProGRP（54～121）的測定在SCLC 患者診斷和治療中起著重要作用。1996 年TAKADA 等［13］通過實驗研究發(fā)現(xiàn)ProGRP（54～121）作為SCLC 特異性腫瘤標志物的靈敏度比神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）更高。目前，國內(nèi)外已研制出幾種ProGRP 檢測試劑盒，其中Perkin Elmer推出的時間分辨免疫熒光分析法（TR-IFMA），Roche推出的Elecsys電化學(xué)發(fā)光法以及蘇州長光華醫(yī)推出的吖啶酯標記化學(xué)發(fā)光ProGRP 定量檢測試劑使用的單抗皆與ProGRP（54～121）肽段中第71～75 位和第80～84 位氨基酸殘基結(jié)合［3，14］；Abbot 推出的ARCHITECT 化學(xué)發(fā)光試劑應(yīng)用的抗體可以結(jié)合第94～98 位和第107～111 位氨基酸殘基［15］，這些肽段皆與本研究預(yù)測的抗原決定簇有一定重復(fù)。中國輻射防護研究院以ProGRP（54～121）為抗原研制出了不同ProGRP 單克隆抗體細胞株，并且通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，其中E12 細胞株表達的單抗與ProGRP（54～121）肽段中第91～105 位氨基酸殘基結(jié)合［16-17］。本研究綜合不同生物信息學(xué)方法篩選出ProGRP 的多個抗原決定簇，后期可通過ELISA 鑒定單克隆抗體的抗原結(jié)合位點以驗證本研究結(jié)果，為應(yīng)用抗ProGRP 抗體進行SCLC診療奠定良好的基礎(chǔ)。