微小RNA-33a 對平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制研究

常崢崢，林飛，趙暉，李揚，劉懿，李東旭，趙國安

動脈粥樣硬化（AS）是冠心病等疾病的病理基礎(chǔ)，而冠心病等心腦血管疾病嚴重危及生命健康，每年導致大量患者死亡[1]。平滑肌細胞（SMC）表型轉(zhuǎn)化是AS 發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。正常情況下，SMC 位于血管中膜，起著收縮血管和保持血管彈性的功能，此時的SMC 為收縮表型，細胞高度分化，特點是低增殖率、低遷移率和分泌少量細胞外基質(zhì)，標志物有平滑肌肌動蛋白α（ACTA2）、平滑肌22α（TAGLN）、肌球蛋白重鏈11（MYH11）、鈣調(diào)蛋白1（CNN1）等。而血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）可誘導SMC 去分化，從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，SMC 增殖能力、遷移能力及合成細胞外基質(zhì)能力升高，具有部分“干細胞”潛質(zhì)，其標志物骨橋蛋白（OPN）表達升高，從而促進AS 的進展[2]。因此，探究SMC 表型轉(zhuǎn)化相關(guān)調(diào)節(jié)機制可以為AS的診療提供新的觀點。

微小RNA（miRNA）是一類保守的、小的（22～24個核苷酸）非編碼RNA，位于基因組內(nèi)或基因序列中。miRNA 是轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過與靶基因信使RNA（mRNA）結(jié)合，以降解并抑制翻譯來發(fā)揮作用，單個miRNA 可能同時影響數(shù)百甚至數(shù)千個基因[3]，或數(shù)個miRNA 同時調(diào)節(jié)一個基因。而miRNA 在SMC 表型轉(zhuǎn)化中是否發(fā)揮重要調(diào)控作用，目前尚不明確。因此，尋找未在SMC 表型轉(zhuǎn)化中研究或研究較少的miRNA 具有重要意義。

miR-33a 在AS 中的作用主要是通過介導三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1（ABCA1）的表達來影響巨噬細胞膽固醇代謝[4]，在腫瘤方面還可通過周期蛋白依賴性激酶-6（CDK-6）來影響細胞增殖[5]。而miR-33a 是否對SMC 具有調(diào)控作用，能否參與其表型轉(zhuǎn)化，文獻報道較少。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路作為經(jīng)典通路具有多種功能：是細胞內(nèi)重要的信號傳導通路，影響缺氧誘導因子1的表達[6]，影響細胞的增殖、凋亡、自噬等過程[7]。本研究旨在探究miR-33a 是否通過PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控SMC 表型轉(zhuǎn)化，為AS 的機制研究提供可參數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

主要材料：原代人主動脈SMC（HASMC）及SMC 培養(yǎng)基（SMCM）購于美國Sciencell 公司，PDGF-BB 購于美國R&D 公司，噻唑藍（MTT）、二奎啉甲酸（BCA）試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，多聚賴氨酸（PLL）購于北京索萊寶科技有 限 公 司，miR-33a、ACTA2、TAGLN、OPN 及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物合成于蘇州金唯智生物科技有限公司，miRNA 及mRNA 反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒購于TaKaRa 公司，miRNA 沉默（inhibitor）、過表達（mimics）、無義序列（NC）、沉默NC（inhibitor NC）由上海吉瑪基因生物有限公司合成，脂質(zhì)體Lipofectamine RNAiMAX Reagent 購買于美國賽默飛世爾科技公司，放射免疫沉淀測定（RIPA）蛋白裂解液購于上海雅酶生物科技有限公司，磷酸化兔抗p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 購 于 美 國Cell Signaling Technology 公司，鼠抗β 肌動蛋白（β-actin）購于美國Proteintech 生物公司。

細胞培養(yǎng)：首先PLL 包被培養(yǎng)瓶（皿），用含5%胎牛血清及含有SMC 生長因子的SMCM 于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培育、傳代，第3～7 代用于實驗。

細胞處理：HASMC 接種于96 孔板，分別給予不同濃度（10、20、50、80、100 ng/ml）PDGF-BB處理24 h、48 h。HASMC 接種于60 mm 培養(yǎng)皿，加入20 ng/ml PDGF-BB 處理48 h。

實驗分組：確定用藥濃度后分為對照組、PDGF-BB 組（20 ng/ml PDGF-BB 誘 導HASMC）；轉(zhuǎn)染細胞48 h 后分為NC 對照組、miRNA 過表達組（miR-33a mimics）、沉默NC+誘導組（inhibitor NC+PDGF-BB 誘導HASMC）、miRNA 沉默+誘導組（miR-33a 敲減inhibitor+PDGF-BB 誘導HASMC）。

細胞增殖檢測：PDGF-BB 分別處理細胞24 h 及48 h 加入MTT（20 μl/孔），37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，加二甲基亞砜150 μl 溶解藍紫色結(jié)晶甲臜，酶聯(lián)免疫檢測儀測A490 nm 波長吸收值。計算細胞活力公式為：細胞活力=（處理組A 值-空白組A 值）/（對照組A 值-空白組A 值）×100%。

細胞遷移能力檢測（細胞劃痕實驗）：細胞接種于背后劃線的6 孔板，待第二天貼壁后用槍頭劃線，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3 次，分別加入不同 濃 度（10、20、50、80、100 ng/ml）PDGF-BB，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在0、24、48 h 取樣拍照。

miRNA 篩選：為尋找可能在SMC 表型轉(zhuǎn)化中具有調(diào)控作用的miRNA，將建立好的模型細胞送做RNA 測序，根據(jù)測序結(jié)果挑選在模型中表達存在差異的miRNA，并進行驗證。

驗證miR-33a 功能：細胞傳代至6 孔板（2×105個/孔），生長至70%～80%融合時進行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine?RNAiMAXReagent 轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，應用無血清的SMCM 分別稀釋miR-33a inhibitor、inhibitor NC、miR-33a mimics、NC（轉(zhuǎn)染混合液A）及 轉(zhuǎn) 染 試 劑Lipofectamine?RNAiMAX Reagent（轉(zhuǎn) 染混合液B），轉(zhuǎn)染混合液A 及轉(zhuǎn)染混合液B 按1：1 體積充分混勻，室溫孵育5 min 后滴入6 孔板，輕搖均勻，放入細胞培養(yǎng)箱。NC 對照組、miRNA 過表達組給予更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；沉默NC+誘導組、miRNA 沉默+誘導組更換含PDGF-BB 終濃度為20 ng/ml 的新鮮培養(yǎng)基溫箱孵育48 h。

RT-qPCR 檢 測：PBS 清 洗 細 胞2 遍， 加 入RNAisoplus 試劑裂解細胞，混勻震蕩后冰上裂解10 min；加入三氯甲烷200 μl，冰上靜置15 min 后，4℃離心機12 000 轉(zhuǎn)/min，離心15 min；加入異丙醇500 μl，冰 上 靜 置10 min，4 ℃離 心 機，12 000 轉(zhuǎn)/min，離心10 min，棄上清保留沉淀，75%乙醇清洗沉淀后應用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解。超微量分光光度儀檢測RNA 濃度及純度（A260/A280 比值在1.8～2.0）。TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行miRNA 及mRNA 反轉(zhuǎn)錄，擴增試劑盒進行RT-qPCR，檢測miRNA、mRNA 表達情況，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

蛋白免疫印跡（Western blot）分析：RIPA 法提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。等量上樣，用10%和12% SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝膠，電泳上層膠60 V 40 min，下層膠100 V 90 min，轉(zhuǎn)膜[聚偏二氟乙烯（PVDF）膜]300 mA 90 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，次日TBST 緩沖液洗膜后，二抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)成像顯影，ImageJ 軟件進行灰度值分析。

統(tǒng)計學方法：采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析、GraphPad Prism 8 繪圖。計量資料采取均數(shù)±標準差（±s）表示，多組分析采用單因素方差分析，組間比較采取LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化模型建立

細胞增殖率檢測：MTT 檢測結(jié)果顯示，與不處理相比，使用不同濃度（10、20、50、80、100 ng/ml）PDGF-BB 分別誘導24 h、48 h 后，HASMC 的增殖率均明顯升高（P均＜0.01），其中以20 ng/ml 濃度處理48 h 后增值率[（183.607±6.188）%]升高最為明顯[不處理時為（100.000±3.756）%，P＜0.0001]。

細胞遷移能力檢測：細胞劃痕實驗顯示，與不處理相比，使用不同濃度（10、20、50、80、100 ng/ml）PDGF-BB 分別誘導24 h、48 h 后，HASMC的遷移率均明顯升高，其中以20 ng/ml 處理48 h時遷移率升高最明顯。因此，結(jié)合MTT 檢測與細胞劃痕實驗結(jié)果后，最終選擇PDGF-BB 濃度為20 ng/ml處理48 h作為SMC表型轉(zhuǎn)化模型建立的濃度。

SMC 標志物表達量檢測：RT-qPCR 檢測結(jié)果顯 示，PDGF-BB 組HASMC 經(jīng) 誘 導 后，ACTA2、TAGLN mRNA 表 達 水 平（ 分 別 為0.081±0.004、0.235±0.010）較對照組（1.003±0.095、1.001±0.054）均明顯下降（P均＜0.0001），OPN mRNA 表達水平（3.472±0.227）較對照組（1.017±0.235）則明顯升高（P＜0.001）。Western blot 結(jié)果也顯示，與對照組相比，PDGF-BB 組HASMC 經(jīng) 誘 導 后，ACTA2、MYH11、CNN1 蛋白表達量均下降，OPN 蛋白表達量則升高（P均＜0.05），見圖1。

圖1 Western blot 檢測PDGF-BB 誘導對HASMC 表型轉(zhuǎn)化相關(guān)標志物蛋白表達量的影響(n=3)

PI3K/Akt/mTOR 通路檢測（圖2）：Western blot 結(jié)果顯示，與對照組比較，PDGF-BB組HASMC經(jīng)誘導后，p-PI3K（1.00±0.02 vs. 1.11±0.01）、p-Akt（1.00±0.04 vs. 1.90±0.01）、p-mTOR（1.00±0.03 vs. 1.12±0.01）蛋白表達量均升高（P均＜0.05），說明PDGF-BB 誘導可激活PI3K/Akt/mTOR 通路，影響SMC 表型轉(zhuǎn)化。

圖2 Western blot 檢測PDGF-BB 誘導對HASMC 中PI3K/Akt/mTOR 蛋白表達量的影響(n=3)

2.2 miRNA 篩選及驗證

從測序結(jié)果中挑選表達量具有差異的miRNA進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-33a 差異最明顯。

2.3 驗證miR-33a 在平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化中的功能

與NC 對照組相比，miRNA 過表達組細胞中miR-33a 表達量顯著升高（P＜0.001），ABCA1、ACTA2、TAGLN mRNA 表達水平顯著降低（P分別＜0.001、＜0.01、＜0.05），見圖3。

圖3 RT-qPCR 檢測過表達miR-33a 對HASMC 中miR-33a（3A）及各標志物mRNA（3B）表達量的影響(n=3)

與 沉 默NC+ 誘 導 組 相 比，miRNA 沉 默+ 誘導組細胞中miR-33a 表達量顯著降低，ABCA1、ACTA2 mRNA 表達水平均顯著升高，OPN mRNA 表達水平顯著降低（P均＜0.01），見圖4。

圖4 RT-qPCR檢測沉默miR-33a+PDGF-BB誘導對HASMC中miR-33a（4A）及各標志物mRNA（4B）表達量的影響(n=3)

Western blot 結(jié)果顯示，與NC 對照組相比，PDGF-BB 組HASMC 經(jīng) 誘 導 后，ACTA2、CNN1 蛋白表達量均下降（P均＜0.001），OPN 蛋白表達量升高（P＜0.01）；miRNA 過表達組ACTA2、CNN1 蛋白表達量下降（P分別＜0.01 和＜0.05），OPN 蛋白表達量升高（P＜0.001）；與miRNA 過表達組相比，miRNA 沉默+誘導組ACTA2、CNN1 蛋白表達量均升高（P＜0.05 和＜0.01），OPN 蛋白表達量下降（P＜0.01），見圖5。

圖5 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染miR-33a 對HASMC 各標志物蛋白表達量的影響(n=3)

劃痕實驗結(jié)果顯示，與NC 對照組相比，miRNA 過表達組細胞遷移能力升高，而miRNA 沉默+誘導組細胞遷移能力降低，見圖6。

圖6 細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染miR-33a±PDGF-BB 處理后對HASMC 細胞遷移能力的影響(×4)

2.4 驗證miR-33a 對PI3K/Akt/mTOR 通路的影響（圖7）

圖7 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染miR-33a 對HASMC 中PI3K/Akt/mTOR 通路蛋白表達量的影響(n=3)

Western blot 結(jié)果顯示，與NC 對照組相比，PDGF-BB 組HASMC 的PI3K/Akt/mTOR 通路被激活；miRNA 沉默+誘導組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達量下降（P均＜0.05）；miRNA 過表達組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達量明顯高于miRNA 沉默+誘導組（P均＜0.01）。

3 討論

SMC 是血管的重要組成部分，正常情況下位于血管中膜，起到維持血管張力和收縮血管的功能。當內(nèi)皮損傷、存在血脂異常或慢性炎癥時，SMC 會被誘導去分化，從“收縮表型”轉(zhuǎn)化為“合成表型”，表現(xiàn)為收縮標志蛋白表達下降、細胞增殖和遷移能力升高[8]。本研究使用PDGF-BB 誘導HASMC 構(gòu)建表型轉(zhuǎn)化細胞模型，使SMC 從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，其增殖、遷移能力升高，收縮表型標志物ACTA2、TAGLN、CNN1 及MYH11 等表達降低，合成表型標志物OPN 表達升高，該過程參與AS 斑塊的發(fā)生和發(fā)展[9]，因此，探究SMC 表型轉(zhuǎn)化可以為AS 機制研究和治療靶點提供可參數(shù)據(jù)。

近年來的研究表明，很多miRNA 參與AS 的發(fā)生、發(fā)展。miR-22-3p[10]、miR-214-3p[11]調(diào)控SMC分 化；miR-302a 促 進SMC 的 增 殖 和 遷 移[12]；miR-34a 促進SMC 鈣化[13]；let-7 miRNA 家族可抑制SMC的炎癥反應[14]，miR-155 影響SMC 的表型轉(zhuǎn)化[15]，27nt-miRNA 可抑制SMC 凋亡[16]，均調(diào)控SMC 的功能，影響AS 的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在尋找在SMC 表型轉(zhuǎn)化中具有調(diào)控作用的miRNA，因此通過對正常SMC 和加PDGF-BB 誘導的SMC 進行測序分析，篩選表達有差異的miRNA 進行驗證，發(fā)現(xiàn)miR-33a 異常增高。miR-33a 是miR-33 家族（包括miR-33a 和miR-33b）一員，miR-33a 位于22 號染色體上SREBP-2 基因的第15 內(nèi)含子中，miR-33b 存在于17 號染色體上SREBP-1 基因的第17 內(nèi)含子中[17]。miR-33a 最重要的靶蛋白是ABCA1，而ABCA1 是細胞內(nèi)膽固醇從肝臟流出到載脂蛋白A1以產(chǎn)生高密度脂蛋白的關(guān)鍵介質(zhì)，因此miR-33a 主要與膽固醇代謝相關(guān)[18]。本研究通過沉默或過表達miR-33a 后檢測SMC 表型轉(zhuǎn)化相關(guān)指標，發(fā)現(xiàn)單純過表達miR-33a 后收縮表型標志物表達降低、合成表型標志物表達升高、SMC 的遷移能力得到提升，這提示miR-33a 有可能參與SMC 表型轉(zhuǎn)化；而PDGF-BB 誘導的同時沉默miR-33a 可逆轉(zhuǎn)PDGFBB 引起的表型轉(zhuǎn)化。由此，我們確定miR-33a 對SMC 表型轉(zhuǎn)化具有顯著的調(diào)控作用。

同時，使用PDGF-BB 誘導后SMC 發(fā)生表型轉(zhuǎn)化時，PI3K/Akt/mTOR 信號通路被激活。在AS 中，氧化型低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞即是通過PI3K/Akt/mTOR 信號傳導實現(xiàn)的[19]，當PI3K/Akt/mTOR 信號通路中的p-Akt 和p-mTOR 表達降低時，還可促進巨噬細胞自噬[20]。而且，PI3K/Akt/mTOR 信號通路的激活不僅可刺激內(nèi)皮細胞損傷[21]，還影響SMC 的增殖[22]和凋亡[23]。本研究在驗證miR-33a 對SMC 表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用的同時，還發(fā)現(xiàn)沉默或過表達miR-33a 可影響PI3K/Akt/mTOR 信號通路的激活狀態(tài)，說明miR-33a 可能通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路來發(fā)揮其對SMC 表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究顯示，miR-33a 可激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路，促進SMC 表型轉(zhuǎn)化，加快AS 的發(fā)生和發(fā)展，提示miR-33a 有成為AS 新治療靶點的可能，但其發(fā)揮作用的具體靶向與機制尚需進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突