鈣結(jié)合蛋白S100A16在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義

趙素月，張玲，鄭瑩，姚麗，王乾合，李迅,3，朱克祥,3

0 引言

胰腺癌是具有強(qiáng)侵襲性的惡性腫瘤[1]。胰腺癌患者臨床癥狀不易發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移率高，死亡率高，患者五年生存期短，生活質(zhì)量差[2-3]。全球范圍內(nèi)，胰腺癌是男性和女性癌癥第七大死亡原因[4]。因此迫切希望尋找到與胰腺癌相關(guān)基因，此基因具有早期診斷胰腺癌以及未來作為胰腺癌治療的靶標(biāo)等功能。為胰腺癌患者找到新的治療希望。S100蛋白家族是一個多基因的鈣結(jié)合家族，由25個成員組成，每個成員由一個單獨(dú)的基因編碼[5]。S100蛋白家族是一個低分子量的酸性鈣調(diào)節(jié)蛋白家族[6]。S100蛋白家族特征是存在兩個Ca2+調(diào)控的EF-hand型基序，c端是所有EF-hand蛋白的共同特征，另一個是n端S100家族特有。在c末端EF-hand區(qū)域之后是一段被稱為c末端延伸的氨基酸。在兩個EF-hand域之間的區(qū)域稱為鉸鏈。在不同的蛋白質(zhì)中，c端延伸和鉸鏈區(qū)域的可變性最大，因此它們決定了蛋白質(zhì)的特定生物學(xué)特性[7]。S100蛋白通過與靶蛋白相互作用，參與細(xì)胞生長、分化、運(yùn)動、收縮、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化、細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過程[8]。S100蛋白與炎性反應(yīng)、神經(jīng)退行性疾病、抑郁癥、唐氏綜合征、囊性纖維化和癌癥等許多疾病相關(guān)并參與其中[9]。S100A16是S100家族蛋白之一，從星形細(xì)胞瘤中分離出來，位于人類染色體1q21區(qū)域。S100A16在特定組織類型中廣泛表達(dá)，如脂肪組織和大腦[10]。S100A16還被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤密切相關(guān)。S100A16在膀胱癌、肺癌、胃癌和卵巢癌等多種癌癥中表達(dá)上調(diào)[11-14]。此外，S100A16的高表達(dá)與肺癌、前列腺癌和乳腺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)[15]。本研究通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)探討S100A16在胰腺癌中的表達(dá)及其臨床意義。利用PPI預(yù)測等預(yù)測S100A16相互作用基因，揭示 S100A16與胰腺癌的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象及數(shù)據(jù)收集

收集2015年6月—2019年12月于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普通外科確診為胰腺癌且已行胰腺癌根治術(shù)的65例患者的胰腺癌組織病理切片（其中包括胰腺癌及癌旁組織）。由我院病理科醫(yī)師采集標(biāo)本及制作蠟塊，所有的腫瘤標(biāo)本由病理科醫(yī)師確診為胰腺癌，且所取癌旁組織也經(jīng)證實(shí)為非腫瘤組織。納入的標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后病理學(xué)診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌；（2）手術(shù)達(dá)到R0切除的標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后病理學(xué)診斷為非胰腺導(dǎo)管腺癌的其他類型胰腺癌；（2）術(shù)前曾接受放療、化療等相關(guān)抗腫瘤治療。我們同時收集了所納入的65例胰腺導(dǎo)管腺癌患者相關(guān)臨床病理數(shù)據(jù)。納入內(nèi)容包括：性別、年齡、腫瘤的分化、TNM分期、血管侵犯、腫瘤部位、糖尿病病史、術(shù)前血清CA199水平、中位生存期。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，納入研究患者均已知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗人S100A16單克隆抗體，購自美國SAB公司，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)工作滴度最終適合濃度為1:100；UltraSensitive TM S-P超敏試劑盒，DAB 顯色劑盒均從福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司購得；二甲苯試劑、無水酒精試劑、不同濃度梯度配置的乙醇、蘇木精染液，實(shí)驗(yàn)于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗病理科完成。

1.3 S100A16的免疫組織化學(xué)染色及判定

制作好的組織蠟塊進(jìn)行切片，二甲苯脫蠟，檸檬酸抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，動物非免疫血清，一抗孵育：S100A16抗體使用一抗稀釋液稀釋至1:400，在2組玻片上分別滴加S100A16抗體和PBS（陰性對照），滴加生物素標(biāo)記的IgG聚合物，滴加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶，最后顯色和蘇木精對比染色。由兩位病理科老師單獨(dú)進(jìn)行閱片，閱片采用雙盲法。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷方法：陽性結(jié)果由染色指數(shù)所決定，染色指數(shù)SI=染色強(qiáng)度×染色范圍。染色強(qiáng)度的判斷：無色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；細(xì)胞的染色范圍判定：陽性細(xì)胞數(shù)占所有細(xì)胞總數(shù)的百分比，1%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%則為3分[16]。

1.4 隨訪

患者治療出院后采用電話隨訪方式進(jìn)行隨訪，隨訪時間由2015年6月截至2021年12月，出院后1月、3月、6月、12月，以后每半年隨訪一次。隨訪率為100%。

1.5 生物信息學(xué)分析方法

通過生物信息學(xué)方法，使用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫對S100A16基因進(jìn)行單基因預(yù)測分析，分析與S100A16相互作用蛋白。分子相互作用網(wǎng)絡(luò)圖展示了與目的基因有直接相互作用的所有分子之間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape的MCODE插件對S100A16蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析，得到與S100A16具有重要作用的蛋白。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用χ2檢驗(yàn)比較S100A16蛋白的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性。用Kaplan-Meier生存分析計算S100A16不同表達(dá)情況下的生存率，并繪制生存曲線。然后通過Log rank檢驗(yàn)法驗(yàn)證S100A16的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。運(yùn)用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行預(yù)后的單因素及多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100A16在胰腺癌與癌旁組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明S100A16主要在胰腺癌細(xì)胞膜中呈陽性表達(dá)，并且胞質(zhì)同時表達(dá)，胰腺癌組織中的S100A16陽性表達(dá)率明顯高于相應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.901,P=0.001），見表1、圖1。

表1 胰腺癌與相應(yīng)癌旁組織中S100A16的表達(dá)Table 1 Expression of S100A16 in pancreatic cancer and corresponding adjacent tissues

圖1 S100A16在胰腺癌(A,×400)和癌旁組織(B,×400)中的免疫組織化學(xué)結(jié)果Figure 1 Immunohistochemical results of S100A16 expression in pancreatic cancer(A,×400) and adjacent tissues(B,×400)

2.2 S100A16的表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性

S100A16蛋白的表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)中的血管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與其中的性別、發(fā)病年齡、腫瘤的發(fā)生部位、是否具有糖尿病史、術(shù)前CA199水平、腫瘤的分化程度、腫瘤大小和TNM分期無關(guān)，見表2。

表2 S100A16的表達(dá)與胰腺癌患者的臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性(n(%))Table 2 Correlation between S100A16 expression and clinicopathological parameters of pancreatic patients (n(%))

2.3 S100A16蛋白表達(dá)水平及臨床病理參數(shù)與胰腺癌患者總體生存時間的相關(guān)性

截至2021年12月，65例胰腺癌患者僅有5名患者生存。生存分析結(jié)果顯示S100A16表達(dá)水平是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素，并且S100A16蛋白表達(dá)陽性是S100A16蛋白表達(dá)陰性患者死亡風(fēng)險的1.528倍，見表3。

表3 S100A16蛋白表達(dá)水平及臨床病理參數(shù)與胰腺癌患者總生存時間的單因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analyses of S100A16 protein expression level,clinicopathological parameters and overall survival time of patients with pancreatic cancer

2.4 S100A16表達(dá)水平與胰腺癌患者生存時間的相關(guān)性

Kaplan-Meier生存曲線、Log rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示S100A16蛋白陽性表達(dá)組的中位生存時間為8月，S100A16蛋白表達(dá)陰性的中位生存時間為19月。S100A16蛋白陽性表達(dá)預(yù)后較陰性表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.037），見圖2。

圖2 胰腺癌組織中S100A16蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線Figure 2 Kaplan-Meier survival curves of pancreatic cancer patients with positive and negative expression of S100A16 protein

2.5 S100A16基因與其他相互作用基因預(yù)測

數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析分子相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，展示了與目的基因有直接相互作用的所有分子之間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖3。PPI預(yù)測S100A16相互作用蛋白包括S100A14、CPNE2、UBAC2、IDH3A、MDM2、STIM1、MSN、UCHL5、S100A13、SGSH、PERP、ESRRB、MPZL3、STMN1、PRDM1、PITX1、TMED10、TMEM9、IL36G、EPSTI1。使用Cytoscape的MCODE插件進(jìn)行關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析，其中S100A14、IL36G、PITX1、PERP在相互作用網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。

圖3 鈣結(jié)合蛋白S100A16 PPI分析結(jié)果和Cytoscape對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析圖（引自GeneMANIA數(shù)據(jù)庫）Figure 3 PPI analysis results of S100A16 and Cytoscape key sub-network analysis of PPI network (cited from GeneMANIA database)

3 討論

S100A16與腫瘤關(guān)系密切，在膀胱癌、肺癌、甲狀腺癌和卵巢癌等多種癌癥中表達(dá)上調(diào)。并且S100A16的高表達(dá)與肺癌、前列腺癌和乳腺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)[17-18]。本研究首先通過生物信息學(xué)方法得到S100A16基因在胰腺癌患者中高表達(dá)，高表達(dá)的患者具有較差預(yù)后。在癌癥大數(shù)據(jù)的支持下進(jìn)行了免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。該觀點(diǎn)在隨后的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中得到證明，S100A16表達(dá)水平是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素，并且S100A16蛋白表達(dá)陽性是S100A16蛋白表達(dá)陰性患者死亡風(fēng)險的1.528倍。通過分析S100A16共表達(dá)基因與其相互作用蛋白，我們可以得到S100A16與S100A14密切相關(guān)。Sapkota等[19]研究S100A16和S100A14在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的相互作用，發(fā)現(xiàn)S100A14的過表達(dá)和敲低會導(dǎo)致細(xì)胞系中S100A16蛋白的上調(diào)和下調(diào)。然而，在S100A14過表達(dá)時，S100A16 mRNA沒有上調(diào)，這表明對S100A16表達(dá)的調(diào)節(jié)不是由于增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，而是由于轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)。與之相反，S100A16過表達(dá)與S100A14蛋白表達(dá)無相關(guān)性，提示S100A14與S100A16之間存在單向調(diào)控。用蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺處理細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)S100A16和S100A14蛋白降解呈時間依賴性[19]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，S100A16和S100A14降解的調(diào)控不依賴于蛋白質(zhì)降解的經(jīng)典蛋白酶體和溶酶體途徑[19]。日本學(xué)者Tanaka研究S100A14、S100A16的表達(dá)與乳腺癌相關(guān)性，結(jié)果顯示兩個蛋白的共表達(dá)比單個蛋白表達(dá)更能預(yù)測乳腺癌的不良預(yù)后。并且S100A14和S100A16可通過與細(xì)胞骨架動力學(xué)的相互作用促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲活性[20]。S100A16與S100A14兩者是S100家族成員，位于同一染色體上。因此S100A16與S100A14關(guān)系并不明確，需要進(jìn)一步的研究。

我們使用生物信息學(xué)分析S100A16與胰腺癌的相關(guān)性，不僅獲得該基因特點(diǎn)，更為以后實(shí)驗(yàn)提供參考和指導(dǎo)。本研究認(rèn)為S100A16與胰腺癌關(guān)系密切，有望成為胰腺癌新的診斷、預(yù)后標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)。