傳統(tǒng)醬油發(fā)酵制曲菌種中的酶活分析及制曲工藝優(yōu)化

吳教培

（廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 中山 528415）

1 制曲菌種的主要類型及特點(diǎn)分析

1.1 米曲霉

米曲霉（見圖1）生長速度快，菌落在不同階段的色澤表現(xiàn)不同，初期以白色、黃色為主，成熟后呈現(xiàn)出黃綠色和淡綠褐色。溫度對米曲霉生長狀況的影響較為顯著，最佳溫度為30℃，低于28℃時菌體雖然增長但趨于緩慢，超過37℃時菌體代謝活動受到抑制，與此同時酶活也隨之降低。酸堿條件方面，pH 為6.0 時適宜米曲霉的生長。米曲霉屬于好氧微生物，因此通入足量氧氣是促進(jìn)其生長的關(guān)鍵。在醬油釀造中，為保證食品的品質(zhì)，需選擇優(yōu)質(zhì)的米曲霉菌種，其應(yīng)當(dāng)具備如下特點(diǎn)：①以蛋白酶為代表的酶系酶活高，此條件下可促進(jìn)原料的分解。②代謝產(chǎn)物“無害化”，即不存在黃曲霉素或是其他的有害物質(zhì)。③原料生長效率高。④基于米曲霉釀造的醬油有足夠的豉香味，整體品質(zhì)穩(wěn)定。

圖1 米曲霉實物（圖片來源：網(wǎng)絡(luò)）

在米曲霉菌株中，編號為滬釀3.042 的菌株主要特點(diǎn)是因為其生長速度快、酶蛋白活性高、適用范圍廣等，但也有局限之處——它的淀粉酶和酸性蛋白酶活力有限，發(fā)酵時的相應(yīng)的酶解能力偏弱，導(dǎo)致產(chǎn)品的品質(zhì)略微受到影響，例如醬油的風(fēng)味較為單薄。針對該菌株的應(yīng)用局限性，有關(guān)技術(shù)人員在原有基礎(chǔ)上加以誘變和改良，得到更具可行性的菌株。較之原菌株，經(jīng)過紫外誘變的手段得到的突變菌的遺傳穩(wěn)定性更可靠。

產(chǎn)蛋白性能提升；而通過紫外線和LiCl 復(fù)合誘變技術(shù)的應(yīng)用，蛋白酶活力顯著增強(qiáng)，在醬油釀造中的優(yōu)勢隨之凸顯，氨基酸態(tài)氮和全氮的含量均有提高。

1.2 黑曲霉

黑曲霉的主要適宜生長條件為：溫度37℃，pH5.6～6.0。得益于產(chǎn)糖化酶、淀粉酶能力較強(qiáng)的優(yōu)勢，醬油制造中常常用黑曲霉，在發(fā)酵時摻入適量后，可以分泌豐富的酸性蛋白酶，在該產(chǎn)物的促進(jìn)作用下，蛋白質(zhì)利用率得以提高，且該變化在發(fā)酵中后期體現(xiàn)得更為明顯，隨之帶來氨基酸液態(tài)生成率提升的變化。依托于糖化酶、淀粉酶的共同作用，美拉得反應(yīng)效率高，產(chǎn)生的基底物質(zhì)在改善醬油品質(zhì)方面效果良好，具體有：①促進(jìn)增香酵母的生長，使醬油具有更濃郁的香氣。②加快風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。不僅于此，黑曲霉分泌的其酶也依然具有利用價值，在改善醬油的風(fēng)味方面有積極作用。

1.3 紅曲霉

溫度最高35℃最低32℃，pH 在4.5 左右的環(huán)境條件適宜紅曲霉生長，并且它對于發(fā)酵底物的選擇很寬泛，能夠有效地應(yīng)用多種形式的氮源和碳源。紅曲霉對環(huán)境的抵抗性較好，在酸性、高溫環(huán)境中可維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，糖化增香曲是紅曲霉的重要產(chǎn)物。此外紅曲霉的酯化和糖化能力都很強(qiáng)，而糖化增香曲更是為釀造提供了優(yōu)質(zhì)的原材料。通過糖化增香曲的應(yīng)用，醬油中氨基酸態(tài)氮和總氮的含量均有增加的變化，醬油的綜合品質(zhì)得到提升，具體體現(xiàn)在色澤、香味、口感等多個方面，釀造出的醬油更加受到消費(fèi)者的青睞。

1.4 醬油曲霉

醬油曲霉與米曲霉相似，兩者的區(qū)別主要體現(xiàn)在酶的種類和活力兩個層面。在對堿性蛋白酶為參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比中，醬油曲霉的活力更強(qiáng)，并且其與大豆蛋白接觸后將高效促進(jìn)蛋白水解進(jìn)程。雖然醬油曲霉在釀造領(lǐng)域具有優(yōu)勢，但應(yīng)用范圍相對較窄，主要在日本醬油釀造中取得應(yīng)用，而絕大部分的醬油釀造普遍采用的是米曲霉等菌種。

2 試驗菌種與方法

2.1 菌種的選擇

將曲霉菌中進(jìn)行編號，得出表1。

表1 醬油制曲中需要用到的菌種

為制備曲霉菌斜面，2%瓊脂，5B1 麥芽汁斜面共同作為培養(yǎng)基，在該原始裝置的基礎(chǔ)上接種一環(huán)原種，隨后予以7～10d 的培養(yǎng)。

2.2 醬油種曲的制備方法

按照豆粕:麥麩:水=20:80:110 的比例選用適量的原材料，構(gòu)成混合物，向500mL 三角瓶中加入15g（要求選用的混合物有足夠的均勻性），予以40min 的滅菌處理，全過程中溫度均保持在121℃。按前述方法操作后，待其達(dá)到冷卻狀態(tài)時，接種兩環(huán)霉菌斜面孢子，再轉(zhuǎn)至30℃的恒溫環(huán)境中，持續(xù)72h 的培養(yǎng)。

2.3 菌種酶活力的表達(dá)

分多種情況考慮：以微克計算數(shù)據(jù)代表的酶活性單位u 的酶類型有：中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶；毫克計算數(shù)據(jù)表示的有糖化酶、谷氨酰胺酶；而以毫升計算數(shù)據(jù)來表示的只有淀粉酶。

3 試驗結(jié)果分析

（1）多項參數(shù)均在醬油呈固態(tài)發(fā)酵時發(fā)生變化，主要有物料、微生物群種、水量、溫度和pH。在發(fā)酵時，前期有溫度波動的情況，受溫度的影響，霉菌的細(xì)胞活動能力減弱，甚至幾乎達(dá)到停滯的狀態(tài)；醬油釀造的關(guān)鍵是綜合酶系，其主要源自于兩種途徑：①由種曲帶來。②在前期菌種生長期間產(chǎn)生。各類酶的最適pH 存在差異，在pH 降低的變化條件下，蛋白酶的酸堿環(huán)境發(fā)生改變，先從堿性轉(zhuǎn)至中性，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)至酸性，繼而進(jìn)入到適應(yīng)于該蛋白酶的最佳區(qū)間，其中表現(xiàn)較為顯著的為酸性蛋白酶，該部分可大幅度提高蛋白酶的利用率。從總蛋白酶活力的角度來看，黃曲霉2246 和米曲霉2339 在此方面的特性均較為突出，即總蛋白酶具有較強(qiáng)的活力。

（2）淀粉酶在醬油釀造中扮演著“轉(zhuǎn)化者”的角色，在與原料接觸后可對其中的淀粉加以分解，得到單糖，該類物質(zhì)可被微生物利用，此時產(chǎn)生2 個方面的促進(jìn)作用：①酵母和乳酸菌的生長更為旺盛。②醬油的還原糖含量增加，會產(chǎn)生醬油香味物質(zhì)的前體。不同曲霉菌種的糖化酶活力存在差異，其中米曲霉2174 最高；從淀粉酶活力的角度來看，則以米曲霉2119 最為突出，可以說明的是，此類曲霉菌種的淀粉液化能力優(yōu)于試驗中的其他菌種。

（3）谷氨酸是決定醬油鮮味程度的關(guān)鍵物質(zhì)，但需注意的是，對于醬油植物原料而言有明顯的特殊性，并非所有的谷氨酸均以呈味的谷氨酰胺形式存在，因此谷氨酸的提鮮功能受到抑制。從這一角度來看，若要改善醬油的風(fēng)味，需要將谷氨酰胺酶活力的提升作為重點(diǎn)的突破口，選擇的曲種在此方面應(yīng)具有突出的能力。在本次分析的曲霉菌種中，各自的谷氨酰胺酶活力有所差異，其中以黃曲霉2062 和2246 兩類最為突出。

4 討論

（1）酸性蛋白酶與中性蛋白酶無明顯的關(guān)聯(lián)，就酶活力而言，酸性蛋白酶相對較弱，究其原因，可能與制曲條件偏中性有關(guān)，此環(huán)境下會對酶的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。高酸性蛋白酶活力醬油制曲菌種的選擇和培育將是未來研究的關(guān)鍵，得到釀造性能更為優(yōu)越的優(yōu)質(zhì)菌種，將其作為醬油釀造時的原料，以保證醬油產(chǎn)品在色澤、口感等方面均更具優(yōu)勢。

（2）研究內(nèi)容的發(fā)展離不開對于酶活力的探討和工藝的進(jìn)一步提升，取沒有拮抗的米曲霉2174 和2339，予以混合，產(chǎn)生的種曲的各類酶活力無明顯的“短板”，可以達(dá)到相對均衡的狀態(tài)；再將其投入至低鹽固態(tài)發(fā)酵試驗中，實際應(yīng)用效果良好，釀造醬油的品質(zhì)較高。