王 琦,楊慶利,吳 薇
(青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,山東 青島 266109)
真菌毒素是真菌產(chǎn)生的一種低分子質(zhì)量的天然次生代謝產(chǎn)物,對人和動物具有很強的毒性,其毒性主要表現(xiàn)在肝、腎損害、致畸、致癌、致突變等方面[1-3]。在玉米、花生等常見農(nóng)作物種植、生長、收獲、運輸、存儲以及加工的各個環(huán)節(jié)都有可能受到真菌毒素的污染,這不僅會降低作物產(chǎn)量和品質(zhì),還會造成重大的經(jīng)濟損失[4-5]。真菌毒素廣泛存在于世界范圍內(nèi),已經(jīng)成為世界性關注問題[6-8]。黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)和伏馬毒素B1(fumonisin B1,F(xiàn)B1)是兩種比較常見的真菌毒素,主要存在于玉米、花生以及小麥等農(nóng)作物及其產(chǎn)品中,尤其是水分含量高的環(huán)境中更容易產(chǎn)生。迄今為止,AFB1和FB1傳統(tǒng)檢測方法主要有儀器檢測法和免疫檢測法。儀器檢測法主要有薄層色譜、高效液相色譜、氣相色譜、毛細管電泳等,免疫檢測法常用的是酶聯(lián)免疫吸附法和熒光免疫分析法[9-12]。這些檢測方法雖然在目前階段運用比較成熟,但是由于存在樣品前處理復雜、檢測時間長、設備昂貴而造成檢測成本高、穩(wěn)定性差以及不適用于現(xiàn)場檢測等缺點而面臨著巨大的挑戰(zhàn)。此外,食物和動物飼料很有可能同時受到多種真菌毒素的污染。然而,單一的檢測模式并不能提供對食品的全面監(jiān)控。因此,有必要加強食品和飼料中真菌毒素的同時檢測技術。此外,開發(fā)一種新型、省時、低成本、靈敏的同時檢測真菌毒素的生物傳感器十分必要。
適配體(aptamer,APT)是通過體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術從核酸隨機文庫中篩選出來的短寡核苷酸序列[13-16]。APT的堿基序列、核苷酸序列長度和環(huán)境條件構成了它獨特的三維立體結構[17],這使其擁有特殊的結合位點,并對靶標具有較高的特異性和親和力。與抗體相比,APT具有可以大量體外合成、容易修飾、穩(wěn)定性高等優(yōu)點。近幾年,基于APT的生物傳感器成為研究熱點,廣泛應用于臨床醫(yī)學、化學分析、食品危害物檢測等領域[18-19]。氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是石墨烯的氧化產(chǎn)物,具有大量含氧官能團,有很好的親水性和生物相容性。相比于其他猝滅劑,GO具有更優(yōu)越的熒光猝滅性能[20-21],常常在熒光共振能量轉移系統(tǒng)中作為熒光受體?;贕O的熒光傳感器已廣泛應用于金屬離子、細胞、蛋白質(zhì)、病原體、真菌毒素、DNA等小分子的檢測[22-27]。此外,由于π-π堆積作用GO對單鏈DNA的吸附能力強于對雙鏈DNA和G-四聯(lián)體的吸附能力,這一特性為本研究的熒光開關檢測系統(tǒng)提供了理論基礎。
本實驗設計一種基于GO為猝滅劑的熒光APT傳感器,熒光基團作為熒光供體,GO作為熒光受體,成功用于食品中真菌毒素(AFB1和FB1)的同時熒光檢測。
白酒 市購。
GO 先鋒納米材料科技有限公司;甲醇(分析純)國藥集團化學試劑有限公司;所有實驗均采用超純水(18.25 MΩ·cm);AFB1、FB1青島普瑞邦生物工程有限公司;AFB1適配體(APT1)和FB1適配體(APT2)的寡核苷酸序列參照文獻[28-29]獲得,熒光染料(Alexa Fluor 488和Cy3)修飾在DNA探針的5’端,APT由生工生物工程(上海)股份有限公司(中國)合成。APT1和APT2的寡核苷酸序列如表1所示。
表1 APT的寡核苷酸序列Table 1 Oligonucleotides used in this study
F-2700熒光分光光度計 日本日立有限公司;SPM-9700型原子力顯微鏡 日本島津有限公司;Trobot聚合酶鏈式反應(polymerase chain reactio,PCR)儀德國Biometra公司;3K15離心機 美國Beckman公司;KH5200E超聲清洗儀 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。
1.3.1 熒光APT傳感器的構建
在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)(含NaCl 136.89 mmol/L,KCl 2.67 mmol/L,Na2HPO48.1 mmol/L,KH2PO41.76 mmol/L,pH 7.4)中將APT的凍干粉稀釋至工作濃度(10 μmol/L),PCR處理后形成直鏈;將GO納米片超聲20 min,5 000 r/min離心10 min,除去沉淀,取上清液備用。然后,將30 μL GO納米片(250 μg/mL)分別與4 μL APT1&2在室溫下均勻混合5 min,形成GO-熒光APT傳感器。
1.3.2 AFB1和FB1檢測
將10 μL不同質(zhì)量濃度的AFB1和FB1滴入GO-適體混合溶液中,加入PBS使最終體積達到1 mL,使AFB1和FB1終質(zhì)量濃度為0、1、5、10、50、100、500 ng/mL。最終液體在一定溫度下孵育1 h。整個實驗需要在黑暗的環(huán)境下進行。最后用熒光分光光度計測量熒光強度,工作條件為狹縫寬度5 nm,電壓700 V,APT1激發(fā)波長499 nm,APT2激發(fā)波長512 nm。將水浴中孵育后的樣品(GO、GO-APT1&2、GO-APT1&2-AFB1&FB1)8 500 r/min離心10 min以獲得GO納米片。然后用超純水將GO納米片稀釋至適當質(zhì)量濃度(5 μg/mL),超聲分散10 min,用原子力顯微鏡的相位模式掃描高度圖像。每個樣本平行掃描3 次。
1.3.3 溫度優(yōu)化
探究溫度(30、35、40、45 ℃和50 ℃)對熒光APT傳感器檢測效果的影響。每組實驗除溫度不同外,其他操作均與1.3.2節(jié)相同。
1.3.4 實際樣品檢測
為驗證基于GO的熒光APT傳感器的實用性,采用白酒樣品[30]進行測試。首先,將1 mL白酒樣品用PBS稀釋20 倍,將溶液調(diào)至pH 7.4。然后,將已知質(zhì)量濃度的AFB1和FB1加入預處理樣品中。根據(jù)1.3.2節(jié)操作,用熒光傳感器對白酒樣品進行靶標的定量檢測。
依賴于APT的識別能力、GO的熒光猝滅和ssDNA吸附能力,本研究構建了基于GO的熒光APT傳感器。圖1顯示了基于開啟式熒光APT傳感器同時檢測兩種真菌毒素(AFB1和FB1)的原理圖。由于GO表面含有含氧官能團和共軛結構,可以通過氫鍵、π-π堆積作用將APT1和APT2吸附到GO表面。伴隨著GO與APT之間的距離被拉近,APT的熒光因為熒光共振能量轉移原理會被GO猝滅,因此APT和GO組裝形成熒光APT傳感器。在溶液中沒有AFB1和FB1的情況下,真菌毒素同時檢測系統(tǒng)的熒光處于關閉狀態(tài)。當靶標加入時,由于APT與靶標的特異性高于GO-APT[31],APT1、APT2更傾向于與它們的特定靶標結合在一起,從GO表面游離出來,導致熒光共振能量轉移原理被破壞,從而使APT1和APT2的熒光恢復。此時,真菌毒素同時檢測系統(tǒng)處于熒光開啟狀態(tài)。相應地,隨著加入的靶標濃度越來越大,熒光強度恢復值也隨之逐漸變大。
圖1 基于GO熒光的APT傳感器檢測AFB1和FB1的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of fluorescence aptasensor based on GO for detection of AFB1 and FB1
圖2A顯示了APT1&2、GO-APT1&2和GO-APT1&2-靶標1&2的熒光強度之間的關系。當溶液中只有APT1&2時,熒光強度表示熒光基團的熒光(圖2A藍色曲線)。當熒光APT1&2與GO一起孵育時,熒光強度急劇下降(圖2A灰色曲線)。結果表明,由于GO的吸附作用產(chǎn)生了熒光共振能量轉移效應,GO成功猝滅了APT1&2的熒光。當靶標出現(xiàn)在溶液中時,APT1&2和特異性靶標間的高親和力使得APT優(yōu)先與特異性靶標識別結合并從GO表面釋放,恢復APT1&2的顯著熒光信號(圖2A紅色曲線)。
用原子力顯微鏡測試原理設計的準確性。用原子力顯微鏡對GO的高度軌跡進行掃描。如圖2B所示,GO片的平均高度約為(1.28±0.01)nm,這個結果與GO是單原子層的理論一致。GO-APT1&2復合物的高度為(2.19±0.007)nm,厚度的增加說明APT1&2被成功地吸附在GO表面。當GO-APT1&2復合物與靶標孵育時,其厚度顯著降低至(1.65±0.025)nm。這一現(xiàn)象證實了適體從GO表面釋放出來,因為APT和靶標的相互作用力大于GO和APT的相互作用力。以上兩種方法均證明了實驗設計的正確性。
圖2 APT傳感器檢測的熒光光譜圖(A)和原子力顯微鏡圖像(B)Fig.2 Fluorescence emission spectra (A) and AFM images (B) of aptasensor
在室溫下,向GO-APT中加入10 μL的AFB1和FB1(50 ng/mL)后熒光強度沒有明顯恢復。為提高加入靶標后的熒光恢復效率,采取溫度優(yōu)化措施。隨著孵育溫度的升高,GO與APT的相互作用減弱,APT從GO表面上釋放出來。因此,提高溫度是增強熒光恢復的理想方法。同時,過高的溫度會破壞APT與靶標之間的結合。如圖3所示,當無AFB1和FB1時,熒光強度恢復通常隨溫度的升高而增加。這一現(xiàn)象證實了先前的理論,即高溫促進了APT從GO表面的釋放。然而,在GO-APT1&2復合物中加入靶標時,這種現(xiàn)象不同。添加AFB1和FB1時,熒光信號在45 ℃以下呈現(xiàn)有規(guī)律地增加,但當溫度超過45 ℃時,熒光強度恢復減弱。因此,45 ℃是熒光強度恢復的臨界點。
圖3 AFB1(A)和FB1(B)檢測溫度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of detection temperatures for AFB1 (A) and FB1 (B)
為了證明開啟式熒光APT傳感器的靈敏度,將不同質(zhì)量濃度(0、0.1、0.5、1、5、10、50、100 、500 ng/mL)的靶標(AFB1和FB1)與GO-APT1&2復合物孵育。如圖4所示,隨著AFB1和FB1質(zhì)量濃度的增加,在340 nm左右GO-APT1混合溶液的熒光強度從30.23增加到340.21,在560 nm左右GO-APT2混合溶液的熒光強度從30.58增加到243.09。AFB1的回歸方程為y=82.516x+99.599(x為lgCAFB1),R2=0.988 0(圖4A),檢出限為0.15 ng/mL。FB1的回歸方程為y=58.131x+85.87(x為lgCFB1),R2=0.989 9,檢出限為0.12 ng/mL(圖4B)。該熒光APT傳感器可以實現(xiàn)對AFB1和FB1的靈敏性檢測(表2),并且具有較寬的檢測范圍。
圖4 熒光強度與靶標質(zhì)量濃度的關系Fig.4 Relationship between fluorescence intensity and target concentration
表2 本研究APT傳感器與其他方法的比較Table 2 Comparison of the aptasensor with other detection methods
利用其他可能的干擾真菌毒素,如玉米赤酶烯酮(zearalenone,ZEN)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)、黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)和棒曲霉素(Patulin),進一步檢查APT傳感器的特異性。分別向GO-APT1&2復合物中加入質(zhì)量濃度為10 ng/mL的AFB1、FB1、ZEN、OTA、AFM1和Patulin。如圖5所示,干擾真菌毒素的熒光恢復值無明顯增加,而AFB1和FB1的熒光恢復值明顯,其中,AFB1的熒光恢復值是其他干擾毒素的6 倍左右,而FB1的熒光恢復值是其他干擾毒素的4 倍左右。結果表明,該熒光APT傳感器對AFB1和FB1具有很高的特異性。
圖5 APT傳感器特異性評估Fig.5 Selectivity assessment of the aptasensor
用熒光APT傳感器檢測具有3種不同質(zhì)量濃度AFB1和FB1的白酒樣品。利用加標回收實驗對實際樣品的回收率進行進一步的可靠性評價。用上述方法測定AFB1和FB1的質(zhì)量濃度,并用線性方程計算。如表3所示,回收率AFB1為92.00%~100.81%,F(xiàn)B1為89.00%~99.50%。該方法可同時檢測真實食品樣品中的AFB1和FB1。
表3 白酒樣品中不同質(zhì)量濃度AFB1和FB1的檢測Table 3 Recoveries of AFB1 and FB1 from Chinese Baijiu samples at different spiked levels
利用熒光共振能量轉移原理,設計一種以GO為熒光猝滅劑的熒光APT傳感器用于食品中真菌毒素AFB1和FB1的同時檢測。在最佳檢測條件下,該熒光傳感器對AFB1檢測范圍為0.1~500 ng/mL,檢出限為0.15 ng/mL,對FB1檢測范圍為0.1~500 ng/mL,檢出限為0.12 ng/mL,并且APT傳感器對靶標具有很高的特異性。在實際樣品的回收實驗中表現(xiàn)出良好的回收率,AFB1回收率為92.00%~100.81%,F(xiàn)B1回收率為89.00%~99.50%。本實驗構建快速高效的AFB1和FB1同時檢測傳感平臺,為真菌毒素以及其他小分子靶標的檢測提供了新的模型,適用于現(xiàn)場多重檢測,在食品和飼料安全監(jiān)測中具有廣泛的應用價值。