一種5 重real-time PCR篩查轉(zhuǎn)基因水稻方法的建立

董立明，楊 帆，邢珍娟，李蔥蔥，閆 偉，龍麗坤，李飛武

（吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，吉林 長春 130033）

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的廣泛應用，轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化迅猛發(fā)展[1]。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應用服務組織發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2018年全球26 個國家種植轉(zhuǎn)基因作物，種植面積達1.917億 公頃[2]。雖然轉(zhuǎn)基因作物在品種抗性、營養(yǎng)改良等方面表現(xiàn)優(yōu)良，但其安全性問題引起了公眾的廣泛關(guān)注[3-4]。為此世界上許多國家和地區(qū)相繼建立了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識制度，對其進行監(jiān)管，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)作為監(jiān)管的手段已成為研究的重點[5]。

目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)主要基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)開展[6]。如普通PCR法[7]、多重PCR法[8-9]、實時聚合酶鏈式反應（realtime polymerase chain reaction，real-time PCR）法[10-11]、數(shù)字PCR法[12-14]等，同時也有一些等溫擴增技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因的檢測，如環(huán)介導等溫擴增反應、重組酶聚合酶擴增[15-16]等。隨著商品化種植的轉(zhuǎn)基因作物品系逐年增多，傳統(tǒng)的單重PCR方法越來越難以滿足實際檢測的需要，研制精準、快速、高通量的檢測方法已成為轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢[17]。多重real-time PCR是將多對引物和不同熒光標記的TaqMan探針放入一個反應體系中，一次性檢測多個靶標的方法，不僅能節(jié)省樣品和試劑，同時也能大大縮短檢測時間，實現(xiàn)一管多檢的高效率。此方法在微生物和病毒的檢測中已廣泛應用[18-21]，在轉(zhuǎn)基因檢測方面，也有一些報道，Wang Fengjun等[22]建立了能同時檢測Rbcl、CaMV35S啟動子、NOS終止子、NPTII四個基因的4 重real-time PCR方法；Niu Chenqi等[23]利用多重real-time PCR結(jié)合數(shù)字PCR建立了同時檢測CaMV35S啟動子、NOS終止子、NPTII、PAT及Adh1的5 重real-time PCR檢測方法；Cottenet等[24]開發(fā)了同時檢測6種外源基因和6種轉(zhuǎn)化事件的2 個多重real-time PCR檢測方法；Dong Liming等[25]建立了同時檢測內(nèi)源基因Lectin和7種轉(zhuǎn)基因大豆的2 個多重real-time PCR方法。

根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計信息，目前已知的轉(zhuǎn)基因作物中70%以上使用了CaMV35S啟動子，60%以上使用了NOS終止子，至少含有兩者之一的轉(zhuǎn)基因作物種類占全部轉(zhuǎn)基因作物的85%以上[26]。此外，通過對已知轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化體的序列分析發(fā)現(xiàn)，Cry1Ab/Ac基因、HPT基因是轉(zhuǎn)基因水稻中應用最廣泛的目的基因。因此，選擇這4種基因元件作為轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測的靶標對象，具有很好的代表性。本研究以轉(zhuǎn)基因水稻KF6號為材料，建立水稻中的CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因及SPS基因的5 重real-time PCR方法。該方法將5 個靶標進行不同的熒光標記，根據(jù)不同熒光通道的擴增曲線，準確識別測試樣品中的轉(zhuǎn)基因成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用材料見表1，以轉(zhuǎn)基因水稻KF6號為陽性對照，非轉(zhuǎn)基因水稻為陰性對照，其他轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、棉花、油菜等材料用于特異性、適用性測試，以上樣品均由本實驗室收集保存。

表1 用于測試的轉(zhuǎn)基因樣品匯總Table 1 Genetically modified crop samples tested in this study

植物基因組提取試劑盒 德國Qiagen公司；HR qPCR Master Mix 上海輝睿生物科技有限公司；檢測引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和純化。

1.2 儀器與設備

ND8000紫外-可見光分光光度計 美國Thermo Fisher公司；CFX96實時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；5424高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品基因組DNA提取

將所有樣品研磨成粉末，按照Qiagen試劑盒使用說明書，提取全部實驗樣品的基因組DNA，用分光光度計測量DNA的質(zhì)量和濃度，用1×TE溶液將樣品DNA稀釋至25 ng/μL，4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物篩選

通過查詢網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫、國內(nèi)外專利、科技論文等方式，獲得已報道的CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac、HPT及SPS基因real-time PCR檢測方法的引物序列，經(jīng)引物配對篩選，確定本研究所需的引物和探針信息（表2）。用滅菌超純水將引物和探針干粉溶解至20 μmol/L，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 5重real-time PCR體系引物/探針信息Table 2 Information about primers used for pentaplex real-time PCR system

1.3.3 5重real-time PCR體系反應條件優(yōu)化

針對5 重real-time PCR體系的引物/探針終濃度、退火溫度、反應循環(huán)數(shù)等重要影響因素，優(yōu)化實驗設計如表3所示。第1步，采用real-time PCR國標方法中通用的退火溫度和反應循環(huán)數(shù)，對反應體系中各靶標的引物/探針終濃度進行優(yōu)化，每個靶標的正反引物用量相等，探針用量為引物的一半。第2步，使用篩選出的引物/探針終濃度，采用正交試驗的方式，對退火溫度和反應循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化。最終篩選出5 重real-time PCR的最佳反應條件。

表3 5重real-time PCR條件優(yōu)化Table 3 Optimization of reaction conditions for pentaplex real-time PCR system

1.3.4 5重real-time PCR和單一real-time PCR擴增體系及程序

5 重real-time PCR體系：HR qPCR Master Mix 12.5 μL，引物和探針預混液5.625 μL，DNA模板2.0 μL，加超純水至25 μL。

單一real-time PCR體系：HR qPCR Master Mix 12.5 μL，正反引物各0.5 μL，探針0.25 μL，DNA模板2.0 μL，加超純水至25 μL。

5 重real-time PCR和單一real-time PCR的擴增程序：第1階段95 ℃變性5 min；第2階段95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，共進行45 個循環(huán)；在第2階段的退火延伸（60 ℃）時段收集熒光信號。

1.3.5 5重real-time PCR體系特異性驗證

以7種常見轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的基因組DNA為模板，進行5 重real-time PCR體系的擴增，每個樣品3 個平行，驗證5 重real-time PCR檢測體系的特異性。

1.3.6 5重real-time PCR體系靈敏度測試

用0.1×TE稀釋陽性對照樣品的DNA，制備一系列濃度梯度的靈敏度測試樣品，進行5 重real-time PCR擴增，每個樣品3 個平行，確定5 重real-time PCR體系的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 重real-time PCR條件的優(yōu)化

為實現(xiàn)在同一管中同時檢測5 個靶標，調(diào)整反應體系和反應程序是關(guān)鍵。以10 ng的轉(zhuǎn)基因水稻KF6號基因組DNA為模板，分別對5 重real-time PCR體系中的引物/探針終濃度、退火溫度及循環(huán)數(shù)的設置處理（表3）進行測試。結(jié)果顯示：在引物/探針終濃度測試中，當5 重real-time PCR體系中SPS基因、CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因的引物終濃度為0.4、0.3、0.4、0.3、0.4 μmol/L時，5 個靶標均能獲得典型擴增曲線，且曲線的熒光值最接近和Ct值差異最小；在退火溫度與擴增循環(huán)數(shù)的正交試驗中，當退火溫度為60 ℃，擴增45 個循環(huán)時，各靶標均能獲得最佳的擴增結(jié)果（圖1）。依據(jù)以上測試結(jié)果，確定了1.3.4節(jié)5 重real-time PCR檢測方法的反應體系和反應程序。

圖1 5重real-time PCR檢測體系的擴增曲線Fig.1 Amplification curves of pentaplex real-time PCR system

2.2 5 重real-time PCR體系的特異性驗證結(jié)果

為實現(xiàn)水稻中轉(zhuǎn)基因成分的篩查，選擇轉(zhuǎn)基因水稻KF6號、KF2號、TT51-1、M12、KMD、TIC-19、T2A-1以及非轉(zhuǎn)基因水稻等樣品，測試5 重real-time PCR體系的特異性。如表4所示，非轉(zhuǎn)基因水稻樣品僅獲得SPS基因的典型擴增曲線，無其他靶標擴增；其他轉(zhuǎn)基因水稻樣品不但擴增到SPS基因，還獲得了各自包含相應靶標的擴增曲線。所有測試樣品的擴增結(jié)果與材料本身所包含的篩選元件和目的基因一致[32]，無假陰性結(jié)果和非特異性擴增的情況出現(xiàn)，表明建立的5 重real-time PCR體系可特異性用于包含以上5種元件的轉(zhuǎn)基因水稻的檢測，可對目前已知的轉(zhuǎn)基因水稻進行高效篩查。

表4 5重real-time PCR特異性驗證Table 4 Specificity validation of pentaplex real-time PCR system

2.3 5 重real-time PCR體系的靈敏度測試結(jié)果

將KF6號的DNA進行一系列梯度稀釋，獲得每種靶標質(zhì)量分數(shù)分別為100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.016%、0.008%的8 個DNA樣品，開展靈敏度測試。如圖2所示，當靶標質(zhì)量分數(shù)為100%～0.032%時，所有5 個靶標均能擴增到典型擴增曲線（Ct值在23.82～37.93之間），且依據(jù)以上稀釋濃度建立的標準曲線具有很好的線性關(guān)系（斜率范圍－3.162～－3.356，相關(guān)系數(shù)R2范圍0.997～0.999，擴增效率范圍98.3%～106.1%）；當靶標質(zhì)量分數(shù)在0.016%及以下時，雖CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac、HPT四個靶標能夠穩(wěn)定擴增，但SPS基因擴增不穩(wěn)定，經(jīng)常存在平行實驗不能穩(wěn)定擴增的情況。表明本方法的檢測靈敏度可達到0.032%。

圖2 5重real-time PCR檢測體系的靈敏度測試Fig.2 Sensitivity testing of pentaplex real-time PCR system

2.4 5 重real-time PCR與單一real-time PCR的檢測能力比較

用單一real-time PCR擴增上述濃度梯度的稀釋樣品，驗證5 重real-time PCR體系的檢測靈敏度水平。結(jié)果見圖3，CaMV35S啟動子在單一real-time PCR與5 重realtime PCR中的擴增效率分別為105.1%和103.6%，R2均為0.999（圖3A）；NOS終止子的擴增效率分別為98.4%和100.7%，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.999（圖3B）；Cry1Ab/Ac的擴增效率分別為106.1%和105.2%，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.999（圖3C）；HPT的擴增效率分別為101.9%和98.3%，相關(guān)系數(shù)分別為0.999和0.997（圖3D），SPS的擴增效率分別為102.8%和106.5%，相關(guān)系數(shù)分別為0.996和0.999（圖3E），說明從擴增效率和R2等方面比較，在100%～0.032%的靶標質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)，單一real-time PCR與5 重real-time PCR無明顯差別，兩種方法具有同等的穩(wěn)定性和檢測能力。表明本研究建立的5 重real-time PCR方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，適用于水稻中轉(zhuǎn)基因成分的高靈敏度檢測。

圖3 5重real-time PCR與單一real-time PCR的檢測能力比較Fig.3 Comparison of detection performance between pentaplex real-time PCR and single real-time PCR

2.5 5 重real-time PCR體系在其他轉(zhuǎn)基因作物篩查中的應用

在5 個篩選靶標中，SPS作為內(nèi)源基因僅存在于水稻樣品中，其他4 個靶標CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac、HPT被廣泛應用于玉米、大豆、棉花、油菜等轉(zhuǎn)基因作物中。因此本研究選擇30種常見的轉(zhuǎn)基因原材料，驗證5 重real-time PCR體系在其他轉(zhuǎn)基因作物篩查中的適用性。如表5所示，測試樣品的擴增結(jié)果與預期基本吻合，僅在MON810、Bt176玉米中未檢測出預期的Cry1Ab基因，這可能是因為本研究所采用的Cry1Ab/Ac基因引物序列與上述2 個樣品的Cry1Ab基因相應序列存在多個堿基不匹配?？傮w而言，利用本研究建立的5 重real-time PCR體系，可從30種測試轉(zhuǎn)基因材料中檢測出相應的轉(zhuǎn)基因成分，表明此方法不僅適用于水稻中轉(zhuǎn)基因成分的檢測，也可對其他轉(zhuǎn)基因作物進行篩查。

表5 5重real-time PCR適用性測試Table 5 Applicability of pentaplex real-time PCR system

3 討論與結(jié)論

CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因是當前商業(yè)化應用的轉(zhuǎn)基因作物中最常見的外源基因，也是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品分子檢測最常用的篩查元件。在日常檢測工作中，一般采用先篩查常見外源元件，然后再鑒定轉(zhuǎn)化事件的方式，確定待檢樣品是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及含有的轉(zhuǎn)基因身份。為了提高檢測通量和效率，國內(nèi)外學者采用多重PCR策略，以實現(xiàn)在同一管中一次檢測多個靶標。其中，多重real-time PCR以操作簡單、耗時時間短、可有效避免氣溶膠污染等優(yōu)點被廣泛應用。在實際應用中，不同靶標的引物/探針濃度配比、退火溫度、擴增循環(huán)數(shù)都會對多重real-time PCR擴增效果產(chǎn)生影響。針對上述影響因素，本實驗均設置多個處理，進行大量的篩選，最終建立了5 重real-time PCR方法。

與前期已發(fā)表的轉(zhuǎn)基因水稻多重real-time PCR檢測方法相比，本研究的優(yōu)點在于，通過分析國內(nèi)外已批準的轉(zhuǎn)基因水稻中的外源基因元件，選擇其中最常見的4種及水稻內(nèi)源基因，建立了5 重real-time PCR體系，實現(xiàn)了對常見基因水稻的全覆蓋篩選檢測。Gu Shaobin等[33]建立的轉(zhuǎn)基因水稻多重real-time PCR方法以CaMV35S啟動子和水稻內(nèi)標基因SPS為標靶，對樣品中的轉(zhuǎn)基因成分進行定量檢測。張明哲等[1]建立的復合PCR熒光檢測方法是經(jīng)復合PCR擴增和毛細管電泳熒光檢測，實現(xiàn)對4種轉(zhuǎn)基因水稻品系的檢測。而本研究建立的方法是為了快速測定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，實現(xiàn)的目標不同。在轉(zhuǎn)基因檢測的實際工作中，將本研究的篩選方法與轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法結(jié)合使用，則即可實現(xiàn)篩選檢測，又能實現(xiàn)身份鑒定。

本研究建立的5 重real-time PCR特異性好，靈敏度可達單一real-time PCR水平，并且具有很好的適用性，能對國內(nèi)外已批準的常見轉(zhuǎn)基因水稻進行初步篩查檢測，還可對常見轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花和油菜進行篩查。此方法的研發(fā)，為轉(zhuǎn)基因水稻監(jiān)管和篩查提供了一種高效的技術(shù)手段。