低桔霉素紅曲霉變異菌株篩選及其變異位點分析

桂艷玲，唐光甫，滿海喬，趙杰宏

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州省生藥學重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】紅曲霉是我國應用廣泛的傳統(tǒng)藥食兩用真菌，其代謝產(chǎn)物有洛伐他汀、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、紅曲色素和桔霉素等，其中洛伐他汀有助于降低膽固醇含量，紅曲色素廣泛用于食品添加劑，而桔霉素是一種真菌毒素[1-3]。桔霉素給紅曲霉及其產(chǎn)品造成很大的負面影響，不僅影響著我國紅曲產(chǎn)品的進出口，也危害消費者身體健康。因此，不斷挖掘桔霉素代謝調(diào)控途徑，選育不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌種具有重要應用價值?！厩叭搜芯窟M展】目前，圍繞桔霉素調(diào)控的研究主要集中在發(fā)酵條件優(yōu)化[4-6]、菌種改良和遺傳調(diào)控方面[7-8]。莊曉曉等[9]利用N+離子束誘變結合紫外輻照處理得到低產(chǎn)桔霉素菌株；王軒等[10]使用紫外和硫酸二乙酯復合誘變選育了低產(chǎn)桔霉素菌株。LI等[11]通過敲除CtnB基因獲得桔霉素含量明顯下降的紅曲；HE等[7]敲除orf1和orf2基因后，桔霉素含量也顯著降低。關于ctnE[12]、ctnG[13]、ctnH[14]、orf6[15]和orf7[16]基因在桔霉素代謝途徑中的作用已相繼報道?！狙芯壳腥朦c】因桔霉素、紅曲色素和洛伐他汀皆屬于聚酮合酶(PKS)途徑的代謝產(chǎn)物，敲除相關基因后大多導致桔霉素和洛伐他汀同時降低，效果并不理想。為達到在消除桔霉素的同時不降低藥用成分的目標，繼續(xù)篩選優(yōu)良菌株和功能基因非常重要。【擬解決的關鍵問題】通過比較基因組分析可以檢測多種基因組變異，分析物種進化等[17]，弄清基因組變異位點。因此，對紫色紅曲霉誘變后，篩選獲得桔霉素含量差異顯著的菌株，通過分析其基因組變異位點，將為挖掘桔霉素代謝重要調(diào)控基因和調(diào)控途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

紫紅曲霉(Monascuspurpureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)分別由貴州中醫(yī)藥大學生藥學實驗室和微生物與免疫學實驗室提供。桔霉素標準品和桔霉素ELISA試劑盒購自上海紀寧實業(yè)有限公司。

1.2 誘變及形態(tài)觀察

將培養(yǎng)7 d的紅曲霉平板開蓋，在15 W紫外燈下距離30 cm處照射10 min，然后往培養(yǎng)皿中加入無菌水沖刷孢子，得到的孢子懸液再用無菌水進行梯度稀釋，從獲得的每個稀釋梯度吸取500 μL均勻涂布于沙氏培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，挑取單孢子菌株轉(zhuǎn)接到沙氏培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d。篩選形態(tài)變異較大的菌株用粘片法進行顯微形態(tài)觀察，剪取小塊透明膠帶粘取少量菌絲放于載玻片上，在膠帶上滴1滴無菌水后蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察各單孢子菌株的顯微形態(tài)特征。

1.3 抑菌活性測定

將枯草芽孢桿菌在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)活化12 h，待OD600值約為0.6時，取細菌懸液500 μL涂布LB平板。稱取45℃烘干的紅曲霉菌絲體0.100 g于三角瓶中，加入10 mL乙酸乙酯，封口后置于28℃搖床中140 r/min萃取2 h。用滅菌濾紙片在萃取液中浸泡24 h后取出晾干，然后放置在枯草芽孢桿菌涂布的LB平板上，每塊平板內(nèi)等距離放3片濾紙作為平行對照，乙酸乙酯作為陰性對照。

1.4 化學成分含量測定

1.4.1 紅曲色素的色價 參照文獻[18]的方法，取液態(tài)發(fā)酵菌絲體在45℃烘干后研碎，精密稱取0.100 g菌絲體粉末于10 mL具塞試管，加入10 mL70%乙醇搖勻，60℃水浴1 h，取出冷卻后過濾，濾液用70%乙醇稀釋，測定OD505值。紅曲色素色價(U/g)=(OD505×稀釋倍數(shù)×浸提溶劑體積)/樣品質(zhì)量。

1.4.2 洛伐他汀吸光值 參照文獻[19]的方法，取1 mL發(fā)酵液于50 mL三角瓶，加入9 mL70%乙醇振蕩混勻，放入恒溫振蕩器，28℃下140 r/min振蕩1 h后取出，在4 200 r/min離心5 min，精密量取1 mL上清液，加入9 mL 70%乙醇定容至10 mL，測定OD237吸光度值。

1.4.3 桔霉素含量 稱取菌絲體粉末0.050 0 g，加入2 mL甲醇于具塞扁形瓶中超聲8 min后，取1 mL懸濁液加入2 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，取樣品上清液采用桔霉素 ELISA試劑盒進行測定。桔霉素標準曲線按照ELISA試劑盒制作。

1.5 基因組測序分析

選取桔霉素含量差異較大的紅曲霉變異菌株與野生型(WT)菌株提取DNA，送諾禾致源生物技術公司進行基因組測序，每個菌種同時測3次重復，以野生型菌株為對照進行比較基因組分析。

2 結果與分析

2.1 變異菌株的形態(tài)特征

紫外誘變后從中分離出100余個紅曲霉單孢子菌株。由圖1可見，從培養(yǎng)7 d的形態(tài)上看，變異紅曲霉菌株的性狀變化較大，有黃色、棕色、紅色和白色等多種顏色，菌落質(zhì)地有的疏松，有的致密；菌絲有絨狀、絮狀和毯狀，分泌色素有的非常明顯，有的很少。菌落邊緣不齊整，有的菌落出現(xiàn)不同形態(tài)的角變，表現(xiàn)出豐富的變異特征?？梢?，UV誘變產(chǎn)生效果較明顯，便于進一步篩選有益變異株。但各變異菌株的顯微形態(tài)結構(400×)并無明細變化，推測UV誘變對紅曲霉的代謝影響較大。

注：顯微檢測400×。Note：Micro-examination 400×.圖1 部分變異紅曲霉菌株的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of some variation Monascus purpureus strains

2.2 變異菌株的抑菌活性

桔霉素抑菌結果顯示，各紅曲霉菌株的乙酸乙酯提取物對枯草芽孢桿菌普遍有抑菌作用，其中1YM10的抑菌圈直徑較大為1.97 cm，3YM29-1和1YM5的抑菌圈直徑較小為1 cm(圖2)。推測，1YM10的桔霉素含量較高，而3YM29-1和1YM5的桔霉素含量較低。

注：A從上至下：CK、1YM10-1、2YM4；B從上至下：CK、1YM10、3YM29-1、1YM13；C從上至下：CK、3YM5、1YM5；D從上到下：CK、3YM20、2YM10；每個樣品3次重復。Note:A from top to bottom respectively indicates CK,1YM10-1 and 2YM4;B from top to bottom indicates CK,1YM10,3YM29-1 and 1YM13 ;C from top to bottom indicates CK,3YM5 and 1YM5 ;D from top to bottom indicates CK,3YM20 and 2YM10.Each sample with three replicates.圖2 部分菌株提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌活性Fig.2 Bacteriostatic activity of the extracts from some strains against Bacillus subtilis

2.3 變異菌株的化學成分

為進一步獲得高產(chǎn)色素和洛伐他汀且桔霉素含量降低的變異菌株，篩選其中7株顏色變異較小的菌株進行化學成分含量檢測顯示，野生型的桔霉素含量較高，達1.673 ng/mL，其余菌株的桔霉素含量普遍降低，其中菌株3YM29-1和1YM10的桔霉素含量最低，分別為0.309 ng/mL和0.400 ng/mL，降幅分別達81.53%和76.09%(圖3)。雖然變異菌株的桔霉素含量降低，但洛伐他汀和色素的含量無同步變化趨勢，這可能與突變的隨機性和不確定性有關。1YM10的抑菌圈較大與桔霉素含量較低的結果并不一致，推測紅曲霉提取物的抑菌活性由多種化學成分共同作用。

2.4 菌株的比較基因組測序

1YM10和3YM29-1的桔霉素含量消減效果較高，其基因組測序得出。野生型平均獲得Clean reads 21 717 777 bp，比對到參考基因組上(NCBI GenBank assembly accession:GCA_006542485.1)20 279 634 bp，比對率93.36%，測序深度109.87倍，覆蓋度大于99%；1YM10平均獲得Clean reads 17 160 064 bp，比對到參考基因組上15 989 053 bp，比對率93.18%，測序深度82.91倍，覆蓋度大于99%；3YM29-1平均Clean reads 21 906 496 bp，比對到參考基因組上20 384 768 bp，比對率93.04%，測序深度111.05倍，覆蓋度大于99%(表1)。獲得的基因組數(shù)據(jù)能夠滿足比較分析的需要。

注：A 桔霉素標準曲線；B 部分菌株化學成分含量。Note:Figure A indicates the standard curve of citrinin;Figure B indicates the chemical composition content of some strains.圖3 桔霉素標準曲線及部分菌株化學成分測定Fig.3 The standard curve of citrinin and chemical composition of some strains

表1 紅曲霉比較基因組測序數(shù)據(jù)Table 1 Sequencing data of comparative genome of Monascus purpureus

2.5 菌株的變異位點

與參考基因組相比，9個紅曲霉基因組序列上找到2 066個SNP位點和978個InDel位點，其中雜合型位點野生型有394個，1YM10有238個，3YM29-1有165個，說明各菌種的基因組并未純合穩(wěn)定，大量變異位點仍處于雜合狀態(tài)，這可能是導致培養(yǎng)的紅曲菌落有角變的重要原因。與野生型菌株相比(圖4)，變異菌株1YM10有47個SNP和5個InDel位點，其中15個SNP導致氨基酸變異。變異菌株3YM29-1有28個SNP和13個InDel位點，其中10個SNP導致氨基酸變異。2株變異菌株存在18個SNP和4個InDel位點共有，其中僅7個SNP位點導致氨基酸變異，涉及4個蛋白序列(表2)，其中MPDQ_005104可能是磷酸轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，MPDQ_001120可能是胞外復合體亞基sec-15類似蛋白，而MPDQ_005758(81個氨基酸)和MPDQ_006301(175個氨基酸)在UniProt和NCBI無高度同源序列，功能未知。

圖4 比較基因組SNP(左)和InDel(右)變異位點Fig.4 Mutation site comparative genomic SNP (left)and InDel (right)mutation site

表2 變異菌株共有SNP位點分析Table 2 Analysis of common SNP sites of variation strains

3 討論

紅曲霉作為許多重要藥食兩用產(chǎn)品的菌種，對其桔霉素含量的控制尤為重要。桔霉素有抑菌作用，可通過有機試劑萃取紅曲霉的化學成分，采用濾紙片法檢測其對枯草芽孢桿菌的抑菌活性，以初步檢驗各變異菌株的桔霉素含量[20]。有研究表明，桔霉素、紅曲色素和洛伐他汀皆源于聚酮合酶合成途徑，3種成分的含量存在一定的相關性[21]。如何既保證有較高含量的功能性成分，又最大限度消減桔霉素，是亟待解決的關鍵問題。

試驗對紫外誘變的紅曲霉菌株進行形態(tài)和化學成分分析發(fā)現(xiàn)，各化學成分的含量變異具有隨機性，可以獲得桔霉素大幅降低而洛伐他汀和紅曲色素含量不降的菌株，從而打破三者的連鎖關系，說明合成3種成分的分支代謝途徑不同。通過篩選獲得桔霉素含量比野生型菌株降低81.53%和76.09%的菌株3YM29-1和1YM10，但1YM10菌株對枯草芽孢桿菌的抑菌活性卻很高，推測與高含量的紅曲色素有關。因為紅曲色素作為食品添加劑也有防腐抑菌的作用[22-23]，可見抑菌活性不能簡單作為桔霉素含量高低的定性檢測方法。

比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，3YM29-1、1YM10和野生型菌株均有許多雜合位點，推測這些雜合位點有的會在形態(tài)上表現(xiàn)出來，從而在培養(yǎng)和傳代的菌落上產(chǎn)生角變，這與紅曲菌落有角變的現(xiàn)象相符。與野生型相比，變異菌株3YM29-1和1YM10僅7個共有的SNP位點導致4個蛋白序列出現(xiàn)氨基酸變異。之前尚無關于這4個蛋白序列與桔霉素代謝關系的類似報道[24]。

4 結論

通過對紫色紅曲霉誘變處理，篩選出桔霉素含量降低81.53%的突變菌株3YM29-1。經(jīng)比較基因組分析，獲得4條功能變異蛋白，分別為磷酸轉(zhuǎn)移酶家族蛋白、胞外復合體亞基sec-15類似蛋白，以及2條未知序列。獲得的低桔霉素變異菌株和挖掘的新基因為深入開展桔霉素調(diào)控研究奠定基礎。