茶組植物新資源-元寶山茶的主要化學(xué)成分及其抗氧化活性

陳濤林，陳美麗，葛智文，廖寅平，王熙富，喬小燕，張征，羅軍武

（1.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）（2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410128）（3.柳州市綠化建設(shè)發(fā)展中心，廣西柳州 545001）（4.柳州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣西柳州 545003）（5.柳州市林業(yè)科學(xué)研究所，廣西融水 545300）（6.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東廣州 510600）

茶葉在我國(guó)古代曾被用來(lái)治療多種疾病，現(xiàn)已成為世界上除水以外的第二大無(wú)酒精飲料，受到世界各國(guó)人民的廣泛歡迎和喜愛。因其富含兒茶素、鞣質(zhì)、黃酮類等具有強(qiáng)抗氧化活性的天然有機(jī)化合物，因此，茶的保健功效在過(guò)去幾十年以來(lái)一直是科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)，也使其成為天然抗氧化產(chǎn)品開發(fā)的重要來(lái)源[1]。元寶山茶（Camellia yungkiangensisH.T.Chang var.yuanbaoshanicaZ.W.Ge,Y.P.Liao et T.L.Chen）是分布于廣西融水縣境內(nèi)元寶山海拔1000 m 以上區(qū)域的一種野生茶資源，被當(dāng)?shù)乩习傩辗Q為“原生茶”，其葉片光澤性強(qiáng)，芽葉茸毛較多，從葉片大小、葉形、葉色、育芽力等方面均明顯區(qū)別于當(dāng)?shù)氐钠渌铇洌–amellia sinensis）資源類型，經(jīng)筆者鑒定該資源屬于榕江茶（Camellia yungkiangensisH.T.Chang）的變種，是茶組植物的又一新資源[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，當(dāng)?shù)乩习傩蘸推髽I(yè)都習(xí)慣將其制作成烘青類綠茶飲用，其成品茶湯色淺綠明亮，有清花香，且香氣持久高長(zhǎng)，滋味鮮爽、醇厚、回甘明顯。研究表明，該資源多酚、可可堿含量高，加工綠茶品質(zhì)獨(dú)特，在品種選育和茶葉深加工等方面具有很好的開發(fā)潛力和利用價(jià)值。

氧自由基是人體細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種性質(zhì)活潑的自由基，已有的研究表明，氧自由基的大量積累不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷，還會(huì)加速機(jī)體衰老甚至誘發(fā)各種疾病[3]。長(zhǎng)期以來(lái)的實(shí)踐和研究證明，植物體中存在的多種天然化合物如多酚類、黃酮類等均具有較好的抗氧化和抗衰老作用[4]，因此，評(píng)價(jià)和篩選具有強(qiáng)抗氧化活性的植物資源已成為近年來(lái)食品和醫(yī)藥科學(xué)研究的新方向[1,5-8]。

ABTS[2,2’-聯(lián)氨-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)][9]、DPPH（1,1-二苯-2-苦基肼）[10-11]和FRAP（鐵離子還原能力）[12]是目前測(cè)定體外抗氧化活性最常用的三種方法，其原理主要是通過(guò)抗氧化劑使自由基或亞鐵離子溶液中的電子轉(zhuǎn)移，從而使溶液顏色發(fā)生變化，利用反應(yīng)前后的溶液的吸光度大小來(lái)評(píng)判抗氧化劑的抗氧化活性。這三種方法各從不同角度評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化能力，不僅操作簡(jiǎn)單而且靈敏度高、重復(fù)性好。

本研究以該資源的鮮葉固定樣、紅茶工藝樣和綠茶工藝樣為材料，以當(dāng)?shù)鼐湃f(wàn)山地區(qū)的大茶樹（Camellia sinensis）鮮葉固定樣、紅茶工藝樣和綠茶工藝樣為對(duì)照，在分析比較二者主要品質(zhì)化學(xué)成分差異的基礎(chǔ)上，通過(guò)DPPH、ABTS 和FRAP 三種方法對(duì)二者的抗氧化活性進(jìn)行對(duì)比分析。并通過(guò)分析其主要生物活性化合物的含量與抗氧化活性的相關(guān)性，探討其抗氧化機(jī)理，以初步評(píng)價(jià)該資源在食品和醫(yī)藥等行業(yè)上的應(yīng)用價(jià)值，為該資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選取廣西元寶山茶的鮮葉固定樣、紅茶工藝樣和綠茶工藝樣為材料，分別編號(hào)為YBS、YBSBT、YBSGT；以廣西九萬(wàn)山大茶樹的鮮葉固定樣、紅茶工藝樣和綠茶工藝樣為對(duì)照，分別編號(hào)為JWS、JWSBT、JWSGT。于2017 年3 月至4 月分別采集兩個(gè)資源無(wú)病蟲害的標(biāo)準(zhǔn)一芽二葉嫩梢，綠茶工藝樣采用鮮葉→攤放→殺青→揉捻→初烘→攤涼→復(fù)烘→攤涼的工藝方法進(jìn)行加工；紅茶工藝樣采用鮮葉→萎凋→揉捻→發(fā)酵→初烘→攤涼→復(fù)烘→攤涼的工藝方法進(jìn)行加工；鮮葉固定樣采用蒸青固樣法進(jìn)行固樣，具體方法為：將采集的新鮮嫩葉置于煮沸的蒸鍋上，利用蒸汽進(jìn)行快速殺青，以葉色變暗、嫩莖折而不斷為適度，時(shí)間90～120 s；將殺青后的鮮葉攤涼至室溫后置于75 ℃烘箱中烘至足干。將足干的樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以兒茶素（?0% EGCG）和Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

高效液相色譜儀（日本，SHIMADZU）；島津SHIMADZU 紫外分光光度計(jì)（UV 2700）；純水機(jī)（美國(guó)，Millipore 公司）；C18 色譜柱（ECOSIL 4.6×150 mm 5 μm C/N EC181546 S/N 4I7501-11）、平頭進(jìn)樣器、0.45 μm 的無(wú)機(jī)膜和有機(jī)膜、恒溫水浴鍋、干燥器（內(nèi)裝有效變色硅膠干燥劑）、抽濾裝置（玻璃抽氣管，抽濾瓶，布氏漏斗）、玻質(zhì)砂芯坩堝、定量濾紙、DHG-9146A型恒溫電熱干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司、自動(dòng)控溫±2 ℃）；具蓋鋁質(zhì)烘皿、具蓋玻璃蒸發(fā)皿、分析天平（感量0.0001 g）及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)玻璃儀器。

1.2.2 主要試劑

兒茶素組分標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)，Sigma 公司）；抗壞血酸Vc（AR）、醋酸鈉（AR）、三氯化鐵（AR）、高硫酸鉀（AR）、硫酸亞鐵（AR）、酒石酸鉀鈉（AR）、磷酸氫二鈉（AR）、磷酸二氫鉀（AR）、茚三酮（AR）、氯化亞錫（AR）、酒石酸亞鐵（AR）、碳酸鈉（AR）、福林酚（AR）、甲醇（HPLC）、濃硫酸（AR）、濃鹽酸（AR）、冰醋酸（HPLC）、N-N二甲基甲酰胺（HPLC）、乙腈（HPLC）等均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽/ABTS（純度98%，）、2,4,6-三吡啶基三嗪/TPTZ（純度98%）均購(gòu)自上海瑞永生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼/DPPH（純度＞97%），購(gòu)自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；兒茶素（含50%EGCG）由湖南三福生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 生化成分的測(cè)定方法

1.3.1.1 茶湯制備方法

準(zhǔn)確稱取3 g（精確至0.0001 g）磨碎試樣于500 mL 錐形瓶中，加沸蒸餾水450 mL，立即移入沸水浴中，浸提45 min（每隔10 min 搖動(dòng)一次)，浸提完畢后立即趁熱減壓過(guò)濾，殘?jiān)蒙倭繜嵴麴s水洗滌2～3次。將濾液轉(zhuǎn)入500 mL 容量瓶中，冷卻后用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。

1.3.1.2 常規(guī)生化成分的測(cè)定方法

水分測(cè)定：參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8304-2013《茶 水分測(cè)定》；水浸出物測(cè)定：參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8305-2013《茶 水浸出物測(cè)定》；茶多酚含量測(cè)定：參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》；游離氨基酸總量測(cè)定：參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》；黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定：三氯化鋁比色法[13]；可溶性糖含量測(cè)定：硫酸-蒽酮比色法[14]。

1.3.1.3 兒茶素、生物堿、沒食子酸含量檢測(cè)方法

色譜柱：ECOSIL C18 4.6×150 mm 5 μm C/N EC181546 S/N 4I7501-11；流動(dòng)相：A 相為超純水；B相為N,N-二甲基甲酰胺:甲醇:冰醋酸=39.5:2:1.5（V/V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度Table 1 Mobile phase elution gradient

1.3.2 抗氧化能力的測(cè)定方法

1.3.2.1 DPPH 自由基清除率測(cè)定

參考Chen 等[15]和Omp 等[16]的方法，具體步驟如下：

（1）1試劑配制

0.5 mmol/L DPPH 溶液（A）：稱取0.0493 g DPPH，用甲醇溶解后定容至250 mL，搖勻后冷藏保存；0.1 mol/L 醋酸（B）：取5.77 mL 冰醋酸用水定容至1000 mL；0.1 mol/L 醋酸鈉溶液（C）：稱取8.2 g 無(wú)水醋酸鈉用水定容至1000 mL；醋酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 5.5）（D）：取0.1 mol/L 醋酸6.8 mL，加入43.2 mL 0.1 mol/L 醋酸鈉溶液，混勻備用；甲醇-乙酸工作液（0.1 mol/L，pH 5.5）（E）：取40 mL 醋酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 5.5），加入60 mL 甲醇，混勻備用。

（2）2茶湯的制備

準(zhǔn)確稱取3 g（精確至0.0001 g）磨碎試樣于500 mL 錐形瓶中，加沸蒸餾水450 mL，立即移入沸水浴中，浸提45 min（每隔10 min 搖動(dòng)一次)，浸提完畢后立即趁熱減壓過(guò)濾，殘?jiān)蒙倭繜嵴麴s水洗滌2～3次。將濾液轉(zhuǎn)人500 mL 容量瓶中，冷卻后用水定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為6 mg/mL 的茶湯作為母液，將上述母液分別稀釋至不同濃度梯度，作為樣品反應(yīng)液。

（3）3反應(yīng)體系

將茶湯母液分別稀釋至5、10、20、30、40、50、60 μg/mL 作為樣品反應(yīng)液，兒茶素和Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照，濃度分別為5～100 μg/mL。準(zhǔn)確吸取2 mL 各濃度樣品反應(yīng)液和陽(yáng)性對(duì)照液，分別置入包裹有鋁箔紙的玻璃試管中，各試管中依次加入1 mL 上述A 溶液和2 mL 上述E 溶液，快速混勻后置于30 ℃黑暗環(huán)境下反應(yīng)30 min，于517 nm 波長(zhǎng)下比色，以E 溶液作為比色調(diào)零液，測(cè)得吸光值為Ax。以蒸餾水作為空白對(duì)照，作相同處理后測(cè)得吸光值為A0，按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：

1.3.2.2 ABTS 自由基清除率測(cè)定

參考Arnao 等[17]和Thaipong 等[18]的方法，具體步驟如下：

（1）1試劑配制

7.4 mmol/L ABTS 儲(chǔ)備液（A）：準(zhǔn)確稱取0.4060 g ABTS，用水定容至100 mL，搖勻備用；2.6 mmol/L高硫酸鉀儲(chǔ)備液（B）：準(zhǔn)確稱取0.3514 g 高硫酸鉀，用水定容至500 mL，搖勻備用；ABTS+儲(chǔ)備液（C）：將A 溶液和B 溶液按1:3（V/V）混合，在室溫、黑暗環(huán)境下靜置12 h。ABTS+工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）（D）：取1 mL 經(jīng)過(guò)12 h 靜置的C 溶液，加入10 mL 無(wú)水乙醇，混勻后在734 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度為A0=1.1±0.02。

（2）2反應(yīng)體系

茶湯母液制備方法同1.3.2.1，將母液分別稀釋至20、40、60、100、150、200、300 μg/mL 作為樣品反應(yīng)液，兒茶素和Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照，濃度分別為10～300 μg/mL。準(zhǔn)確吸取0.5 mL 各濃度樣品反應(yīng)液和陽(yáng)性對(duì)照液，分別置入包裹有鋁箔紙的玻璃試管中，各試管中分別加入5 mL D 溶液，快速混勻后置于黑暗環(huán)境下反應(yīng)2 h，于734 nm 波長(zhǎng)下比色，取5 mL 無(wú)水乙醇，加入0.5 mL 樣品反應(yīng)液，混勻后作為比色調(diào)零液，測(cè)得吸光值為Ax。按下式計(jì)算ABTS+自由基清除率：

1.3.2.3 總抗氧化能力測(cè)定

參照Rusak 等[19]的方法，具體步驟如下：

（1）1試劑配制

0.02 mol/L 三氯化鐵溶液（A）：準(zhǔn)確稱取0.1625 g FeCl3，用蒸餾水定容至50 mL，搖勻后置于避光處保存?zhèn)溆茫?0 mmol/L TPTZ 溶液（B）：準(zhǔn)確稱取31.233 mg TPTZ，用40 mmol/L 鹽酸溶液定容至10 mL，搖勻后冷藏保存?zhèn)溆茫?.3 mol/L 醋酸鈉緩沖溶液（C）：準(zhǔn)確稱取5.1 g 醋酸鈉，加入20 mL 冰醋酸，用水稀釋定容至250 mL，搖勻后置于避光處保存?zhèn)溆?；FRAP工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）（D）：將A、B、C 三個(gè)溶液以1:1:10（V/V/V）混合，冷藏避光保存?zhèn)溆茫?0 mmol/L鹽酸溶液（E）：取濃鹽酸（12 mol/L）0.1 mL 加水至30 mL，置于避光處保存?zhèn)溆茫? mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液（F）：準(zhǔn)確稱取41.71 mg 硫酸亞鐵溶于適量的水中，加入0.65 mL 18 mol/L 的硫酸，再加水定容至50 mL，并置入小鐵釘。

（2）2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取0.1 mL 濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液，加入3 mL FRAP工作液，再加入0.3 mL 超純水，快速混勻后準(zhǔn)確反應(yīng)20 min，于593 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，用超純水調(diào)零，根據(jù)濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y(吸光度)=Ax(濃度)+B，R2=0.999 以上。樣品的總抗氧化能力（FRAP 值）以達(dá)到相同吸光度所需FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。

（3）3反應(yīng)體

茶湯母液制備方法同1.3.2.1，將母液分別稀釋至50、100、200、400、600、800 μg/mL 作為樣品反應(yīng)液，兒茶素和Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照，濃度分別為20～1000 μg/mL。吸取0.1 mL 的各濃度樣品反應(yīng)液和陽(yáng)性對(duì)照液，分別置于玻璃試管中，分別依次加入3 mL FRAP工作液和0.3 mL 超純水，快速混勻后準(zhǔn)確反應(yīng)20 min，于593 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總抗氧化能力（FRAP 值）。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

數(shù)據(jù)的基本統(tǒng)計(jì)分析采用EXCEL 2010 軟件進(jìn)行；采用SPSS Statistics 22 軟件進(jìn)行Duncan 多重比較分析和相關(guān)性分析。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 元寶山茶與對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹各樣品的主要品質(zhì)化學(xué)成分分析

供試樣品的主要生物活性化合物如表2 所示。由表2 可知，元寶山茶與對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹3 組相同工藝處理樣品比較，茶多酚、兒茶素（DL-Catechin，DL-C）、可溶性糖、黃酮、可可堿含量均以元寶山茶最高，且各組樣品的含量差異均達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。其中茶多酚含量最高的是元寶山茶鮮葉固定樣，高達(dá)31.33%；DL-C 含量最高的是元寶山茶綠茶工藝樣，高達(dá)10.01%；可溶性糖含量最高的是元寶山茶鮮葉固定樣，高達(dá)10.96%，含量最低的是九萬(wàn)山大茶樹紅茶工藝樣，僅為2.35%；可可堿含量最高的是元寶山茶紅茶工藝樣，高達(dá)3.98%，含量最低的是對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣，僅為0.27%。游離氨基酸、咖啡堿、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）含量均以對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹最高，且各組樣品的含量差異均達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。其中咖啡堿含量最高的是對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹綠茶工藝樣，高達(dá)4.03%，含量最低的是元寶山茶紅茶工藝樣，僅為0.20%。沒食子酸含量最高的是元寶山茶綠茶工藝樣（0.29%），含量最低的是對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣（0.04%）。

表2 元寶山茶與對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹各樣品的主要化學(xué)成分及含量（%）Table 2 The main chemical compositions and their contents of different samples(%)

元寶山茶各樣品的總兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）含量均較對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹相同工藝樣品低，其中元寶山茶鮮葉固定樣（12.55%、1.45%、0.12%）和綠茶工藝樣（13.91%、1.78%、0.16%）與對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣（16.47%、9.20%、1.30%）和綠茶工藝樣（17.44%、9.86%、1.41%）的差異均達(dá)到顯著水平（p＜0.05），元寶山茶紅茶工藝樣（1.81%、0.52%、0.04%）與對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹紅茶工藝樣（2.04%、0.77%、0.04%）之間差異無(wú)顯著性。元寶山茶各樣品的表兒茶素（Epicatechin，EC）含量均較對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹相同工藝樣品高。

總體來(lái)看，元寶山茶鮮葉固定樣和綠茶工藝樣在各成分含量上較為接近，均具有較高含量的茶多酚、可溶性糖、可可堿、沒食子酸、DL-C；九萬(wàn)山大茶樹的鮮葉固定樣和綠茶工藝樣在各成分含量上也較為接近，均具有較高含量的游離氨基酸、咖啡堿、總兒茶素、EGC、EGCG、GCG、ECG；兩個(gè)紅茶工藝樣除具有相對(duì)較高的黃酮含量外，在茶多酚和兒茶素總量及組成上的含量均較低。值得注意的是，從以上結(jié)果可以看出，元寶山茶鮮葉固定樣和綠茶工藝樣不僅具有高含量的茶多酚，而且其可溶性糖和可可堿含量最高分別達(dá)到10.96%和3.04%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以本研究中九萬(wàn)山大茶樹為代表的常規(guī)茶樹（Camellia sinensis）品種資源，其中可可堿含量遠(yuǎn)高于李金[20]測(cè)定的25 個(gè)茶樹品種的可可堿含量（含量范圍為0.04%～0.34%）。但其咖啡堿含量卻較常規(guī)茶樹品種資源低，且遠(yuǎn)低于李金[20]對(duì)25 個(gè)茶樹（Camellia sinensis）品種的測(cè)定結(jié)果（含量范圍為2.74%～5.28%），也遠(yuǎn)低于李文萃等[21]對(duì)以鳩坑種（Camellia sinensis）為原料加工綠茶的測(cè)定結(jié)果（2.60%～2.70%）和宋加艷等[22]對(duì)碧香早（Camellia sinensis）鮮葉原料的測(cè)定結(jié)果（3.67%）。另外，從兒茶素組分分析結(jié)果可以看出，元寶山茶鮮葉固定樣和綠茶工藝樣的DL-C 含量（分別為9.28%、10.01%）遠(yuǎn)高于九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣和綠茶工藝樣（分別為1.30%、1.36%），也遠(yuǎn)高于宋加艷等[22]對(duì)碧香早（Camellia sinensis）鮮葉原料的測(cè)定結(jié)果（0.88%）。這充分說(shuō)明元寶山茶屬于典型的高茶多酚、高DL-C、高可溶性糖、高可可堿、低咖啡堿的特異性資源，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 元寶山茶與對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹各樣品的抗氧化活性分析

本研究采用三種常用的體外化學(xué)抗氧化測(cè)定方法測(cè)定了元寶山茶鮮葉固定樣、紅茶工藝樣和綠茶工藝樣及對(duì)照樣品的抗氧化活性，以兒茶素（含50% EGCG）和Vc 為陽(yáng)性對(duì)照。各樣品的DPPH 自由基清除效果如圖1 所示。由圖1 可知，各樣品的DPPH 自由基清除率與樣品質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且在實(shí)驗(yàn)濃度5～60 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。陽(yáng)性對(duì)照樣兒茶素和Vc 的DPPH 自由基清除能力大于6 個(gè)茶葉樣品，6 個(gè)茶葉樣品中以元寶山茶綠茶工藝樣和九萬(wàn)山大茶樹綠茶工藝樣的DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)，其次為二者的鮮葉固定樣，DPPH 自由基清除力最差的是二者的紅茶工藝樣。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，所有樣品的DPPH 自由基清除能力大小依次為：兒茶素＞Vc＞九萬(wàn)山大茶樹綠茶工藝樣＞元寶山茶綠茶工藝樣＞九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣＞元寶山茶鮮葉固定樣＞元寶山茶紅茶工藝樣＞九萬(wàn)山大茶樹紅茶工藝樣，其IC50值分別為6.07、7.92、16.02、16.31、17.88、18.72、29.19、31.34 μg/mL（表3）。

圖1 各樣品對(duì)DPPH 自由基的清除效果Fig.1 Removing effects of each sample on DPPH free radicals

表3 不同樣品的抗氧化活性的IC50值（μg/mL）Table 3 IC50 values of antioxidant activity of different samples(μg/mL)

各供試樣品的ABTS 自由基清除效果如圖2 所示。由圖2 可知，陽(yáng)性對(duì)照樣兒茶素和Vc 的ABTS自由基清除力較6 個(gè)茶葉樣品強(qiáng)，而且兒茶素的清除能力大于Vc。在實(shí)驗(yàn)濃度20～300 μg/mL 范圍內(nèi)，6個(gè)茶葉樣品的ABTS 自由基清除率均與樣品質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各樣品的ABTS 自由基清除力大小依次為：兒茶素＞Vc＞九萬(wàn)山大茶樹綠茶工藝樣＞元寶山茶綠茶工藝樣＞九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣＞元寶山茶鮮葉固定樣＞元寶山茶紅茶工藝樣＞九萬(wàn)山大茶樹紅茶工藝樣，其IC50值分別為21.73、43.58、105.02、110.04、113.18、137.54、150.01、157.07 μg/mL（表3）。

圖2 各樣品對(duì)ABTS 自由基的清除效果Fig.2 Removing effect of each sample on ABTS free radicals

各供試樣品的FRAP 鐵離子還原能力如圖3 所示。由圖3 可知，在實(shí)驗(yàn)濃度50～800 μg/mL 范圍內(nèi)，各樣品的FRAP 鐵離子還原能力與樣品質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。陽(yáng)性對(duì)照樣兒茶素和Vc的還原能力較6個(gè)茶葉樣品強(qiáng)。6個(gè)茶葉樣品中，以元寶山茶綠茶工藝樣的還原能力最強(qiáng)，九萬(wàn)山大茶樹紅茶工藝樣的還原能力相對(duì)最弱。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各供試樣品的FRAP 鐵離子還原能力大小依次為：兒茶素＞Vc＞元寶山茶綠茶工藝樣＞九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣＞九萬(wàn)山大茶樹綠茶工藝樣＞元寶山茶鮮葉固定樣＞元寶山茶紅茶工藝樣＞九萬(wàn)山大茶樹紅茶工藝樣，其IC50值分別為98.80、100.23、225.21、337.69、354.46、438.86、509.72、862.63 μg/mL（表3）。

圖3 各樣品對(duì)FRAP 鐵離子的還原效果Fig.3 Reduction effect of each sample on FRAP iron ions

由三個(gè)抗氧化指標(biāo)的IC50值可知，元寶山茶鮮葉固定樣、元寶山茶紅茶工藝樣和綠茶工藝樣的DPPH IC50值均小于ABTS IC50值和FRAP IC50值，均以FRAP IC50值最大。說(shuō)明元寶山茶清除自由基的能力強(qiáng)于對(duì)鐵離子的還原能力，且對(duì)脂溶性自由基（DPPH）的清除能力高于對(duì)水溶性自由基（FRAP）的清除能力。這與喬小燕等[1]對(duì)黃化英紅九號(hào)的多酚提取物的研究和黃玉鳳等[23]對(duì)綠茶水浸出物的研究結(jié)果一致。但鄭善元等[24]對(duì)單叢茶水提物抗氧化活性的研究結(jié)果表明，單叢茶水提物對(duì)水溶性自由基的抑制率明顯高于脂溶性自由基，這與本研究的結(jié)果恰好相反，導(dǎo)致這一結(jié)果的可能原因是由于供試材料屬于不同茶類，其主要抗氧化活性成分的組成和含量差異較大。

多酚類物質(zhì)是茶葉中最主要的生物活性物質(zhì)，也是茶葉最主要的抗氧化成分，這類物質(zhì)極易被氧化，因此它們也是紅茶等發(fā)酵茶類加工過(guò)程中最主要的被氧化物質(zhì)。酚類物質(zhì)的氧化不僅決定了發(fā)酵茶品質(zhì)的好壞，還大幅度改變了茶葉中的原始化學(xué)物質(zhì)組成[25-26]。研究表明，紅茶發(fā)酵過(guò)程中有50%以上酚類物質(zhì)被氧化，其中兒茶素類物質(zhì)的氧化比例最高，達(dá)80%以上[27-29]，因此本研究中的兩個(gè)紅茶工藝樣在抗氧化活性上較其它樣品弱，而多酚類和兒茶素類物質(zhì)保留較多的鮮葉固定樣和綠茶工藝樣的抗氧化活性整體較強(qiáng)。

2.3 各樣品中主要生物活性化合物含量與其抗氧化活性的相關(guān)性分析

為了揭示各樣品的抗氧化活性與其主要化學(xué)成分之間的相關(guān)性，計(jì)算了各抗氧化指標(biāo)的IC50值與主要化學(xué)成分之間的Pearson 相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表4 所示。由表4 可知，各樣品的DPPH、ABTS 和FRAP 抗氧化活性與茶多酚含量、黃酮含量、兒茶素總量、EC含量、EGCG 含量均呈極顯著相關(guān)（p＜0.01）。這與Lee 等[30]對(duì)綠茶水提物的研究結(jié)果和呂海鵬等[31]對(duì)福建白茶的研究結(jié)果一致。DPPH 和ABTS 的IC50值與EGC 含量、DL-C 含量和ECG 含量呈極顯著相關(guān)（p＜0.01），F(xiàn)RAP 的IC50值與EGC 含量、DL-C 含量和ECG 含量呈顯著相關(guān)（p＜0.05）。DPPH 的IC50值與GCG 含量呈顯著相關(guān)（p＜0.05），ABTS 的IC50值與GCG 含量呈極顯著相關(guān)（p＜0.01）。游離氨基酸和生物堿等其它化學(xué)成分與抗氧化活性之間無(wú)顯著相關(guān)性。

表4 主要化學(xué)成分與IC50值的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between main chemical components and IC50 values

大量研究證明，氧化應(yīng)激與多種疾病密切相關(guān)，因此生物活性物質(zhì)的抗氧化活性一直以來(lái)都受到了廣泛關(guān)注和研究[32-35]。本研究對(duì)各樣品的抗氧化活性和主要化學(xué)成分的Pearson 相關(guān)性分析表明，茶多酚、黃酮和兒茶素類物質(zhì)的含量與各供試樣品的抗氧化活性呈極顯著相關(guān)，表明它們是茶葉中最主要的抗氧化物質(zhì)，它們的含量及組成比例決定了樣品的抗氧化活性大小。而游離氨基酸和生物堿等其它化合物與樣品的抗氧化活性無(wú)顯著相關(guān)性。由相關(guān)系數(shù)大小可知，EGC、DL-C、GCG、ECG與樣品清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的能力有著更為密切的關(guān)聯(lián)，而與樣品的FRAP 鐵離子還原能力的相關(guān)性相對(duì)較小。此外，從上述分析結(jié)果可知，九萬(wàn)山大茶樹紅茶工藝樣在所有樣品中的抗氧化活性最低，其茶多酚和兒茶素含量在所有樣品中也是最低的，這進(jìn)一步印證了樣品抗氧化活性與化學(xué)成分含量的相關(guān)性分析結(jié)果的正確性。

3 結(jié)論

3.1 總的來(lái)說(shuō)，元寶山茶鮮葉固定樣和綠茶工藝樣在主要化學(xué)成分的含量上較為接近，在茶多酚、可溶性糖、黃酮、可可堿、沒食子酸、DL-C、EC 的含量上，元寶山茶鮮葉固定樣（含量分別為31.33%、10.96%、0.41%、2.84%、0.21%、9.28%）與元寶山茶綠茶工藝樣分別顯著高于對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣（含量分別為25.29%、3.79%、0.33%、0.27%、0.04%、1.30%）和綠茶工藝樣（p＜0.05）；在游離氨基酸、咖啡堿、總兒茶素、EGCG、GCG、ECG 的含量上，元寶山茶鮮葉固定樣（含量分別為1.17%、0.39%、12.55%、1.45%、0.12%、0.86%）和元寶山茶綠茶工藝樣分別顯著低于對(duì)照九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣（含量分別為3.49%、3.71%、16.47%、9.20%、1.30%、2.37%）和綠茶工藝樣（p＜0.05）；兩個(gè)材料的紅茶工藝樣在上述指標(biāo)上的差異也呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。表明元寶山茶屬于典型的高茶多酚、高DL-C、高可溶性糖、高可可堿、低咖啡堿的特異類型資源。

3.2 在抗氧化活性上，總體來(lái)看，陽(yáng)性對(duì)照樣兒茶素和Vc 整體上較6 個(gè)茶葉樣品的活性強(qiáng)；在清除DPPH自由基和ABTS 自由基的活性上，元寶山茶綠茶工藝樣與九萬(wàn)山大茶樹綠茶工藝樣接近，元寶山茶鮮葉固定樣與九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣接近，元寶山茶紅茶工藝樣與九萬(wàn)山大茶樹紅茶工藝樣接近；在FRAP 鐵離子還原能力上，以元寶山茶綠茶工藝樣活性最強(qiáng)，其次是九萬(wàn)山大茶樹鮮葉固定樣和綠茶工藝樣。從三個(gè)抗氧化指標(biāo)的IC50值來(lái)看，元寶山茶鮮葉固定樣、元寶山茶紅茶工藝樣和綠茶工藝樣的DPPH IC50值（分別為18.72 μg/mL、29.19 μg/mL、16.31 μg/mL）均小于其ABTS IC50值（分別為137.54 μg/mL、150.01 μg/mL、110.04 μg/mL）和FRAP IC50值（分別為438.86 μg/mL、509.72 μg/mL、225.21 μg/mL），說(shuō)明元寶山茶清除自由基的能力要強(qiáng)于對(duì)鐵離子的還原能力，且對(duì)脂溶性自由基（DPPH）的清除能力明顯高于對(duì)水溶性自由基（FRAP）的清除能力?？寡趸钚院椭饕瘜W(xué)成分的Pearson 相關(guān)性分析表明，茶多酚、黃酮和兒茶素類物質(zhì)的含量與各供試樣品的抗氧化活性呈極顯著相關(guān)（p＜0.01），游離氨基酸和生物堿等其它化合物與樣品的抗氧化活性無(wú)顯著相關(guān)性，表明茶多酚是樣品中最主要的抗氧化物質(zhì)。從上述結(jié)果可以看出，元寶山茶具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，且其抗氧化的主要物質(zhì)基礎(chǔ)為高含量的茶多酚，因此，從元寶山茶中提取的多酚類物質(zhì)可以作為抗氧化劑，在食品和醫(yī)療工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值和前景。