黃花菜甲醇提取物對糖脂損傷的干涉作用

秦喜悅，張雷，溫艷斌，李景明，張雅麗*

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100089）（2.大同市農業(yè)農村局，山西大同 037000）

黃花菜（Hemerocallis citrinaBaroni）又名金針菜、萱草花、忘憂草，為百合科阿?；▉喛戚娌輰俚囊环N多年生草本植物，主要種植于中國各地以及日本[1]。中醫(yī)認為[2]黃花菜具有平肝養(yǎng)血、安神醒腦、消炎止痛、消腫利尿等功能，能治療耳鳴、心悸不穩(wěn)、黃疽、痢疾、水腫等多種病癥。黃花菜營養(yǎng)豐富，含有維生素、糖類、氨基酸、蛋白質以及無機鹽等營養(yǎng)成分。有研究[3]表明黃花菜中占比含量最高的營養(yǎng)成分分別是碳水化合物、蛋白質以及脂肪，它們的占比含量分別為60%、14%和2%，此外還含有60 余種揮發(fā)性物質，其中醇類6 種（28.06%），醛類6 種（11.86%），酮類10 種（14.34%），酯類3 種（4.85%），烷烴類8種（7.12%），烯烴類6 種（7.47%），羧酸類9 種（16.00%），酚類3 種（2.10%），其他9 種（8.19%）。黃花菜的活性功能主要表現(xiàn)在抗抑郁[4-6]、降血脂[7,8]、降血糖[9]、抗腫瘤[10,11]、抗氧化[12,13]、抑菌[14,15]等方面。目前黃花菜活性功能成分的常用提取方法是溶劑萃取法[16]，但該法的提取溶劑會造成污染，容易對后期的實驗造成影響，因此常采取一些輔助手段如超聲、微波等[17]，起到破壞植物細胞壁，促使功能成分盡快、盡量多溶出的作用。

糖脂代謝紊亂疾病是指由于機體長期處于高糖、高脂環(huán)境下，體內糖、脂代謝發(fā)生異常，并對機體健康造成損壞，從而導致一系列慢性疾病的發(fā)生，如高血壓、高血脂、糖尿病、心腦血管疾病等[18-20]。目前，我國心血管疾病死亡率居于首位[21]，此外，預計到2045 年全球糖尿病患者將達到6.29 億人[22]，糖脂代謝紊亂所帶來的人體健康問題日益嚴重。近年來，天然植物由于其生物活性物質的高效性和低毒性，在開發(fā)新藥等方面取得重要進展與認可[23]，國內外學者正在積極尋找干涉和治療糖脂紊亂的天然植物。

本研究利用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質譜法（Ultra performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-QQQ-MS/ MS）分析了黃花菜甲醇提取物中的成分，并以秀麗線蟲為基礎，對糖脂損傷模型喂食不同濃度的黃花菜甲醇提取物，觀察其產卵量、身長及壽命表型，深入探討黃花菜甲醇提取物對秀麗線蟲糖脂損傷的干涉作用，對于綜合開發(fā)利用黃花菜資源具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃花菜，山西省大同市；秀麗隱桿線蟲（C.elegans BristolN2），由美國CGC（Caenorhabditis Genetics Center）提供；線蟲的培養(yǎng)采用線蟲生長培養(yǎng)基（NGM），以Escherichia coli strainOP 50 為食物飼喂，在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

甲醇、甲酸、正己烷、乙酸銨（色譜級），德國Merek Millipore 公司；蔗糖、硬脂酸、膽固醇、瓊脂、酵母浸粉、胰蛋白胨（生物級），藍博立德試劑公司。莨菪亭標準品：蘆丁、金絲桃苷、綠原酸、槲皮素、柯伊利素、芹菜素、莨菪亭、槲皮素、異鼠李素、花旗松素、原兒茶素、對香豆酸、龍膽酸、咖啡酸，所有標準品純度＞97%（質量百分數(shù)），麥克林公司。

1.2 儀器與設備

中藥粉碎機，江陰萬通藥化器械有限公司；RV10旋轉蒸發(fā)儀，德國IKA 公司；ALPHA 1-4 真空冷凍干燥機，德國Christ 公司；SCQ-3201 超聲波清洗機，上海聲彥超聲波有限公司；TQ-S 超高效液相色譜聯(lián)用儀，美國Waters 公司；3-30k 高速冷凍離心機，Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；SZ66013ZL 體視鏡，重慶奧特光學儀器有限責任公司；SHP-80 生化培養(yǎng)箱，上海培因實驗儀器有限公司；THZ-C 恒溫振蕩箱，太倉市實驗設備廠；DL-CJ-FND-∏超凈臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.3 黃花菜甲醇提取物的制備及成分分析

將黃花菜樣品干燥制成粉末，過100 目篩。取黃花菜樣品20 g，分散于500 mL 甲醇（80%）溶液中，超聲萃取20 min 后，經7000 r/min 離心10 min，收集上清液，重復上述步驟3 次使上清液基本呈無色。合并上清液，減壓濃縮后冷凍干燥得到黃花菜甲醇提取物，并用于后續(xù)實驗。

取黃花菜樣品0.2 g，分散于5 mL 甲醇（80%）溶液中，并加入低中高三個濃度的莨菪亭標準品，超聲萃取20 min 后，經7000 r/min 離心10 min，收集上清液。重復上述步驟3 次使上清液基本呈無色，合并上清液，定容至25 mL。取10 mL 定容后的上清液，加入10 mL 正己烷，劇烈震蕩后靜置10 min，棄去上層液體，重復步驟使上層液體無色。取稀釋50 倍的黃花菜甲醇提取物樣液0.9 mL 分別與0.1 mL，100 ng/mL 的大豆苷元二級標準液混合，過0.22 μm 濾膜后進樣。利用UPLC-QQQ-MS/MS 對黃花菜甲醇提取物進行成分分析。

1.4 秀麗線蟲糖脂損傷模型的構建

分別挑取同期化后的L1 期秀麗線蟲幼蟲于含有100 μmol/mL 蔗糖和100 μg/mL 硬脂酸的培養(yǎng)基中，每天觀察其壽命、身體長度和產卵量的情況并準確記錄。

1.5 黃花菜甲醇提取物對普通秀麗線蟲及糖脂損傷模型的影響

將黃花菜甲醇提取物分別配成質量濃度為0、400、800、1200 μg/mL 的稀釋液，做如下秀麗線蟲實驗。

1.5.1 秀麗線蟲壽命的測定

挑取同期化后的L1 期秀麗線蟲幼蟲于添加了相應大腸桿菌OP50 的NGM 上，之后每天將培養(yǎng)基中活著的秀麗線蟲轉移至新培養(yǎng)基中培養(yǎng)，計數(shù)每天秀麗線蟲存活數(shù)量，直至全部死亡，計每組線蟲存活天數(shù)的平均數(shù)為平均壽命。每組20 條線蟲，重復三次。

平均壽命的計算公式如下：

式中：

T：每條線蟲的存活天數(shù)，d；

D：線蟲總條數(shù)。

式中：

S：實驗組平均壽命，d；

K：空白組平均壽命，d。

1.5.2 秀麗線蟲身長的測定

挑取同期化后的秀麗線蟲幼蟲于相應的NGM中，在體式顯微鏡下，轉動培養(yǎng)皿，使秀麗線蟲的身體與標尺刻度盡可能重合，讀取其身長度格數(shù)，按照標尺與實際長度的比例換算得到秀麗線蟲實際身長。線蟲同期化當天記為第0 d，記錄線蟲身體長度，直至第6 d。每組10 條線蟲，重復三次。

1.5.3 秀麗線蟲產卵量的測定

線蟲同期化當天記為第0 d，挑取L1 期幼蟲至已添加相應大腸桿菌OP50 的NGM 上，當秀麗線蟲長至L4 期時，將每條L4 期線蟲置于一個培養(yǎng)板上單獨培養(yǎng)。每天將該線蟲轉移至新NGM 上，直到其產卵結束。每次轉移后，清點舊培養(yǎng)基上子代的數(shù)量。每組10 條線蟲，重復三次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用ANOVA 模塊中的LSD 和Duncan’s Test 分析比較組間差異，p＜0.05 為差異顯著。采用Origin Pro 8.5作圖，以平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 黃花菜甲醇提取物的成分分析

本研究使用80%的甲醇通過超聲萃取對黃花菜進行提取，并利用UPLC-QQQ-MS/MS 對黃花菜甲醇提取物進行成分分析，分析結果如表1 所示，黃花菜甲醇提取物中含有蘆丁、綠原酸、槲皮素、咖啡酸、原兒茶素、對香豆酸、異鼠李素、花旗松素、龍膽酸等成分。其中，蘆丁含量最高，為5721.11 ng/mg。

表1 黃花菜甲醇提取物的成分與含量Table 1 The content in methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni

2.2 黃花菜甲醇提取物對普通秀麗線蟲的影響

普通秀麗線蟲喂食不同濃度黃花菜甲醇提取物后的壽命情況如圖1a與表2 所示，與空白組相比，喂食400 μg/mL、800 μg/mL 黃花菜甲醇提取物對普通秀麗線蟲的平均壽命無明顯作用，Vc 陽性對照組也沒有明顯提高的作用；而喂食1200 μg/mL 黃花菜甲醇提取物對普通秀麗線蟲的平均壽命卻有降低作用，其生存率也一直低于空白組，說明高濃度的黃花菜甲醇提取物會對普通秀麗線蟲造成一定程度的損傷。

表2 不同黃花菜甲醇提取物濃度下的普通秀麗線蟲平均壽命Table 2 The mean lifespan of normal C.elegans with different concentrations of methanol extract of Hemerocallis citrina

身長情況如圖1b 所示，在第1～3 d 快速生長期時，不同濃度的黃花菜甲醇提取物對普通線蟲身長無明顯作用；在第4 d 時，與空白組相比，喂食400 μg/mL、800 μg/mL、1200 μg/mL 黃花菜甲醇提取物對普通秀麗線蟲的身長均有顯著提高作用，分別提高了4.40%、7.73%、10.51%，Vc 陽性對照組提高了11.27%；在第5 d 時，喂食800 μg/mL、1200 μg/mL 黃花菜甲醇提取物對普通秀麗線蟲的身長仍有顯著提高作用，與空白組相比分別提高了5.39%、4.99%，Vc 陽性對照組提高了3.14%；但在第6 d 進入衰老期后，線蟲身長縮短，各實驗組之間并沒有顯著差異。由此表明，喂食400 μg/mL～1200 μg/mL 范圍內的黃花菜甲醇提取物在一定程度上可以增強普通秀麗線蟲的最大身長，對線蟲的生長發(fā)育有一定的影響。

子代情況如圖1c、d 所示，由圖1c 可知，在第2～6 d 產卵期時，普通秀麗線蟲在喂食不同濃度黃花菜甲醇提取物后其子代隨時間呈現(xiàn)先增高后減少的趨勢，且產卵高峰期主要集中在第3 d 和第4 d。由圖1d 可知，與空白組對比，普通秀麗線蟲在喂食800 μg/mL、1200 μg/mL 黃花菜甲醇提取物后其總子代數(shù)提高了24.76%、50.82%，Vc 陽性對照組提高了5.70%。由此表明，800 μg/mL～1200 μg/mL 范圍內的黃花菜甲醇提取物可以顯著提高普通秀麗線蟲的生殖能力。

圖1 黃花菜甲醇提取物對普通秀麗線蟲的影響Fig.1 Effect of methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni on common C.elegans

2.3 黃花菜甲醇提取物對糖損傷秀麗線蟲模型的影響

為研究黃花菜甲醇提取物是否對糖損傷的線蟲有干涉作用，給線蟲喂食100 μmol/mL 蔗糖造成線蟲在高糖飼喂情況下壽命和生長發(fā)育指標（身長、產卵量）的改變，同時，添加不同濃度的黃花菜甲醇提取物進行干涉實驗。糖損傷秀麗線蟲喂食不同濃度黃花菜甲醇提取物后的壽命情況如表3與圖2a 所示，與普通秀麗線蟲平均壽命9.38 d 相比，糖損傷線蟲平均壽命為8.05 d，降低了14.18%。喂食400 μg/mL、800 μg/mL、1200 μg/mL 黃花菜甲醇提取物可顯著提高糖損傷線蟲的平均壽命，與未添加提取物的糖損傷線蟲相比分別提高了9.69%、24.47%、22.73%，Vc 陽性對照組也提高了25.47%。與普通秀麗線蟲相比，黃花菜甲醇提取物干涉的糖損傷秀麗線蟲的平均壽命獲得了明顯的提高，甚至超過普通線蟲添加黃花菜甲醇提取物的平均壽命，但由圖2a 可知，平均壽命的增加主要歸因于第5～10 d 線蟲生存率的提高，而不是線蟲最長生存天數(shù)的提高。

表3 不同黃花菜甲醇提取物濃度下的糖損傷秀麗線蟲平均壽命Table 3 The mean lifespan of sugar-damaged C.elegans with different concentrations of methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni

身長情況如圖2b 所示，與圖1b 相比，糖損傷線蟲在生長發(fā)育上受到了抑制，普通線蟲第2 d 的身長約為0.62 mm，100 μmol/mL 蔗糖會導致線蟲生長緩慢，第2 d 的身長只有0.56 mm，而添加400 μg/mL、800 μg/mL、1200 μg/mL 黃花菜甲醇提取物則均可顯著改善糖損傷秀麗線蟲的身長情況。線蟲在第5 d 時身長達到最大，與普通線蟲相比，糖損傷線蟲最大身長沒有明顯變化（都在1.35 mm 左右），添加不同濃度的黃花菜甲醇提取物在此指標上也沒有明顯作用。

子代情況如圖2c、d 所示，由圖2c 可知，喂食不同濃度黃花菜甲醇提取物后，糖損傷秀麗線蟲在第2 d幾乎不產卵，與圖1c 比較可知其產卵期推遲了1 d，產卵總量降低了40.13%。在第3～6 d 產卵期時，糖損傷線蟲的產卵高峰期也延長到第4 d 至第5 d，而添加不同濃度黃花菜甲醇提取物后產卵高峰主要集中在第4 d。由圖2d 可知，喂食400 μg/mL、800 μg/mL、1200 μg/mL 濃度的黃花菜甲醇提取物后，對糖損傷秀麗線蟲的生殖能力具有一定的修復作用，其產卵總量分別提高了2.74%、3.40%、3.88%，Vc 陽性對照組提高了2.91%。

圖2 黃花菜甲醇提取物對糖損傷秀麗線蟲模型的影響Fig.2 Effect of methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni on sugar-damaged C.elegans

2.4 黃花菜甲醇提取物對脂損傷秀麗線蟲模 型的影響

脂損傷線蟲喂食不同濃度黃花菜甲醇提取物后其壽命情況如表4 和圖3a 所示，空白組為未喂食黃花菜甲醇提取物的脂損傷線蟲，其平均壽命為9.02 d，與普通秀麗線蟲壽命相比縮短了3.94%。添加不同濃度的黃花菜甲醇提取物后，不同程度地延長了線蟲的平均壽命。其中，添加1200 μg/mL 黃花菜甲醇提取物的脂損傷線蟲的平均壽命天數(shù)為11.73 d，與脂損傷空白組線蟲相比提高了30.04%，Vc 陽性對照組提高了8.43%。由圖3a 可知，黃花菜甲醇提取物的添加，不但顯著提高了產卵后線蟲的生存率，而且使線蟲的最大壽命也提高至27 d。另外，高脂飼喂還引發(fā)了線蟲在發(fā)育階段（0～3 d）生存率的降低，而添加低濃度 黃花菜甲醇提取物對此指標影響不明顯，但中高濃度黃花菜甲醇提取物能夠很好地回復線蟲在發(fā)育階段的生存率，Vc 效果介于二者之間。

表4 不同黃花菜甲醇提取物濃度下的脂損傷秀麗線蟲平均壽命Table 4 The mean lifespan of stearic acid-damaged C.elegans with different concentrations of methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni

身長情況如圖3b 所示，與圖1b 相比，脂損傷秀麗線蟲的身長在各階段無明顯差別。但在添加黃花菜甲醇提取物后，脂損傷線蟲的身長發(fā)生了一定程度的增加，在第2 d 時，喂食1200 μg/mL 濃度的黃花菜甲醇提取物的脂損傷秀麗線蟲的身長比未添加組提高了10.36%，第4 d 時提高了7.81%；但第5 d 時1200 μg/mL 濃度的黃花菜甲醇提取物卻加劇了脂損傷秀麗線蟲的身長的縮短，推測可能脂損傷線蟲產卵后身體機能變得脆弱，不能耐受高濃度的黃花菜甲醇提取物。Vc 陽性對照組能夠轉變高脂飼喂對線蟲身長的影響，較大程度地提高了線蟲發(fā)育期身長（第2 d 提高了17.08%）以及最大身長（第4 d 提高了13.39%）。

子代情況如圖3c、d 所示，與圖1c、d 普通秀麗線蟲空白組的產卵總量相比可知，脂損傷秀麗線蟲的產卵總量下降了73.88%，且第2 d 基本不產卵。添加不同濃度的黃花菜甲醇提取物后，脂損傷線蟲第2 d恢復了少量的產卵，且400 μg/mL、800 μg/mL、1200 μg/mL 濃度的黃花菜甲醇提取物都對脂損傷秀麗線蟲的產卵總量有顯著的干涉作用，分別提高了83.32%、84.94%、97.32%。Vc 陽性對照組無論在恢復線蟲早期產卵還是總產卵量方面，都比黃花菜甲醇提取物有更好的效果。

圖3 黃花菜甲醇提取物對脂損傷秀麗線蟲模型的影響Fig.3 Effect of methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni on stearic acid-damaged C.elegans

秀麗線蟲從卵孵化后第0～3 d 是生長發(fā)育最快的時期，也是身長變化最大的時間段，其在第3 d 左右進入產卵期，一般產卵高峰期在第4 d，基本結束于第6 d[24-27]。普通秀麗線蟲的產卵總量在150～180 個/條，最長壽命約為15～22 d[28-31]。在本實驗中，對普通秀麗線蟲飼喂不同濃度的黃花菜甲醇提取物后，能夠顯著提高線蟲的生殖（產卵數(shù)量）和發(fā)育（身長）指標，尤其高濃度的黃花菜甲醇提取物能夠使得線蟲的產卵量達到230 個/條，說明黃花菜甲醇提取物可能在生殖功能上發(fā)揮作用，李云霞[32]研究發(fā)現(xiàn)黃花菜中的黃酮類化合物能夠顯著增加性未成熟的小鼠子宮的濕重和子宮系數(shù)，迅速提升小鼠血清中的雌激素水平，表明黃花菜中的黃酮類化合物對于機體內雌激素的調節(jié)具有一定作用。秀麗線蟲在產卵后會發(fā)生身長的縮短和死亡率的提升，而且總產卵量與壽命呈現(xiàn)負相關性[33,34]，本實驗中，高濃度的黃花菜甲醇提取物極顯著地提高了線蟲的產卵量，但其生存率在產卵后急速下降，同時平均壽命也出現(xiàn)了縮減。

高濃度蔗糖處理秀麗線蟲會引起幼蟲生長阻滯，發(fā)育遲緩；同時，高濃度蔗糖也會改變線蟲培養(yǎng)基的滲透壓，加劇線蟲應對外界氧化應激的壓力[24]。本實驗中，100 μmol/mL 蔗糖導致線蟲發(fā)育阻滯、產卵量下降、平均壽命和最長壽命都顯著縮短。在給予不同濃度的黃花菜甲醇提取物后，雖然對糖損傷線蟲的生殖和發(fā)育指標只有較小的干涉回復作用，但在平均壽命方面表現(xiàn)出了非常顯著的正向回復作用，尤其對產卵后線蟲（5～10 d）的生存率明顯提升，且此提升效果隨黃花菜甲醇提取物添加濃度的提高而增加。在添加100 μg/mL 硬脂酸后，線蟲出現(xiàn)了產卵量和平均壽命下降的現(xiàn)象，這與之前的報道類似[24]。給予黃花菜甲醇提取物進行干涉后，極顯著地回復了線蟲的產卵能力及生存率，且效果都隨黃花菜甲醇提取物添加濃度的提高而增加。糖脂代謝紊亂會使機體產生大量自由基，主要以氧自由基為主，這些自由基會導致機體激烈的氧化應激反應，而過多的活性氧會破壞大多數(shù)生物分子的結構，如構成細胞膜的脂質和蛋白質以及細胞核內的遺傳物質DNA 等，甚至還會干擾人體的正常生命代謝活動，降低機體免疫功能，引起疾病，加速人體衰老進程[26,27]。Suresh 的研究表明[35,36]，黃花菜中提取的多酚類物質，具有很強的抗氧化活性（清除DPPH 自由基、ABTS 自由基、H2O2、磷鉬檢測和還原能力），以及抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，可作為抗菌類、抗氧化與糖尿病生物藥物的天然來源。Wang 等[12]利用UPLC-PDA/MS 分析鑒定了黃花菜中17 種黃酮類化合物，并發(fā)現(xiàn)其能通過抗氧化和抗凋亡途徑有效保護BRL-3A 細胞免受t-BHP 誘導的氧化應激損傷，并顯著降低活性氧積累。潘炘[37]研究發(fā)現(xiàn)黃花菜中含有槲皮素、蘆丁、阿魏酸等多酚，其提取物的金屬離子螯合能力、清除自由基與超氧陰離子能力、還原能力都較為顯著，還可以有效減低小鼠體內丙二醛的含量，增強超氧化物歧化酶的表達。由此推測，黃花菜甲醇提取物對糖脂損傷秀麗線蟲生殖能力、生長發(fā)育以及壽命的干涉作用可能與降低其體內的氧化應激反應有關。

3 結論

本研究利用UPLC-QQQ-MS/MS 對黃花菜甲醇提取物中的成分進行了定性、定量分析，測得黃花菜甲醇提取物含有槲皮素、異鼠李素、花旗松素、原兒茶素、蘆丁、對香豆酸、龍膽酸、綠原酸、咖啡酸等9種物質，其中，蘆丁含量最高。通過對普通秀麗線蟲、糖損傷秀麗線蟲、脂損傷秀麗線蟲三種模型的秀麗線蟲喂食不同濃度的黃花菜甲醇提取物，并與空白組和Vc 陽性對照組對比，評價黃花菜甲醇提取物對三種不同模型的秀麗線蟲的干涉作用。結果表明，對普通秀麗線蟲，800 μg/mL～1200 μg/mL 濃度的黃花菜甲醇提取物對其最大身長有一定的增強作用，且可以明顯增強其生殖能力；對糖損傷秀麗線蟲，400 μg/mL～1200 μg/mL 濃度的黃花菜甲醇提取物對其生殖能力有一定的干涉作用，可以顯著延長其平均壽命，且隨濃度增高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；對于脂損傷秀麗線蟲，400 μg/mL～1200 μg/mL 濃度的黃花菜甲醇提取物對其生殖能力、身長和壽命都有顯著的干涉作用，且對生殖能力與平均壽命的干涉作用都隨濃度升高而增強。未來可繼續(xù)深入探究黃花菜甲醇提取物的對糖脂損傷的干涉作用機理和抗氧化功能，為黃花菜甲醇提取物功能性食品的開發(fā)提供理論支撐。