血清外泌體miR-24水平與老年進(jìn)展性腔隙性腦梗死、頸動(dòng)脈硬化的關(guān)系*

張選琴，羅 丹

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院大足醫(yī)院/重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 402360

腔隙性腦梗死屬于缺血性腦梗死的一種亞型，部分呈亞急性或進(jìn)展性。腔隙性腦梗死患者因穿支動(dòng)脈供血區(qū)閉塞、急性壞死而缺血，在大腦半球深部或腦干形成病灶，其特點(diǎn)是易形成圓形或卵圓形、直徑為3～15 mm、充滿液體的腔隙。根據(jù)病變部位不同，腔隙性腦梗死可出現(xiàn)多種并發(fā)癥，如血管性認(rèn)知功能障礙。多數(shù)腔隙性腦梗死患者病情較輕，預(yù)后良好，但仍有部分患者，尤其是老年患者，由于合并多種危險(xiǎn)因素，易在發(fā)病數(shù)小時(shí)至1周內(nèi)發(fā)生神經(jīng)功能進(jìn)一步損傷加重，即發(fā)展為進(jìn)展性腔隙性腦梗死，而國(guó)內(nèi)外尚缺乏有效的治療手段阻止這一疾病進(jìn)展[1]。頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是引起腦梗死的可能原因之一，在狹窄部位下游的血管區(qū)域易引起腔隙性血管病變，而且頸動(dòng)脈硬化對(duì)進(jìn)展性腔隙性腦梗死也有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。JIANG等[2]學(xué)者通過(guò)建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型，發(fā)現(xiàn)miR-24在大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型中表達(dá)降低，且該模型的腦梗死面積百分比和血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平也升高。故本研究通過(guò)分析血清外泌體miR-24水平與老年進(jìn)展性腔隙性腦梗死、頸動(dòng)脈硬化的關(guān)系，為腔隙性腦梗死進(jìn)展機(jī)制和預(yù)防治療提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2018年5月至2020年6月收治的急性腔隙性腦梗死患者120例為研究對(duì)象，其中男75例，女45例；年齡65～89歲，平均(73.40±6.85)歲；根據(jù)病情是否進(jìn)展將患者分為進(jìn)展組32例，非進(jìn)展組88例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次發(fā)??；(2)經(jīng)頭顱MRI彌散加權(quán)序列技術(shù)確診，符合第四屆腦血管學(xué)術(shù)會(huì)議制定的腔隙性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)完善頭顱三維時(shí)間飛躍磁共振血管成像(3D TOF-MRA)和(或)頭顱電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)檢查，證實(shí)有與癥狀、體征相符的出血病灶；(4)發(fā)病至入院時(shí)間≤48 h；(5)患者年齡≥65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心源性梗死、大動(dòng)脈炎引發(fā)的腦梗死或再發(fā)腦梗死；(2)合并腦外傷、腦出血或顱內(nèi)占位性病變；(3)合并感染性疾病、惡性腫瘤或心、肝、腎功能障礙。所有研究對(duì)象均自愿參與本研究，并簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2方法

1.2.1收集基礎(chǔ)資料 收集所有患者的基線資料，包括年齡、性別、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分(入院當(dāng)天及入院后7 d)、腦血管疾病危險(xiǎn)因素(包括吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓史、高脂血癥史)；入院1 d內(nèi)進(jìn)行體格檢查；采用全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(日本希森美康XS-900i型)進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(NEU#)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值(LYM#)等；采用全自動(dòng)生化分析儀(日本日立3100型)檢測(cè)TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、HDL-C和空腹血糖(FBG)。

1.2.2病情進(jìn)展判斷 患者入院后7 d復(fù)查NIHSS評(píng)分相較入院時(shí)增加≥2分，視作病情進(jìn)展。

1.2.3頸動(dòng)脈超聲檢查 所有患者入院時(shí)，使用高分辨率的Philips ie33彩色多普勒超聲儀評(píng)估雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸總動(dòng)脈分叉部(BIF)、頸內(nèi)動(dòng)脈顱外段(ICA)的頸內(nèi)動(dòng)脈中層厚度(IMT)，每組3次，平均IMT取左右兩側(cè)CCA遠(yuǎn)端1 cm處的平均值。以局限性內(nèi)膜增厚≥1.2 mm或≥50%周圍IMT，且局部隆起，向管內(nèi)突出，定義為斑塊形成。根據(jù)超聲檢查結(jié)果顯示的回聲性質(zhì)確定斑塊的穩(wěn)定性：易損斑塊(局部低回聲、等回聲或混合回聲)、穩(wěn)定斑塊(高、強(qiáng)回聲)。根據(jù)Crouse積分法評(píng)估斑塊嚴(yán)重程度，評(píng)分為雙側(cè)頸動(dòng)脈CCA、BIF、ICA部分的近端、遠(yuǎn)端分?jǐn)?shù)總和(0～12分)。

1.2.4血清外泌體提取及鑒定 所有患者入院時(shí)采集清晨空腹外周靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清，在—80 ℃低溫冰箱中儲(chǔ)存待測(cè)。外泌體根據(jù)外泌體分離試劑盒(Invitrogen Life Technologies公司)說(shuō)明書分離，將血清離心(30 min，8 000 r/min)去除細(xì)胞和碎片，然后將獲得的上清液與外泌體分離試劑充分混合，在4 ℃下孵育30 min，再在室溫下離心(10 min，10 000 r/min)去除上清液，試管底部的外泌體用磷酸鹽緩沖液重懸。將提取的血清外泌體置于透射電子顯微鏡下觀察。采用Western blot法檢測(cè)CD61、CD9、TSG101、CYC1和GRP94蛋白表達(dá)情況。方法如下：利用RIPA蛋白酶裂解液(上海聯(lián)邁生物科技有限公司)提取外泌體總蛋白，使用二喹啉甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量蛋白水平，取蛋白30 μg進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(8%)分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。應(yīng)用含5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液室溫封閉1 h后，加入CD61(1∶1 000)、CD9(1∶1 000)、TSG101(1∶1 500)、CYC1(1∶1 000)和GRP94(1∶2 000)一級(jí)抗體(英國(guó)Abcam公司)，4 ℃孵育過(guò)夜，然后用TBST沖洗3次，每次10 min。再加入二級(jí)抗體抗孵育1 h，用TBST沖洗3次，每次10 min。利用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)分析蛋白電泳條帶的灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)量，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。所有試驗(yàn)均重復(fù) 3 次，取平均值。

1.2.5血清外泌體miR-24水平檢測(cè) 將外泌體標(biāo)本與TRIzol試劑(賽默飛世爾科技公司)混合，裂解提取總RNA。采用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)RNA標(biāo)本的完整性和水平。用PrimeScriptTMRT試劑盒(大連Takara Biotechnology公司)和5 μL RNA標(biāo)本配制15 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min。將獲得的cDNA標(biāo)本儲(chǔ)存在—20 ℃低溫冰箱中。miR-24引物片段擴(kuò)增使用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒(大連Takara Biotechnology公司)，選擇小分子U6作為內(nèi)源性參考基因。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)熱循環(huán)。所有反應(yīng)均平行進(jìn)行3次，取均值表示。測(cè)定Ct值，以2—ΔΔCt法計(jì)算結(jié)果，用參考基因U6 mRNA作為血清表達(dá)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化控制。miR-24引物序列：正向5′-TGTTCCTGCTGAACTGAGCC-3′，反向5′-CTCTGCCTCCCGTGCCTA-3′；U6 mRNA引物序列：正向5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向5′-CAGGGCCATGCTAATCTT-3′。

2 結(jié) 果

2.1非進(jìn)展組和進(jìn)展組基線資料比較 非進(jìn)展組與和進(jìn)展組的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、危險(xiǎn)因素(吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓史、高脂血癥史)、入院時(shí)NIHSS評(píng)分、PLT、LYM#、TG、HDL-C等指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)展組WBC、NEU#、TC、LDL-C、FBG水平均明顯高于非進(jìn)展組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者基線資料比較

組別n血常規(guī)檢查(x±s,×109/L)WBCPLTNEU#LYM#實(shí)驗(yàn)室檢查(x±s,mmol/L)TCTGHDL-CLDL-CFBG進(jìn)展組327.95±1.13207.53±33.105.52±0.891.55±0.375.07±1.451.47±0.351.19±0.223.22±1.128.33±3.17非進(jìn)展組887.18±1.04198.94±24.565.10±0.741.67±0.404.48±1.031.41±0.321.10±0.272.68±0.957.14±2.43χ2/t3.5041.5372.6011.4822.4740.8861.6912.6232.180P0.0010.1270.0100.1410.0150.3780.0940.0100.031

2.2血清外泌體提取及鑒定結(jié)果 將提取的血清外泌體置于透射電子顯微鏡下觀察，典型的顯微照片顯示囊泡呈圓形或橢圓形，直徑為30～150 nm，見圖1。經(jīng)Western blot法檢測(cè)，在分離出的外泌體顆粒標(biāo)本中出現(xiàn)外泌體蛋白標(biāo)記CD61、CD9、TSG101蛋白特異性條帶，而在外泌體缺失的上清液中沒有特異性條帶；此外，CYC1和GRP94蛋白呈陰性表達(dá)。見圖2。

圖1 血清外泌體透射電鏡下觀察囊泡形態(tài)(×12 000)

圖2 外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)情況

2.3非進(jìn)展組和進(jìn)展組血清外泌體miR-24水平比較 入院時(shí)非進(jìn)展組和進(jìn)展組血清外泌體miR-24水平分別為1.00±0.09和0.76±0.21，進(jìn)展組血清外泌體miR-24水平明顯低于非進(jìn)展組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4進(jìn)展性腔隙性腦梗死發(fā)生的影響因素分析 以進(jìn)展性腔隙性腦梗死(進(jìn)展=1，未發(fā)生進(jìn)展=0)作為因變量，將WBC、NEU#、TC、LDL-C、FBG、血清外泌體miR-24作為自變量，對(duì)進(jìn)展性腔隙性腦梗死的影響因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血清外泌體miR-24降低，NEU#和LDL-C水平升高是急性腔隙性腦梗死患者發(fā)生進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析進(jìn)展性腔隙性腦梗死的影響因素

2.5入院時(shí)血清外泌體miR-24水平對(duì)進(jìn)展性腔隙性腦梗死的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，入院時(shí)血清外泌體miR-24預(yù)測(cè)進(jìn)展性腔隙性腦梗死的AUC為0.793(95%CI：0.650～0.861)，cut-off值為0.805，在該閾值下，特異度和靈敏度分別為92.5%和58.6%。見圖3。

圖3 血清外泌體miR-24預(yù)測(cè)進(jìn)展性腔隙性腦梗死的ROC曲線

2.6兩組頸動(dòng)脈斑塊檢出情況、IMT、Crouse積分比較 進(jìn)展組和非進(jìn)展組患者分別檢出65塊和123塊頸動(dòng)脈斑塊，進(jìn)展組斑塊檢出率高于非進(jìn)展組，且易損斑塊檢出率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；另外,進(jìn)展組Crouse積分高于非進(jìn)展組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組頸動(dòng)脈斑塊檢出情況、IMT、Crouse積分比較

2.7血清外泌體miR-24水平與頸動(dòng)脈斑塊Crouse積分的關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)分析，miR-24水平與頸動(dòng)脈斑塊Crouse積分呈負(fù)相關(guān)(r=—0.793，P<0.001)。見圖4。

圖4 血清外泌體miR-24水平與頸動(dòng)脈斑塊Crouse積分的相關(guān)性

3 討 論

本研究分析了急性腔隙性腦梗死患者血清外泌體中miR-24水平與疾病進(jìn)展之間的關(guān)系，結(jié)果表明發(fā)生腔隙性腦梗死且癥狀出現(xiàn)7 d內(nèi)發(fā)生疾病進(jìn)展的患者入院時(shí)血清外泌體miR-24水平低于未發(fā)生進(jìn)展的腔隙性腦梗死患者，經(jīng)多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)miR-24水平降低是進(jìn)展性腔隙性腦梗死發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明miR-24可能與急性腔隙性腦梗死的疾病進(jìn)展有關(guān)。既往研究證實(shí)，頸動(dòng)脈硬化和斑塊形成是急性腦梗死疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但是單純的頸動(dòng)脈彩超檢測(cè)往往不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腔隙性腦梗死的進(jìn)展，并發(fā)現(xiàn)檢測(cè)急性腔隙性腦梗死患者入院時(shí)血清外泌體miR-24水平對(duì)腔隙性腦梗死患者的病情進(jìn)展有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，且外泌體中的miRNA可有效避免被血清中的RNA酶降解，因此，檢測(cè)血清外泌體中的miR-24水平預(yù)測(cè)進(jìn)展性腔隙性腦梗死更加準(zhǔn)確[1-2]。

在我國(guó)，腦梗死具有很高的發(fā)病率、病死率和致殘率，且目前尚缺乏十分有效的治療手段和控制神經(jīng)功能惡化的有效措施。因此，明確與腦梗死發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)的危險(xiǎn)因素具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是腦梗死最重要的病理性基礎(chǔ)[3-4]。LORENZ 等[5]的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，頸動(dòng)脈IMT可以獨(dú)立預(yù)測(cè)未來(lái)的腦血管事件。因此，頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及引起的頸動(dòng)脈狹窄已被廣泛用作預(yù)測(cè)腦梗死疾病發(fā)生的指標(biāo)，并且也是疾病治療中控制的關(guān)鍵因素。除此以外，頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊與腦梗死神經(jīng)功能惡化的相關(guān)性及其臨床意義也逐漸被證實(shí)。神經(jīng)系統(tǒng)惡化是急性腔隙性腦梗死患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[6]。多種因素被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致急性腔隙性腦梗死神經(jīng)系統(tǒng)惡化，包括大血管閉塞、頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、斑塊易損性、出血轉(zhuǎn)化、顱內(nèi)壓升高、感染等。潘維花等[7]證實(shí)，24 h收縮壓標(biāo)準(zhǔn)差、頸動(dòng)脈硬化Crouse積分與腦梗死密切相關(guān)，是腔隙性腦梗死發(fā)生、進(jìn)展的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)。作為一種廉價(jià)、無(wú)創(chuàng)、非電離的成像技術(shù)，頸動(dòng)脈超聲檢查斑塊是目前唯一能實(shí)時(shí)觀察動(dòng)脈壁形態(tài)、血流動(dòng)力學(xué)和彈性特征的成像方法，但是對(duì)于無(wú)急性癥狀發(fā)作的腔隙性腦梗死患者或疾病進(jìn)展評(píng)估，其靈敏度和臨床應(yīng)用范圍有限。

本研究通過(guò)多因素Logistic回歸分析證實(shí)，miR-24水平降低是腔隙性腦梗死發(fā)生疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且ROC曲線分析結(jié)果顯示，檢測(cè)血清外泌體miR-24水平對(duì)于預(yù)測(cè)進(jìn)展性腔隙性腦梗死的發(fā)生具有較高的靈敏度。miR-24在眼、腎、腦、心、肺等多種組織中均有表達(dá)，特別是在血管組織中。有研究表明，miR-24可以通過(guò)抑制Importin-α3表達(dá)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡及炎性反應(yīng)來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化[8-12]。方丹等[13]證實(shí)在不穩(wěn)定性動(dòng)脈斑塊中存在高水平的YKL-40及低水平的miR-24。目前，進(jìn)展性腔隙性腦梗死的可能發(fā)病機(jī)制有穿支血管動(dòng)脈硬化性疾病、血流動(dòng)力學(xué)變化、興奮性氨基酸毒性和炎性反應(yīng)等，此外，大血管病變也極有可能引起動(dòng)脈-動(dòng)脈栓塞或穿支動(dòng)脈入口被斑塊阻塞，從而引發(fā)腔隙性腦梗死。OHIRA等[14]和靳宗偉等[15]均通過(guò)研究證實(shí)CCA-IMT、Crouse積分升高與缺血性腦梗死的相關(guān)性相較于其他型腦梗死更大，尤其與腔隙性腦梗死關(guān)系密切。本研究中患者入院時(shí)進(jìn)展組斑塊檢出率高于非進(jìn)展組，且易損斑塊檢出率更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；另外，進(jìn)展組Crouse積分明顯高于非進(jìn)展組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明頸動(dòng)脈斑塊硬化程度越嚴(yán)重，腔隙性腦梗死患者發(fā)生疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)越高。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-24水平與頸動(dòng)脈斑塊Crouse積分呈負(fù)相關(guān)，提示miR-24與頸動(dòng)脈斑塊的形成機(jī)制有關(guān)，檢測(cè)miR-24水平可反映頸動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度。

綜上所述，miR-24水平可以反映腔隙性腦梗死患者頸動(dòng)脈斑塊硬化嚴(yán)重程度，而且其降低是急性腔隙性腦梗死發(fā)生疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，檢測(cè)血清外泌體miR-24水平對(duì)預(yù)測(cè)老年進(jìn)展性腔隙性腦梗死的發(fā)生具有較高的價(jià)值。